用于器官冷藏和灌注的組合物的制作方法

專利名稱：：用于器官冷藏和灌注的組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥領域，特別涉及實體器官和組織的移植。本發明提供了一種用于在低溫下保存來自人和動物的供體器官和組織(特別是肝和腎)的新型灌注溶液和方法。
背景技術：
：器官移植當前被廣泛應用于多種器官，例如心臟、肺、胰、腸(結腸)，特別是應用于腎和肝。對器官需求量的增長和供體器官的短缺使得等待移植的名單越來越長，由此也引起了人們對于使用亞最適供體來源器官的興趣。對供體器官活力的保存是移植過程中一個重要的方面。從尸體獲得的待移植器官必須被儲存并且在醫院和/或移植中心之間運輸。還需要時間來檢測供體和受體的組織相容性，以及對受移植患者進行準備工作。在從供體取得和移植到受體的過程中，器官需要特殊的方法保存。器官和組織在體外保存時間的長度有所不同，這依賴于器官種類、供體的年齡和健康狀況、保存方法、保存溶液和溫度。目前，保存大多數供體器官的標準臨床方法是低體溫缺血保存法。將器官用冷藏液灌洗后從尸體供體上采集得到。因此器官是無血的，血液被保存液所取代，優選的是模仿生理條件的保存液。為了替代所述器官的血和氧的支持，也為了將所述器官保存在最適條件下，有時會對器官，如腎，實施低體溫保存液的機械灌注(W002/41696，US5,599,659和US5，843，024)。機械灌注使得可以提供保持器官活力的化合物和氧，也可以去除廢物和有毒化合物，如代謝產物。已經表明機械灌注優于靜態保存，雖然機械灌注有一些可能的缺點，比如需要特殊的設備和經過訓練的人員，此外還需要用到M液。在低體溫、靜態條件下用于供體器官保存的最常用溶液有特別適于肝和腎保存的威斯康星大學溶液(UV)(Janssenetal，TransplantInternational2003，vol16，no7，p515-522)、用于心臟保存的Celsior以及用于肺保存的Euro-Collins或Perfadex。用于機械灌注時，已經將它們改為例如UW-葡萄糖酸(BelzerMPS)。本發明提供了一種適用于機械灌注的新的器官保存溶液，用于保持器官、器官的部分以及組織的活力。該溶液被設計為可以克服供體器官(特別是來自亞最適供體的器官，特別是來自非心跳供體的器官)的低體溫機械灌注所帶來的多種問題。該溶液可防止或盡量減小由缺血、缺氧、能量和營養耗竭、酸化、低體溫和再灌注損傷所導致的副作用，對于用于移植目的的器官，特別是來自亞最適供體的器官，都會遇到上述的副作用。本發明的保存溶^t氨基酸、維生素、抗氧劑、高分子量添加劑提高沐"變并優化它們的平衡，以及提高緩沖能力，從而優于當前常用的保存溶液，特別適用于保存和灌注來自亞最適供體的器官。另夕卜，本發明的保存溶液具有最適的物理和化學性質，并且采用了容易獲得的、價格低廉的、經過藥理學測試可接受的化合物，降低了制備成本，并且有助于本發明溶液的臨床準入。具體實施方式定義正常體溫是在正常的生理環境下，機體、器官和/或組織的溫度，對于人類，這個溫度大致在341C到421C之間，優選大約371C。低體溫低于生理溫度，即低于34匸。對于器官保存來說，0~201C，特別是0~10"，被i人為是低體溫。缺血是向肢體、器官或組織的氧供應不足，這通常是由動脈阻塞從而阻斷血流所引起，但也會在將器官從供體中取出后發生，從而導致氧分壓降低等等，即p(M氐于生理上可忍耐的水平，這將導致器官或肢體的組織的損傷。灌注通過或圍繞器官、器官的一部分或者組織的恒定或者脈動的血流或者本發明范圍內的代替血液的人工器官保存和灌注液,優選通過脈管系統進行。亞最適供體和從亞最適供體獲得的器官從亞最適條件的供體，如非心跳供體、脂肪變性肝供體或者年老的供體獲得的器官。在非心跳供體中，心臟不可逆地停止最少IO分鐘時間(在正常體溫下)，并由醫師據此確認死亡。脂肪變性肝是包括30%以上脂肪變性肝細胞(即在肝細胞中積累脂肪酸)的肝臟(在所有潛在的供體中發生30%)。年齡超過60歲的供體被認為是年老的供體，但該年齡限度可延伸至甚至70歲或者更高的年齡。本申請中，"器官、組織及其部分"這一表述包括目前或將來可移植的、哺乳動物機體的所有部分。本說明書中，某些參數如滲量、溫度、膨脹壓等的"生理濃度"或者"生理值"是指與哺乳動物在健康狀態下的生理環境中，該哺乳動物機體中該參數的生理值相仿的濃度。滲量是一種溶液通過理想半透膜(允許水自由通過而完全阻止溶質運動的膜)相對于純水所施加的滲透壓的量度。滲量與溶液中顆粒的數量有關，而與顆粒的性質無關。膨脹壓在血漿中，溶解的化合物產生膨脹壓。總滲透壓中的一小部分是由大的蛋白質分子的存在而引起；這就M體滲透壓，或者稱為膨脹壓。因為大的血漿蛋白質不能容易地穿過毛細血管壁，所以它們對毛細血管內部的滲透壓的影響將會在某種程度上抵消掉流體漏出毛細血管的傾向。在血漿蛋白質減少的愔況下，例如由于損失于尿中(蛋白尿)或者由于營養不良，或者為移植之用M體中取出并保存于流體中的器官的情況下，低膨脹壓可導致水腫一一組織中積累過多的流體。膨脹壓以mmHg(亳米汞柱壓強)表示。因為水可透過毛細血管壁，但較大的血漿蛋白質基本上無法透過，所以這些分子可產生滲透壓。而且，因為這些蛋白質帶負電，所以它們易于留住血漿其他的正離子(Gibbs-Donnan效應)，這進一步增加了血漿和間質液(ISF)之間的滲透壓梯度。這些效應(滲透壓效應和Gibbs-Donnan效應)的結合產生一種使水從間質流向血漿的壓力。該壓力被定義為膠體膨脹壓(常簡稱為膨脹壓)。該壓力與血漿和ISF之間的蛋白質濃度差成正比。與純鹽水相比，人血漿產生約28mmHg的膨脹壓，而ISF只有約3咖Hg。因此凈膨脹壓約25咖Hg。在多數毛細血管床的長度方向上，該值大致保持恒定。在本文中，緩沖液被定義為"一種物質，它存在于溶液中時可增加為引起pH的單位改變而必須添加的酸或堿的量，"。因此，緩沖液是器官保存和灌注溶液中的非常重要的組分，因為它可以維持氫離子在生理范圍內的恒定濃度。通過緩沖體系，哺乳動物血液的pH保持在7.38左右，所述緩沖體系例如H2P04-"O^HPO/"，CQ2<=>H2C03,以及多種有機酸、有機堿和蛋白質。本發明的溶液中普適的、生物學上可接受的緩沖液必須具有下列屬性水溶性，不干擾生物過程并且沒有已知的與金屬離子形成復合物的傾向，無毒并且不干擾生物膜(例如穿透、溶解、吸附于膜表面)。緩沖容量受溫度以及組合物中其他溶質的影響。根據如下反應式，活性和鹽效應對溶液的pH值產生顯著影響pH=pKa，+1og[B]/[BH](1)其中，pKa，=pKa+校正因子溶液的離子強度定義為I=1/2￡(d.z2)其中，Ci為種類i的濃度，z為相應的電荷。它可由實驗^lt非常容易地計算得出。緩沖容量為強堿或強酸的增量與pH改變的比值。B=AB/厶pH=加入緩沖溶液中的每升強堿(或酸)的克當量的微小增量與pH的改變ApH之間的比值。5=(2,3xCxKa[If])/(Ka+[Br])25-2.3Ca(l-a)C=[酸]+[鹽]或者C=[堿]+[鹽]單價種類的最大緩沖容量P-max在pH=pKa，，即實際pK值時出現。根據下式，可計算pH在3~11范圍內的p-max:P-max=0.576c其中c為緩沖物質的總濃度。因此，可用的緩沖容量在pKa士l單位的pH范圍內。如果必須實現大于最大緩沖容量的50%,那么相應的范圍僅為pKa，士0.75單位。溶液的緩沖容量也可以Slykes單位表示。以slykes量度的緩沖容量被定義為滴定1克濕重肌肉/組織將其pH改變1pH單位(即pH為6到7的范圍)所需堿的毫摩爾數(VanSlyke，.Biol.Chem.52，525-570,1922)。在本申請中，P被定義為改變l克組織的pH—個單位，即從6到7或者從6.5到7.5，所需要的氫氧化鈉或者氯化氫的微摩爾數。組織培養基包括流體，所述流體可維持體外培養的哺乳動物細胞的生長和保存，它包括生物學上可接受的緩沖液、鹽、營養物如碳源、氨基酸、養分、維生素，以模擬機體中關于pH、滲量和膨脹壓的生理條件。本領用的培養基的不完全列舉最小必需培養基Eagle(MEM)、Dulbecco政良Eagle培養基(DMEM)、RPMI1640培養基、DMEM/F-12培養基、HamsF-IO、HamsF12、Iscove改良Dulbecco培養基、LeibovitzL-15培養基和帶有Earle鹽的最小必需培養基，以及WilliamsE培養基。實施方案在第一個實施方案中，本發明提供一種基于組織培養基的器官保存和灌注溶液，它非常平衡地向器官提供足量的維生素和營養物質。許多組織培養基在本領域中已知、已有詳盡記載并可從多個提供商購得。最小必需培養基Eagle(MEM)、Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)、RPMI1640培養基、DMEM/F-12培養基、HamsF-10、HamsF12、Iscove改良Dulbecco培養基、LeibovitzL-15培養基和帶有Earle鹽的最小必需培養基，以及WilliamsE培養基(CurrentProtocolsincellbiology,www.interscience.wiley.com)可用作本發明的器官保存溶液的基礎，但本領域已知的其他細胞或組織培養基也可使用。特別地，WilliamsE對于本發明的器官保存和灌注溶液來說是非常適合并優選的。組織培養基包括生理條件的鹽和緩沖化合物，保持滲量和pH于生理條件，即大約300-350mOsmol和pH范圍為7.O到7.8。在大多數確定成分和不確定成分的組織培養基中還提供營養物(糖、維生素、氛基酸)。本發明人發現，為了使用作器官保存溶液的組織培養基最優化，以同時適于在低溫下保存和灌注器官，應該對該溶液進行一些調整和添加一些成分。已經證明，這些調整對于從一般情況下非優選的、亞最適供體獲得的器官的保存和灌注來說特別有用。本發明的器官保存和灌注溶液針對低于生理溫度的條件優化，并優選用于〗氐于生理溫度的條件，所述低于生理溫度的條件為從大約o'c到大約20€,優選在41C到IOIC之間。在較低溫度下保存的器官對氧和營養物的需求減少，例如18X:時的代謝僅為大約37'C的生理溫度時的代謝速率的10到15%。然而，本發明人發現，即使代謝活性較低時，營養物如葡萄糖、#^酸和維生素等仍然被消耗，應該足量提供。本發明人發現，即使在低溫下和在體外人工培養基(如本發明的保存和灌注溶液)中的減弱的灌注或流動條件下，提高^J^酸和其他營養物的劑量/濃度可幫助細胞充分吸收。已經證明，提高氨基酸和維生素的濃度對于從非心跳供體獲得的器官的保存來說特別有用。在一個優選的實施方案中，在WilliamsE培養基中，使下組氨基酸的濃度高于標準氨基酸濃度精氨酸、天冬酰胺、胱氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸。高度優化的本發明溶液的非限制實例在對比例1中給出。本發明的器官保存和灌注溶液還具有[Na+]和[K+]濃度的特定的、優化的平衡。在正常的生理環境中，細胞內[K+]濃度顯著高于細胞內[Na+]濃度，而在間質腔(interstitiallumen)中情況剛好相反。本發明的器官保存和灌注溶液被配制成模擬細胞外的生理濃度，以便幫助器官、組織和細胞保持[Na+]/IT]的生理平衡，該平衡為驅動鈉泵進行離子轉運等過程所必需。細胞內外[Na+]和[K+]濃度的不平衡導致在質膜兩側形成了電梯度和化學梯度。這不僅對于細胞至關重要，在許多情況下，這對于跨上皮細胞層的流體和電解質的定向運動也是必不可少的。Na+-1T-ATP酶是一種高度保守的整合膜蛋白(integralmembraneprotein),它在高等生物的幾乎所有細胞中表達。它為幾種幫助運載體(facilitatedtransporter)提供驅動力，這些運載體可將葡萄糖、M酸和其他營養物栽入細胞中。本發明人進行的實驗證實，這種轉運對于低溫保存和灌注器官，特別是從非心跳供體獲得的器官來說是至關重要的。將鈉從上皮的一側轉運到另一側可形成滲透梯度，該梯度又驅動水分的吸收，這種現象的重要實例可見于水分吸收，例如從小腸的內腔中以4腎中。因此，重要的是，本發明的組合物模擬的細胞外[Na+]/[K+]生理平衡至少為2:1、更優選為3:1、最優選為5:1。本發明的器官保存和灌注溶液中極為優選的添加劑是高分子量化合物，以提供所需的膨脹壓。可有利地用于器官保存和灌注溶液的幾種高分子量添加劑在本領域中已知，例如聚乙二醇(PEG)及其改性物(US4，938，961和US5，599，659)、葡聚糖、血清蛋白如清蛋白、羥乙基淀粉(HES)以及其他高分子糖和在pH中性的溶液中帶凈負電荷的生物相容的聚合物。因為大的血漿蛋白質不能容易地穿過毛細血管壁，所以它們對毛細血管內部的滲透壓的影響將會在某種程度上抵消掉流體漏出毛細血管的傾向。在血漿蛋白質減少的情況下，例如為移植之用從機體中取出并保存于保存流體中的器官的情況下，過4氐的膨脹壓可導致水腫一一組織中積累過多的流體。這個問題需要解決，特別是對于常處于較差狀態的從非心跳M獲得的器官。因此，加入帶負電荷的高分子量分子，以維持生理膨脹壓，所述膨脹壓以咖Hg(亳米汞柱壓強)表示。優選地，本發明的器官保存和灌注溶液產生20到30咖Hg的膨脹壓，優選大約生理水平，接近25咖Hg。在一個優選的實施方案中，將PEG用作本發明的器官保存溶液的高分子量添加劑。在一個最優選的實施方案中，使用分子量為25，000到50，OOO道爾頓的PEG，優選的濃度范圍為10到50克/升，最優選在20到35克/升之間。然而，其他高分子量化合物如服S、清蛋白和葡聚糖也可有利地用于產生膨脹壓，任選地與PEG結合^^用。控制pH以及防止細胞內pH升高是器官保存和灌注溶液的關鍵性質。缺血、缺氧、能量耗竭和低體溫是已知導致pH水平下降的因素，并可導致待移植細胞、組織和器官的酸化。酸化是普遍認識到的對細胞和組織的危害，它會很快地使待移植的器官的狀態惡化(BaicuandTaylor,2002Cryobiology45p.33-48)。特別是對于從非心跳供體獲得的器官，酸化更是需要解決的問題，因為這些供體已經經歷了缺血、缺氧和營養耗竭。本發明的保存溶液為解決和克服這些問題進行了優化。為了防止M在低溫下并且沒有或者有較少人工灌注的器官酸化，提供額外的緩沖容量是本發明的器官保存和灌注溶液的另一關鍵特征。盡管組織培養基具有針對大約371C的生理溫度、pH7.0到7.8之間(優選地pH約7.4)的生理pH優化的生物學上可接受的緩沖液，但是出于上述原因，仍需額外的緩沖容量。本發明所提供的用于低溫(OIC到20C之間)的器官保存和灌注溶液，其緩沖系統的最小容量(P)為至少20，更優選25、30、35、40、50、100到250,最優選至少30到35,以上均以Slykes單位(Slykes單位-(每改變一個pH單位，所加入的酸的毫摩爾數))度量。以slykes表示的緩沖容量(0)被定義為為使l克肌肉或組織的pH改變1pH單位(即pH為7到6的范圍)所需強酸的毫摩爾數(由VanSlyke定義，JBC，1922)。強酸可為HCL，將pH從6改變為7的強堿，可4吏用NaOH。具有合適的pKa范圍、可有利地用于本發明的溶液中的生物學上和生理學上可接受的緩沖液選自HEPES、PIPES、MOPS、TES、BES、N，N-二(羥乙基)甘氨酸(Bicine)、三(羥曱基)甲基甘氨酸(Tricine)、Tris、檸檬酸鹽、組氨酸、KH2P04、K2HP04、NaHC03和其他磷酸鹽-、杼檬酸鹽-和碳酸鹽-緩沖液，這些本領域中均為已知并4皮詳盡記載(CurrentProtocols,WileyInterscience，2004)。HEPES是本發明的溶液中最優選的緩沖液，可提供所需的(額外的)緩沖容量，優選的濃度在1000-10000mg/L之間，最優選在2500和7500mg/L之間。器官保存液的pH值可使用Mg(0H)2、NaOH、K0H、Ca(0H)2或其組合調節至室溫下7到8之間的最終pH值，優選大約7.5。不管是用于器官保存和/或灌注之前還是在其期間，都極其優選使用含氧氣體混合物來使器官保存溶液發生氧合。優選使用具有高含量氧甚至純氧的氣體混合物，以便進一步有助于防止在M或灌注的器官中，器官保存溶液被C02和其他酸化源酸化。本發明的器官保存和灌注溶液的滲量優選在300到400mOsm之間，更優選在320到350mOsm的生理范圍，最優選大約340mOsm。在本發明的另一個優選的實施方案中，向器官保存和灌注溶液中另外加入非透膜體(impermeant)。非透膜體是較高分子量的物質，它們不能穿過膜或者只能以很低的速率穿過膜，將它們加入后可提高滲量，而不顯著改變溶液的電解質組成(例如加入鹽就會改變溶液的電解質組成)。本發明的溶液中可用的非透膜體選自棉子糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、木糖醇、乳糖酸鹽(lactobionate)和葡糖酸(結合有鎂、鉀或鈉)。在一個優選的實施方案中，將棉子糖和海藻糖用作非透膜體，優選的濃度范圍為海藻糖和棉子糖分別為1000到5000mg/L，最優選在1200和2500mg/L之間。使用的葡糖酸的濃度優選在1000到5000mg/L的范圍，最優選在1200和2500mg/L之間。在本發明另一個優選的實施方案中，器官保存和灌注溶液含有能夠抑制或防止氧化應激后果，特別是氧以及其他自由基活性的化合物。器官的再灌注損傷從缺血過程中的生化事件開始，導致形成氧自由基。再灌注損傷通常對于所有移植器官都是一個問題，尤其對于已經因為缺血、缺氧和營養耗竭而出現損傷的、從非心跳供體獲得的器官來說，更是一個嚴重的問題。細胞中正常產生的自由基由以下物質除去清除劑，即能夠中和自由基的化合物；以及酶，例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、生育酚。優選加入本發明的溶液中的限制氧化應激的化合物包括但不限于次黃嘌呤、谷胱甘肽、別嘌呤醇、trolox、維生素E、亞甲藍、抗壞血酸。本發明的溶液中優選使用谷胱甘肽、維生素E和抗壞血酸，濃度范圍分別優選為谷胱甘肽0.7-1.8g/1，維生素E0.00001-0.001，抗壞血酸0.01-0.1g/1。硒是主要與作為抗氧劑的酶有關的重要元素。三種含硒酶是抗氧劑過氧化物酶，第四種含竭酶涉及甲狀腺激素的產生。硒與維生素E—起，有助于產生抗體，保持心臟健康。它還有助于維持胰、肝和腎的功能，為組織提供彈性，并幫助細胞免受氧化損傷。維生素E是一種重要的脂溶性維生素。它作為抗氧劑，保護細胞膜、脂蛋白、脂肪和維生素A免受氧化破壞。它還可保護紅細胞，對于神經和肌肉的正常功能也非常重要。硒是與維生素E密切合作的重要無機物。在本發明的器官保存和灌注溶液的一個優選的實施方案中，提供了硒源，以提供額外保護，免受氧化應激和再灌注損傷。已經證實，這對于從非心跳供體獲得的器官以及經歷缺血和缺氧的器官來說特別有利。毒性是硒比大多數營養物都嚴重的問題，硒的濃度要小心調節至從0.00001到0.001g/1的范圍，優選從0.00003到0.0001g/1。有機和無機形式的硒可能有不同的性質。有機形式包括硒蛋氨酸、硒代半胱氨酸、M酸螯合物，并且可摻入本發明的溶液中。無機形式包括亞硒酸鈉和硒酸鈉，是本發明的器官保存和灌注溶液的優選的硒源。在本發明的另一方面，提供了一種*、沖洗和/或灌注器官的方法，包括使用本文公開的保存和灌注溶液在缺少血液供應的條件下保存細胞、組織和器官，防止或盡量避免在保存過程中的器官、活組織和活細胞的損傷。該溶液適用于所有可移植的哺乳動物器官，包括心臟、肺、胰和腸。在一個最優選的實施方案中，保存器官的方法涉及冷灌注和M腎和肝器官。本發明的溶液可用于從心跳供體獲得的器官的移植過程，特別適用于從亞最適供體獲得的器官的移植過程。優選地，保存溶液和待保存的器官置于(TC到20。C的溫度范圍，最優選在2n和IO"C之間。該溶液優選用于對器官的連續灌注或脈動灌注，最優選通過機械灌注。優選通過器官的脈管系統對器官進行灌注，使用器官移植(特別是人肝和腎移植)領域的技術人員公知的方法和設備。本發明的器官保存方法以及冷藏和灌注溶液的其他優點是采用了容易獲得的、價格低廉的、經過藥理學測試可接受的化合物，降低了制備成本，并且有助于本發明溶液的臨床準入及其臨床應用。圖1:用于24小時MP以及60分鐘再灌注的雙重灌注系統。該系統包括一個貯液器，通過滾子泵將灌注溶液從貯液器泵入玻璃充氧器。氧合并除去氣栓后，在熱交換器中將溶液冷卻或加熱。經過流量探頭之后，溶液通過門靜脈導管灌注肝臟，通過腔靜脈自由流出，ii^灌注液貯液器。在i^v貯液器之前，可提取樣本用于評估肝損傷和功能。圖2:使用KHB在60分鐘的正常體溫再灌注過程中的灌注液ALT水平。在所有時間點，MP的ALT水平都比CS低。使用POLYSOL的MP肝臟中的ALT釋放量，在RP過程中的t=lO-20-30-40-60分鐘時務欣于UW中的CS,使用UW-G的MP肝臟中的ALT釋放量，在RP過程中的t=0-10分鐘時^f氐于UW中的CS。數值(N-5)表示為平均值士SEM。圖3:使用KHB在60分鐘的正常體溫再灌注過程中的灌注液LDH水平。顯示出MP的LDH水平要比CS低。使用POLYSOL進行MP的值，在RP過程中的t-10分鐘時JH氐于UW中的CS。數值(N-5)表示為平均值土SEM。圖4:使用KHB在60分鐘的正常體溫再灌注過程中的灌注液AST水平。在24小時MP之后，AST的釋放量要比UW中的CS低。使用UW-G進行MP之后的AST釋放量，在t=10時顯著低于U￥中的CS。使用POLYSOL進行MP之后的AST水平，在RP過程中的t=40-50-60分鐘時顯著低于使用UW-G進行MP。數值(N=5)表示為平均值±SEM。圖5:使用KHB在60分鐘的正常體溫RP過程中的灌注液oc-GST水平。在使用POLYSOL進行24小時MP之后，ot-GST水平要顯著低于使用UW-G進行MP。數值(N-5)表示為平均值土SEM。圖6:使用KHB在60分鐘的正常體溫再灌注過程中的膽汁產量。使用POLYSOL進行MP之后，膽汁產量高于UW中的CS和使用UW-G進行MP。數值(N=5)表示為平均值±SEM。圖7a、b、c:使用KHB在60分鐘的正常體溫再灌注之后的組織病理學形態a)24小時CS后竇狀空間加寬("O，1-3區形成空泡(Q)，固縮和壞死區域；b)使用UW-G進行24小時MP之后竇狀空間減小(—)，3區形成空泡(〇)，沒有壞死；c)使用P0LYS0L進行24小時MP之后正常的竇狀結構和肝細胞，沒有空泡或者壞死。圖8:再灌注后肝臟活組織檢查樣本的干/濕重比(^5)。CS組的干/濕重比(％)高于MP-UW-G組和MP-Polysol組。數值表示為平均值±SEM。圖9:對大鼠肝臟進行24小時低體溫MP過程中的肝酶釋放量。不管是對于AST還是ALT水平，在使用UW-G進行MP過程中觀察到的損傷都要多于4吏用Polysol。圖10:對大鼠肝臟進行24小時低體溫MP過程中的灌注液流量。在前幾個小時中未觀察到差異，然而在t=20小時時，使用UW-G灌注的肝臟的流量顯著低于使用Polysol灌注的肝臟。圖11:使用Krebs-Henseleit緩沖液對大鼠肝臟進行60分鐘正常體溫再灌注過程中的肝酶釋放量。在MP組中觀察到酶的釋放量顯著減少。當測量AST時，這些差異比測量ALT時更加明顯。在UW-G和Polysol之間未觀察到顯著差異。圖12:對大鼠肝臟進行60分鐘正常體溫再灌注過程中的灌注液流量。MP-UW-G組的流量顯著低于CS-UW組和MP-Polysol組。而且，在t=45和60分鐘時，Polysol組的灌注液流量顯著高于CS組。圖13:再灌注過程中的膽汁產量。使用Polysol進行MP之后，產生的膽汁顯著多于CS和MP-UW-G。CS和MP-UW-G之間的差異不顯著。圖14:再灌注過程中的氨清除率和脲產量。在灌注液中加入5mM氯化銨來攻擊肝臟以測試功能。MP-UW-G之后，氨清除率和脲產量顯著低于Polysol。圖15:再灌注過程中的乳酸鹽產量。圖16:使用Krebs-Henseleit緩沖液進行再灌注后的ATP含量。使用Polysol進行MP之后的ATP量高于CS和MP-UW-G。圖17:肝臟活組織檢查樣本的組織學評分。對H&E染色的切片進行半定量評估，使用Polysol保存的肝臟的平均得分為2.4±0.3。該分數顯著好于使用UW-G的CS和MP。圖18:再灌注后獲取的活組織檢查樣本的干/濕重比。使用Polysol進行MP之后的干/濕重比顯著低于UW中的CS和使用UW-G的MP。實施例對比例1本發明的器官保存和灌注溶液的優選的實施方案的典型實例，與廣泛使用的組織培養勤目比組分無機鹽CaCl2(無水)CuSOa■5fl20Fe(N03)3'9H2OKC1MgS04(無水)MgS04-7H20MnCl2.4H20NaClWilliamsE培養基液體200.000.000.00400.00400.00200，00O，OOOl6800*00液體30.00IOO，OO100.00CL0001液體mg/L22.575*0075.000，000075720.00NaHC03NaH2P04'H20ZnS047fl20KIaOH10NHC1IN2200.00140.000.0002x1400，000.00062,65ml2,55ml其他組分葡萄糖1500.00谷胱甘肽(iE^-型)1500.002000.00亞油酸甲酯酚紅衲800.0310,0025.001.842000.000.050*03IO，OO25.00900,000，0225x18.75x90.0050,0020，<3030.0040.0020.0050.0050*0015*0050*0075，0087.5015』090,00250，0030.0040.0060.0050.0050*00980.0050*0075.0087.5045,00€7,5187.59022,50304537-5037.50735.0037,5056，2533,75L-笨丙氨酸L-脯氨酸L-絲氨酸L-蘇氨酸L—色氨酸L-酪氨酸L-纈氨酸25-0030,00IO，OO40，0010,0035，0050，0050,0090眉300040.00180,0035-0050*0037*5067*5022，5030,00135,002U537.50抗壞血酸d-"生物素D-泛酸鉤氯化純麥角鈣化醇葉酸i-肌g甲〗&，鹽脧歡嗜搭DL-辨酸生育酚鈉核黃素6酸維生素A維生素B122.000.501-001.500.101.002.00()01LOO1.000.010.101.000*100.2020.000.501,001.500.101.0012.000,011.001.000.031.0010*000.100.2015.000,3750.751.1250.0750.759.000，00750.750,750.02250.757,500*0750.15潘*浙MgCl2.6%KH2K)4.H20腺苷腺咪呤別嘌呤醇棉子糖海藻糖,2H20D-葡糖酸鈉D-葡糖酸鉀MacrogolPEG300.05731*881360-90337.0010ml/li0.501340,00680.001S3，202000,0016358*0025000.00<120<25mM<50鵬<340mosmol25mmHg7-4(K0375548.9147",001020.S7252.757*5斑1/10*3751005510.00122*401200.00ISOO，OO12268.503513-0020000.00實施例2本實施例的目的是評估使用P0LYS0L-1(實施例1中描述的本發明的器官保存溶液)對大鼠肝臟進行的機械灌注(MP),并將結果與使用POLYSOL和UW-G(這兩種都與使用UW的金標準冷藏(CS)法相關)的機械灌注結果相比較。為此，保存方法和MP溶液都在從心跳供體獲得的分離的灌注大鼠肝臟模型(IPRL)中評估。材料和方法動參々手,將重350g(+/—50g)的雄性Wistar大鼠(Harlan，TheNetherlands)用作肝臟供體。這些動物在標準化條件下飼養，提供12/12小時黑暗/光照周期，無限制供應水和標準pelletchow食物(HopeFarms,Woerden，TheNetherlands),直到實驗之前。所有的動物處理都才艮據荷蘭法規和動物保護原則進行，并經過阿姆斯特丹大學動物倫理委員會(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批準。將大鼠使用02/空氣/異氟烷(1L/min:1L/min:3%)以及,內注射0.1ml/100g體重的FFM(Hypnorm/Dormicum/aquadest:1:1:2)進行麻醉。手術過程中，通過面罩吸入02/空氣/異氣烷來保持麻醉。中線剖腹并向兩側肋緣下切口之后，移動肝臟，在膽管中插入0.9咖導管(B-Braun,Melsungen，Germany),在將導管插入門靜脈之前，通過腔靜脈以O.lml肝素(5000IU/ml，LeoPharma，Malm6，Denmark)將該動物肝素化。通過門靜脈導管(0.8fr，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard，theNetherlands)以50mlRingerLactate(37XH，10cmH20,Baxter,Utrecht,theNetherlands)洗滌肝臟。在洗滌過程中，通過在腹部的腔靜脈切口而放出動物血液。將0.6fr的導管(Vygon)插入肝上腔靜脈，連接肝下腔靜脈，清理周圍組織后，切下肝臟并稱重。雙重機械灌注系統由MedicalTechnicalDevelopmentDepartmentoftheAcademicMedicalCenter(AMC，Amsterdam,theNetherlands)開發，該系統能夠在一個裝置(圖1)中進行MP和再灌注(RP)階段。在連接切下的肝臟之前，將回路用200ml無菌aquadest液洗滌，然后用50ml保存溶液洗滌。壓控灌注系統包括一個貯液器，貯液器中含有400ml無菌MP溶液。將肝臟與該系統連接之后，收集最早的100ml灌注溶液。剩下的250ml溶液通過滾子泵(Ismatec，Glattbrugg，Switzerland)進行再循環。在玻璃充氧器中，使用卡波金(carbogen,95%02/5%C02，1L/min，HoekloosMedical,TheNetherlands)對灌注溶液進行氧合，使肝前(preh印atic)氧張力大約為700mmHg。在氣泡捕捉器中除去系統中的氣栓，然后使用熱交換器(HMT-200,Heto，Breda，theNetherlands)使溶液冷卻。灌注溶液經過一個線內流量表(HT-207,TransonicSystemsInc，Maastricht,theNetherlands),通過門靜脈導管進入肝臟，再經肝上腔靜脈導管自由流入貯液器中。沿如上所勤目同的回路進行再灌注，但這次使用第二個貯液器，該貯液器含有37'C的400mlKrebs-Henseleit緩沖液(KHB)溶液。在重新連接肝臟前，使用200ml無菌aquadest液和50mlKHB洗滌系統。重新連接肝臟后，放掉最早的100ml以防止它重新進入回路中。剩下的250ml灌注液使用卡波金進行氧合。從緊鄰肝前或肝后的管處獲得樣本。由放置于肝下的探頭(Lam6ris，TheNetherlands)"^錄溫度。每次操作后，洗滌回路并進行蒸汽消毒(134*C,16分鐘)。錄力、妙絲錯本研究包括3個實驗組1)CS-UW(N=5);2)MP-UW-G(N-5)以及3)MP-P0LYS0L(N=5)。分離的肝臟通過CS或MP保存24小時，然后進行再灌注。使用RL(4TC)洗滌后，將肝臟在原位置使用保存溶液沖洗。將CS肝臟使用50mlUW(41C)沖洗，放置于盛有IOOmlUW的無菌杯中，在冷室(41C)中融冰上保存24小時。MP肝臟在洗滌并取出后立即通過門靜脈連接到灌注系統，使用100mlUW-G或POLYSOL沖洗，并在4'C下使用該溶液連續灌注24小時。M階段結束后，所有的肝臟在37X:下^吏用氧合的KHB再灌注60分鐘。絲絲冷藏時，使用威斯康星大學保存溶液(Viaspan，BristolMyersSquibb)。用于MP的冊-G溶液根據Belzer的方法制備(pH7.4，330mosmol/kg)(PienaarBHetal.，Transplantation1990:49:258-260)。MP保存溶液POLYSOL(pH7.4，330mosmol/kg)由AMC的外科實驗室開發。再灌注時，使用不含牛血清清蛋白的Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)(pH7.4，320mosmol/kg)。UW-G、POLYSOL和KHB均在我們的實驗室中制備，制名—吏用的是購自下列廠商的分析試劑級別(或更好的)的化學藥品Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands)，Merck(Haarlem,TheNetherlands)，Cambrex(Verviers，.Belgium),Centrafarm(Etten-Leur，TheNetherlands)和NovoNordisk(AlphenaandenRijn，TheNetherlands)。幾乙基淀粉(HES)購自Fresenius(Taunusstein，Germany),使用前，溶液通過0.45的ampul濾器(DowCorning，Allesley，UnitedKingdom)和0.22jim濾器(Millipack60，Millipore，Amsterdam,theNetherlahds)過濾除菌。^餅勿薦務辦贈在60分鐘的RP過程中，每10分鐘取樣，用于肝細胞損傷的評估。在肝后灌注液樣本中直接分析天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)來評估肝損傷(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands),使用大鼠oc-GSTELISA試劑盒(Biotrin，Dublin,Ireland)來測定a-GST(a-谷胱甘肽-S-轉移酶)水平。在60分鐘的RP過程中，通過監控膽汁的產生來評估肝功能。而且，在再灌注過程中還測定了表明無氧糖酵解的乳酸鹽產量(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands)以及灌注液pH值(ABL，Radiometer,Zoetermeer，TheNetherlands)。逾歡夢#于/濕#^;:在RP階段結束時，M狀葉和右側葉^C得活組織檢查樣本。將活組織檢查樣本保存于甲醛(10%)并包埋于石蠟中。石蠟切片(4pm)使用蘇木精和伊紅(H&E)染色，并用光學顯^t鏡檢查。使用9個等級對肝損傷的形態學進行分類，分為等級l(好)到等級9(差)(MartinH，etal.，Cryobiology2000:41:135-144，以及TojimbaraTetal,，LiverTransplSurg1997:3:39-45)。1.正常矩形結構，2.圓形肝細胞，竇狀空間增大，3.3區形成空泡，4.2區形成空泡，5.1區形成空泡，6.3區形成空泡和核固縮，7.2區形成空泡和核固縮，8.l區形成空泡和核固縮，以及9.壞死。為獲得干/濕重比，肝臟活組織檢查樣本在再灌注后立即稱重，然后保存于60'C溫箱中。將活組織檢查樣本每隔7天再次稱重，直到肝重不再減少。使用下式計算肝水肺的量1-(干重/濕重)x100%。財夢為、浙使用Kruskal卜Wallis檢驗法對三組數據進行總體比較。如果顯示出顯著性差異，則使用非參數MannWhitney檢驗法來評估每個組之間的差異。文中和圖中的結果表示為平均值士SEM。統計學顯著性定義為p<0.05。結果在各實驗組之間，肝重沒有顯著性差異(16.53±0.53克)。在低體溫MP和正常體溫RP過程中，灌注壓保持恒定在20cmH20(重力控制)。低體溫MP過程中灌注流量最大達到1ml/min/克肝臟。正常體溫RP過程中，記錄到的最大流量為4ml/min/克肝臟。低體溫MP過程中的氧合使得灌注液p02大約為700nimHg,在正常體溫RP過程中，由于溫度較高，p02大約為500咖Hg。正常體溫RP過程中記錄到的溫度為37.13±0.41"C。#雄微與使用UW-G的MP相比，使用UW進行CS后，在24小時冷缺血時間之后ALT的釋，放量顯著增高，所述釋放的時間分別是t=0，(4.6±5.37vs0.4±0.55)以及t-10，(5.4±3.85vs1.4±0.55U/L)(圖2)。然而，當CS-UW與MP-POLYSOL相比時，除t-0，和t=50，之外的所有時間點，MPPOLYSOL后ALT水平都顯著降低。24小時CS-UW后LDH水平顯示升高，但不顯著。與使用UW-G或POLYSOL進行MP相比，CS-UW后t=10，時LDH顯著升高(圖3)。灌注液流量、pH和乳酸鹽的產量沒有顯著差異(數據未給出)。當兩種MP溶液進行比較時，24小時MP-POLYSOL后觀察到的損傷較少，這表現為AST水平較低(圖4X盡管在所有時間點，Polysol的趨勢總是比較好，但ALT、LDH、流量、pH和乳酸鹽沒有顯著差異。t=40時，MP-P0LYS0L后a-GST的釋放量(圖5)低于CS-Uf(分別為125.5±10.51和46.35±9.11，p<0.02)和MP-UW-G(分別為101.6士11.99和46.35±9.11，p<0.02)。麟,贈MP-P0LYS0L后膽汁的產量高于MP-UW-G之后或者CS-UW之后(分別為355±82.31和256±26.19和180±61.89m1)。然而，并沒有達到顯著性(圖6)。逸歡夢對肝切片進行組織病理學評分之后，與CS-UW肝臟(4.5士0.87分)相比，使用UW-G和POLYSOL的MP組具有更好的平均得分(分別為2.0±0.55和1,6士0.40分)(對于UW-G，p=0.06;對于POLYSOL，p=0.03)。MP組之間沒有顯著性差異(圖7)。肝切片的干/濕重比在MP.組中最高，^兌明水腫的百分比最低(圖8)。百分比分別為76±1.0和72±0.5和72±0.7。潛論對于腎的臨床MP,通常使用改良的威斯康星大學溶液(UW-葡糖酸鹽)。通過以棉子糖替換甘露醇，該溶液被進一步改良以應用于肝臟的MP。制得的溶液已經廣泛用于實驗肝臟保存(KimJSetal.，TransplantProc1997:29:3452-3454，PienaarBHetal"Transplantation1990:49:258-260,SouthardJHetal.，TransplantProc2000:32:27-28)(卜3)，但不能從市場上購得。根據本發明的用于肝和腎MP的新的保存溶液POLYSOL已經過檢驗，它含有本發明人所認為的支持41C下被抑制的代謝所必需的營養物。雖然我們的最終目標^1保存臨界狀態的器官和非心跳供體的器官(這在實施例3中說明)，但我們首先在完善的心跳供體模型中測試POLYSOL,以獲得基線值。在本實施例中，我們已經在心跳供體大鼠肝臟模型中展示了MP相對于CS的優點。在MP保存的肝臟中，肝細胞損傷顯著減少。這可通過灌注系統的持續氧合和MP過程中持續供應營養物來解釋。而且，以膽汁產量表示的肝臟功能在24小時MP后也有提高。使用P0LYS0L進行MP后導致肝細胞損傷值降低，保存后功能改善(以膽汁產量論)。我們提高了本發明溶液的緩沖容量，優化了氧自由基清除劑含量，并針對氨基酸、能量和脂肪代謝加入了特定的營養物。而且，制備的該溶液pH為7.4，但與氧合的肝臟連接后，pH降為7.2。總之，與冷藏相比，通過機械灌注來保存心跳供體大鼠肝臟可^f吏M肝臟的質量提高。與UW-G相比，使用本發明的新的、成分增加的保存溶液P0LYS0L-1進行機械灌注，可使保存肝臟的質量提高。在本實施例中使用的Polyso卜l如實施例1所定義。Polysol指的是polysol-l。實施例3本實施例的目的是比較通過使用UW進行CS、使用UW-G進行MP以及使用Polysol-l進行MP來保存非心跳供體(NHBD)大鼠肝臟。對于最適供體肝臟，選擇的常規保存方法是冷藏.然而最近的研究表明，通過持續的低體溫機械灌注(MP)進行保存，在保存24小時后可使肝損傷減小，肝功能增強(KimJSetal.，TransplantProc1997;29(8):3452-3454，SouthardJHetal"TransplantProc2000'，32(1):27-28，XuH.etal.,Transplantation2004;77(11):1676—1682)(4-6)。MP的優點在于向供體器官供應營養物和氧，以及能夠在^過程中和植入前進行活力評估。另一個優點是NHBD器官可能復蘇。這些缺血損傷的器官難以用CS保存，導致保存后肝臟損傷，并且肝功能減弱。在實驗條件下，用于肝臟機械灌注的保存溶液是改良的威斯康星大學溶液UW-葡糖酸鹽(UW-G)。(MarshDC,etal.，Cryobiology1989;26(6):524-534，Pie眼rBH，etal.，Transplantation1990;49(2):258-260。)該溶液含有膠體羥乙基淀粉，可導致微循環障礙，并且難以獲得且價格昂貴。UW-G無法向肝臟提供足量的營養物，以維持低溫(如4t:)下減弱的代謝。因此，我們基于膠體聚乙二醇，開發了本發明的新的保存溶液，以用于肝和腎的MP,該溶液含有組織培養基，組織培養基中含有足量必需的營養物以供肝臟在低溫下吸收，該溶液的緩沖容量增大，抗氧化合物增多，以防止再灌注損傷，盡量避免從非心跳供體獲得的器官所經歷的缺血、缺氧、酸化和營養耗竭。表l:UW、UW-G和Polysol中最重要的組分<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>材料和方法參參將重275g(+/-25g)的雄性Wistar大鼠(Harlan,TheNetherlands)用作肝臟供體。這些動物在標準化條件下飼養，提供12/12小時黑暗/光照周期，無限制供應水和標準pellet食物(HopeFarms,Woerden)。所有的動物處理都根據荷蘭法規和動物保護原則進行。阿姆斯特丹大學動物倫理委員會(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批準了該項動物實驗。微為、妙錄絲斧通過使用UW進行CS(n=6)、使用UW-G進行MP(n=6)或者使用Polysol進行MP(n=6),將NHBD肝臟保存24小時。使用RingerLactate在37。C進行體內沖洗后，再使用低體溫保存溶液(4*C)沖洗肝臟肝臟使用50mlUW、UW-G或Polysol沖洗。進行CS時，使肝臟漂浮于盛有100ml低體溫UW的塑料無菌杯中，置于4X:的冷室中的融冰上。進行MP時，將肝臟與裝有250ml保存溶液的再循環標準灌注設備相連接，該設備通過滾子泵從貯液器開始循環，以卡波金(95%02/5%(;02)氧合，由熱交換器將流入溫度降低至4度。流出的灌注液通過腔靜脈收集，再重新i^貯液器。在MP以及再灌注(RP)過程中，提取樣本用于評估肝臟損傷和功能。糸郝濕如實施例2。手對蕃如實施例2。歡械滲,^鍵如實施例2。用于肝細胞損傷和功能評估的灌注液樣本在MP和RP過程中提取。在MP過程中，樣本在t=0，1,2，22，23,24小時時每小時提取一次。在RP階段，在60分鐘的時間內每隔15分鐘提取樣本。在再灌注階段結束時，使用冷凍鉗(freezeclamp)從肝副葉提取用于ATP評估的肝臟樣本，以便立即冷凍。還從肝尾葉和肝右葉取得肝臟樣本，并在福爾馬林(10%，溶于PBS)中處理。用于透射電子顯微鏡檢查的肝臟樣本從中葉獲得，并保存于MacDowall溶液中。最后，從左葉提取肝臟樣本用于干/濕重分析。賴郝辦海雜鄉如實施例2。源傻肝臟損傷通過對天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)進行分光光度分析來評估。在MP和RP過程中測量灌注液流量以反映血管的完整性。《教肝臟功能通過(在RP階段)測量膽汁產量、氧消耗量、氨清除率、脲產量和ATP再生來評估。氧消耗量通過肝前和肝后的血氣樣本中氧張力差來測定(ABL，Radiometer,Zoetermeer，TheNetherlands)。為了觀4定膽汁產量，每隔15分鐘通過膽管導管來收集膽汁。為了測定氨清除率和脲產量，向肝臟施加5mM氯化銨(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht，TheNetherlands)。在RP過程中的t--5，0，15，30，45和60分鐘時提取樣本。為了分析氨清除率，將樣本使用磷酸鹽緩沖液稀釋U0x)并用0.275%的HC1酸化，然后置于水上。使用微量擴散法，以溴甲酚綠作為指示劑。以比色法分析脲產量，該分析基于丁酮肟和某些含氮化合物(如脲、甲基脲、瓜氨酸)之間的反應(Sigma-Aldrich)。ATP值在冷凍鉗的生物活組織檢查樣本中測定，該樣本在液氮中研磨，以高氯酸(14"稀釋，然后加入己糖激酶和G6PD進行分析。逸織夢如實施例2，除了用于透射電子顯微鏡檢查(TEM)的肝臟活組織檢查樣本(1mm)從左側葉獲取。為進行超微結構研究，活組織檢查樣本在McDowells固定劑中固定至少48小時。然后使用磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.4)沖洗，1%0s04后固定，梯度乙醇和環氧丙烷脫水。最后將樣本包埋于環氧樹脂(epon)中，使用ReichertUltracutE切成超薄切片(80nm),使用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進行對比染色。使用lOOkV下的PhilipsEM420研究切片；使用SISMegaviewD相機來獲得圖像。鍵^夢》、浙.'使用Kruskall-Wallis檢驗法對所有組進行比較。如果出現顯著性結果，則使用非參數MannWhitney-U檢驗法來評估每個組之間的差異。對于氨清除率，貝'H吏用Bonferroni的post-hoc檢驗法對重復的測量結果進行分析。文中和圖中的結果表示為平均值士SEM。統計學顯著性定義為p<0.05。結果實驗組內大鼠重量和肝臟重量沒有發現差異。各組間再灌注溫度沒有差異。麟戯務,在MP過程中，在t-0、1、2和22小時時，使用UW-G時的AST釋放量顯著高于使用Polysol。在所有的時間點，使用UW-G時的ALT釋放量顯著高于使用Polysol(圖la、b)。與MP-Polysol相比，MP-UW-G組中MP過程中的灌注液流量減少，導致在t=22、23和24小時時的流量較低(p=0.01)(圖2)。，勿^源務與CS相比，在t=30和t=45時，MP-UW-G之后AST釋放量較低(圖3a)(p<0.05)。若使用Polysol,則該釋放量在所有時間點均較低(p<0.005)。與CS相比，MP-Polysol的ALT釋放量顯示出相同的趨勢(圖3b)，但只有t=60時達到顯著性(24.67土7.30和6.00±1.26IU/L，p=0.05)。與CS相比在t-45和60時，與MP-UW-G相比在所有時間點，使用MP-Polysol進行RP過程中的灌注液流量都有顯著性優勢(圖4)。另夕卜，在所有時間點，CS組的灌注液流量都優于MP-UW-G組(p<0.05)。勝,顛""使用Polysol進行MP后，膽汁產量高于使用UW的CS以及UW-G的MP(分別為390士23和34士19和153士55iil/小時，p<0.01)。CS-UW和MP-冊-G之間未觀察到顯箸性差異(圖5)。最高的氨清除率發生于使用Polysol進行MP之后，在t=15、45和60時顯著優于使用UW-G,在t=15時顯著優于使用CS。在所有時間點，Polysol組的脲產量都顯著高于UW-G組。Polysol和CS之間沒有差異，然而在t-45時，CS組的脲產量高于UW-G組(圖6a、b)。在t=0和15時，使用Uf-G進行MP之后的乳酸鹽產量都高于使用Polysol進行CS和MP。在較晚的時間點未觀察到差異(圖7)。所有組在再灌注階段的氧消耗都相等(數據未給出)。，浙f潛果..使用Polysol進行MP之后，在再灌注階段結束時的ATP含量顯著高于使用UW進行的CS和使用UW-G進行的MP(分別為7.53±0.55和4.05士0.75和2.46±0.57jnMol/克濕重)(圖8)。如圖9所示對H&E染色的切片進行半定量評估，使用Polysol保存的肝臟的平均得分為2.4±0.3。該分數顯著好于CS和使用UW-G進行的MP(分別為3.9±0.24和4.3±0.48)。再灌注后提取的活組織檢查樣本表明，使用Polysol進行MP恭萍之后，在再灌注后的干/濕重比要顯著低于在UW中CS以及使用UW-G進行MP(分別為73±0.01和77±0.01和75士0.01%)(圖10)。結論在本實施例中，比較了NHBD大鼠肝臟的三種保存方法當前常用的金標準，即使用UW進行的CS;使用UW-G進行的MP;以及使用本發明的新開發的MP保存溶液Polysol-1進行的MP。不管是對于肝臟損傷還是肝臟功能來說，使用Polysol-l進行MP24小時后，結果都顯著好于CS和使用UW-G進行的MP。因此得出結論，使用本發明的新開發的保存溶液Polysol-1對NHBD肝臟進行24小時機械灌注，結果與在UW中冷藏和使用UW-G進行機械灌注相比，肝臟損傷更少，肝臟功能更強。在本實施例中，使用的polysol-1制劑如實施例1所定義，polysol指的是polysol-l。實施例4本研究的目的是在豬肝M模型中評估Polysol的可行性。為此，將使用Polysol的MP與使用Celsior的CS進行比較。在本實施例以及隨后的實施例5和6中，^^吏用實施例1所定義的polysol-2制劑。材料和方法動參^M^辨法重35-45kg的長白(Landrace)母豬用作肝臟供體。將動物在標準化條件下，無限制供應標準實驗食物和水的情況下飼養7天，以使之適應實驗室環境。用于實驗之前，使豬禁食一夜，可自由飲水。所有的動物處理都根據荷蘭法規和動物保護原則進行。M究獲得了阿姆斯特丹大學動物倫理委員會批準。麻醉前給予氯胺酮(10mg/kg)、多美康(1mg/kg)和阿托品(0.1mg/kg)之后，通過吸入02/^0和異氟烷(1-3%)來實施麻醉。進行氣管內插管以控制機械通氣。通過給予檸檬酸舒芬太尼(sufentanilcitrate)(20mg/L)和氯胺酮(20g/L)來保持麻醉。為了接入靜脈，將導管插入耳靜脈。動脈血壓通過鎖骨下動脈監測，并通過補液來控制。中線剖腹并將導管(0.8Fr，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard,TheNetherlands)插入膽總管之后，進行肝臟的血管分離.將腔靜脈的肝下部分和肝上部分切開3-5cm,將門靜脈在靠近胰臟上邊界的遠端切開，將肝動脈向下切開，直到脾動脈從腹腔干分出的分支點。使用250IU/kg肝素(5000IU/ml，LeoPharma，Malm6，Denmark)將豬肝素化之后，在門靜脈中插入硅酮管。然后使用5L水冷的RingerLactate(乳酸根29mmol/L，Na+131咖ol/L，K+5.4,ol/L，Ca"1.8畫1/L，CI—111畫1/L，Baxter,Utrecht，TheNetherlands)體內沖洗肝臟,通過滾子泵(GambroInstrumentsAB，Lund,Sweden)使RingerLactate以100-200ml/min的流量流it^f臟。在該沖洗過程中，將肝臟切下放入器官保存室中.隨后，將肝臟使用lL冰冷的Celsior沖洗以用于CS,或者使用Polysol沖洗以用于MP，然后使用各自的方法進行24h低體溫保存。漆濕CS保存溶液Celsior(pH7.3，320mOsm/kg)是從ImtixSangstat(Lyon，France)獲得的。我們的MP保存溶液Polysol是在SurgicalLaboratoryoftheAcademicMedicalCenter(Amsterdam,TheNetherlands)開發的(pH7.4，312m0smol/kg)。Polysol由Cambrex(Verviers，Belgium)生產。Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)是在我們實驗室使用購自Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands)和Merck(Haarlem,TheNetherlands)的分析純試劑級化學藥品配制而成。KHB通過0.22pm的濾器(Millipack60，Millipore，Amsterdam,TheNetherlands)來滅菌。冷Jf希錄傳溫在械滲;^談務..沖洗后，將CS組的肝臟(n-5)置于裝有1L冰冷的Celsior的無菌保存室中，在4。C下保存。為進行使用Polysol的MP(n-5)，將肝臟置于4匸下的器官保存室中，該器官保存室同時也作為貯液器，可4吏灌注液與門靜脈相連。Polysol通過滾子泵(200ml/min，GambroInstrumentsAB，Lund,Sweden)進行再循環，通過毛細管式氧合器(lL/min，100%醫用氧，HoekloosMedical,Amsterdam,TheNetherlands)氧合至氧張力為800-1000咖Hg。Polysol在ii^肝臟之前先流經一個流量傳感器(HT-207，TransonicSystemsInc，Maastricht,TheNetherlands)和一個腔內壓傳感器(Baxter,Utrecht,TheNetherlands),從腔靜樂，流出的灌注液自由流入貯液器中。將一個溫度探頭(Lam6ris，Nieuwegein，TheNetherlands)置于肝門(liverhilum)中。灌注液樣本從肝前獲取。_z￡,傳溫對錄，存,;^遂備z在24小時保存和30分鐘復溫之后，使用氧合的KHB進行正常體溫再灌注。以與MP同樣的設備進行再灌注(見上文)，但現在通過熱交換器,-200，Heto，Breda,TheNetherlands)將體系加熱到39X3。5&液器中裝有正常體溫的KHB，使用MedosHilite800充氧器(Stolberg，Germany),以卡波金(lL/min，95/5%02線，HoekloosMedical,Amsterdam,TheNetherland)使灌注液發生氧合。灌注液流量設置為大約500ml/min。分析研究在每隔15分鐘取樣的肝前灌注液樣本(7)中，以分光光度法測定天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。從灌注液流量(F，以ml/min計)和腔內壓(P,以mmHg計)來計算血管內阻力(R)(R=P/F)。血管內阻力是竇狀內皮細胞損傷和血管完整性的參數。母謝教在再灌注過程中，通過收集15分鐘內產生的膽汁來測定膽汁產量。為了測定氨清除率和脲產量，在再灌注開始時向肝臟施加單一劑量的5mM氯化銨(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht，TheNetherlands)。在再灌注過程中的,t-0，l5，30，45和60分鐘時提取樣本。為了分析氨清除率，將樣本使用磷酸鹽緩沖液稀銜10x)并用HC1酸化(終濃度0.45%m/v),然后置于冰上。使用一種酶促法，該方法基于由谷氨酸脫氫酶催化的、在氨、酮戊二酸和NADPH之間的反應(8)。以比色法分析脲產量，該分析基于脲與丁酮肟(Sigma-Aldrich)之間的反應(9)。以分光光度法測定灌注液樣本中的乳酸鹽產量。使用Radiometer血氣計(Zoetermeer，TheNetherlands)來測量灌注液的pH值。使用GraphPadPrism軟件的Windows下第4版(GraphPadSoftware,SanDiego，California,USA),通過非參數MannWhitney-U檢驗法來比較各實驗組。對于氨清除率和脲產率，則使用Bonferroni的post-hoc檢驗法對重復的測量結果進行分析。文中和圖中的結果表示為平均值±SEM。統計學顯著性定義為p<0.05。結果絲.'CS組和MP組之間的豬體重沒有差異(分別為41±3和37±1kg)。沖洗后CS組和MP組的肝重分別為1100±65和950±38g。平均灌注溫度在兩組中相似(分別為37.3±0.2和37.8±0.l'C)。使用Celsior進行CS后，AST水平顯著高于4吏用Polysol進行MP(圖IA)。ALT的結果與此相似(圖1B)。對于LDH釋放，可以發現Polysol表現更好，但結果沒有顯著性(圖1C)。在再灌注的t=0min時，經過24小時使用Polysol的MP之后的血管內阻力顯著低于使用Celsior進行的CS。當在再灌注過程中比較這些組的總體阻力時，CS組的阻力同樣顯著較低(分別為0.13±0.01和0.16±0.01mmHg/ml/min)。兩個實驗組中都沒有膽汁產生。然而，所有的氨在60分鐘的再灌注過程中都被清除，轉化為脲(圖3)。實驗組間未觀察到差異。在再灌注結束時，兩組中都觀察到高水平的乳酸鹽，CS和MP組間沒有差異(8.6±2.3和9.5±1.1咖ol/L)。兩組中都出現pH值降低(6.9±0.1和6.8±0.1)。潛論通過新開發的機械灌注保存溶液Polysol來保存豬肝，可獲得與使用Celsior的冷藏法相比，相同或更好的*質量。Polysol作為豬肝的機械灌注保存溶液看來是可行的。實施例5過去幾年中，肝移植的適應證增加，而可用的供體器官卻沒有同步增加，導致肝移植的等候名單越來越長。在等待供體肝臟過程中，有14%的患者死亡(10)。為縮短等待名單，已經嘗試了幾種可選措施，包括活M肝移植、劈裂式肝移植、改變器官捐獻的政治體制以及使用臨界狀態的供體肝臟(ll-14)。后者包括老年供體、肝纖維化或脂肪變性的供體或者非心跳供體(NHBD)(15-17)。在NHBD中，在器官切取前就已經發生循環停止。當前所選的用于保存最適的心跳供體肝的方法是冷藏法(CS)。然而最近的研究表明，通過連續低體溫機械灌注(MP)來保存，在保存24小時后可使肝損傷較少，肝功能較強(18-20)。MP的優點有助于持續向供體器官供應營養物和氧，可使NHBD器官復蘇。另一個優點是可在保存過程中對活力進行評估。CS對于保存缺血損傷的NHBD器官來說效果較差，這是因為在冷缺血過程中，肝損傷進一步增加，肝功能進一步降低。在臨床和實驗條件下，用于肝臟機械灌注的保存溶液主要是改良的威斯康星大學溶液，即UW-葡糖酸鹽(UW-G)(21，22)。該溶液含有膠體羥乙基淀粉(HES)，可導致微循環障礙(23)，并且難以獲得且價格昂貴。UW-G無法向肝臟提供特定的營養物，以維持肝臟在4'C下的代謝活性，盡管在該溫度下代謝已經顯著減弱(24)。為了克服這些缺點，我們開發了用于肝和腎的MP的新的保存溶液除了膠體聚乙二醇，它還含有肝臟所需的營養物，例如葡萄糖和氨基酸(附加1)。在前面的研究中我們已經報道，在心跳供體模型中，使用Polysol保存的肝臟質量要高于UW-G(25)。在大鼠肝臟模型中，在24小時連續低體溫MP之后，使用Polysol的MP可使肝損傷較少，肝功能較強。本研究的目的是將使用UW進行CS來保存NHBD大鼠肝臟，與使用UW-G或Polysol進行MP相比較。材料和方法動#將重275g(+/-25g)的雄性Wistar大鼠(Harlan，Horst，TheNetherlands)用作肝臟供體。這些動物在標準化條件下飼養，提供12/12小時黑暗/光照周期，無限制供應水和標準pellet食物(HopeFarms,Woerden),直到開始實驗。所有的動物處理都根據荷蘭法規和動物保護原則進行。阿姆斯特丹大學動物倫理委員會(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批準了該項動物實驗。為、妙絲#^通過使用UW進行CS(n-6)、使用UW-G進行MKn-6)或者使用Polysol進行MP(n=6)，將NHBD肝臟保存24小時。使用50mlRingerLactate(乳酸根29畫1/L，Na131mmol/L，K5.4畫1/L，Ca1.8畫1/L，CI111畫1/L，Baxter,Utrecht,TheNetherlands)在37n進行原位沖洗后，再使用低體溫保存溶液(41C)沖洗肝臟，使用50mlUW、UW-G或Polysol在15mmHg壓強下沖洗。進行CS時，使肝臟浸入于盛有100mlUW的塑料無菌杯中，置于41C的冷室中的融水上。進行MP時，將肝臟與裝有250ml保存溶液的再循環標準灌注設備相連接。在MP以及再灌注過程中，提取樣本用于評估肝臟損傷，用于評估肝臟功能的樣本在再灌注過程中提取。絲敘用于CS的UW溶液從DuPont(Viaspan,pH7.4，320mOsmol/kg，Bristo卜MyersSquibb,NewYork,USA)獲得。用于MP的UW-G溶液根據Belzer的方法制備(pH7.4，330mOsmol/kg)(26)。我們的MP保存溶液POLYSOL由AcademicMedicalCenter的夕卜科實驗室(Amsterdam,TheNetherlands)開發(pH7.4，330mOs血ol/kg)。UW-G、Polyso卜2和Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)均在我們的實驗室中制備，制名一吏用的是購自下列廠商的分析試劑級別(或更好的)的化學藥品Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands),Merck(Haarlem,TheNetherlands),Cambrex(Verviers，Belgium),Centrafarm(Etten-Leur，TheNetherlands)和NovoNordisk(AlphenaandenRijn，TheNetherlands)。HES購自Fresenius(Taunusstein,Germany),溶液通過0.45濾器(DowCorning,Allesley，UnitedKingdom)和0.22jam濾器(Millipack60，Millipore，Amsterdam,theNetherlands)過濾除菌。手敘在將大鼠以02/空氣/異氟烷(1L/min:1L/min:3W麻醉。中線剖腹并向兩側肋緣下切口之后，通過腔靜脈以0.1ml肝素(5000IU/ml，LeoPharma,Malm6，Denmark)將該動物肝素化。兩分鐘后，進行膈切除(phrenotomy)以處死該動物。血液停止流向肝臟后，開始溫缺血時間(thewarmischemictime,WIT)。在WIT過程中，移動肝臟，在膽管中插入0.9咖靜脈導管(B-Braun，Melsungen，Germany)。30分鐘WIT后，通過門靜脈導管(2.7mm，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard，TheNetherlands)以50mlRingerLactate(371C,8咖HG)沖洗肝臟。在沖洗過程中，通過切斷肝下腔靜脈來防止肝臟'淤血。然后在肝上腔靜脈中插入2mm導管(Vygon)，連接肝下腔靜脈，清理周圍組織后，取出肝臟并稱重。歡謝'滲;^,秀遂我們的機械灌注系統由MedicalTechnologyDepartmentoftheAcademicMedicalCenter(Amsterdam,theNetherlands)開發。在連接肝臟之前，將回路用無菌aquadest液和保存溶液洗涂。壓力驅動系統(15mmHg)包括一個貯液器，貯液器中含有350ml無菌MP溶液(4t;)。將肝臟連接之后，最早的100ml溶液自由流出，不再進入系統。剩下的250ml溶液通過滾子泵(Ismatec，Glattbrugg，Switzerland)進行再循環。通過玻璃充氧器對溶液進行氧合，向器官輸送超過700mmHg的氧壓力。在氣泡捕捉器中除去系統中的氣栓，然后使用熱交換器(HMT-200，Heto，Breda,theNetherlands)使溶液冷卻至4n。溶液經過一個流量表(HT-207，TransonicSystemsInc，Maastricht,theNetherlands),然后通過門靜脈導管進入肝臟。溶液經肝上腔靜脈導管自由流回貯液器中。在30分鐘的復溫階段后，使用Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)進行再灌注，以模擬肝臟植入受體的過程。在再灌注快要開始前，加入氯化銨以進行功能測定。以與MP同樣的設備進行再灌注，除了貯液器裝有350mlKHB以及溫度調節到371C。在連接肝臟之前，使用無菌Aquadest液和KHB洗滌系統。在連接肝臟后，同樣最早的IOOml自由流出，不再進入回路。溶液通過熱交換器加熱，流過流量計，然后通過門靜脈導管ii^肝臟。用于評估肝損傷和肝功能的樣本從肝后收集。通過置于肝下的溫度探頭(Lameris，Nieuwegein，TheNetherlands)來效'J量肝臟溫度。每次操作前后均用乙醇(700和無菌水(Aquadest)清洗系統。用于肝細胞損傷和肝功能評估的灌注液樣本在MP和再灌注過程中提取。在MP過程中，樣本在t=0，t=l，t=2，t=22，t-23以及t-24小時時每小時提取一次。在再灌注階段，在60分鐘的時間內每隔15分鐘提取樣本。在再灌注階段結束時，使用冷凍鉗(freezeclamp)從肝副葉提取用于三磷,苷(ATP)評估的肝臟樣本，以便立即冷凍組織。還從肝尾葉和肝右葉取得肝臟樣本，并在福爾馬林(10%,溶于磷酸鹽緩沖液)中處理。用于透射電子顯微鏡檢查的肝臟樣本從中葉獲得，并保存于McDowells溶液中。最后，從左葉提取肝臟樣本用于干/濕重分析。賴務M潔鄉肝損傷通過對天冬氨酸轉氨敏AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)進行分光光度分析來評估(27)。在MP和再灌注過程中測量灌注液流量以評估徵血管的完整性。肝功能通過測量膽汁產量、氧消耗量、氨清除率、脲產量和ATP再生來評估。為了測定膽汁產量，在再灌注過程中通過膽管導管來收集膽汁。氧消耗量通過肝前和肝后的血氣樣本中氧濃度(niMol/L)差來測定(ABL，Radiometer,Zoetermeer,TheNetherlands),氧消耗量與灌注液流量和肝濕重有關。為了測定氨清除率和脲產量，向肝臟施加5mM氯化銨(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht,TheNetherlands)。在再灌注過程中的t--5，t=0，t=15,t=30，t=45和t=60分鐘時提取樣本。為了分析氨清除率，將樣本使用磷酸鹽緩沖液稀釋(10x)并用HC1酸化(終濃度0.45%m/v),然后置于水上。使用一種酶促法，該方法基于由谷氨^氫酶催化的、在氨、酮戊二酸和NADPH之間的反應(28)。以比色法分析脲產量，該分析基于脲與丁酮坊之間的反應(Sigma-Aldrich)(29)。ATP值在冷凍鉗的生物活組織檢查樣本中測定，該樣本在液氮下研磨，以水冷的HC104(終濃度3.5%m/v)提取。使用微量離心機在4"C下快速離心，除去沉淀的蛋白質，上清液使用2MK0H和0.3MMOPS的混合物中和到pH7。使用葡萄糖、NADP+、葡萄糖6-磷酸脫氫酶和己糖激酶，以熒光分析法測定ATP。逸歡夢將用于組織學檢查的肝臟活組織檢查樣本保存于甲醛(10%，溶于磷酸鹽緩沖液)中，包埋于石蠟中，并切成4pm的切片。使用蘇木精和伊紅染色后，用光學顯微鏡檢查對切片進行評估，使用由Tojimbara和Martin改良的9個等級半定量損傷評分(31，32)。從左側葉獲取活組織檢查樣本用于評估干/濕重比肝臟在再灌注后立即稱重。然后將這些活組織檢查樣本保存于6or;溫箱中。將活組織檢查樣本每隔3~5天再次稱重，直到重量不再減少。使用下式度量干/濕重比100%x(l-(干重/濕重))。為進行超微結構研究，將用于透射電子顯微鏡檢查(TEM)的肝臟活組織檢查樣本(1腿3)在McDowells固定劑中固定至少48小時。然后使用Na-磷酸鹽緩沖液(0.1M,pH7.4)沖洗，用1%0s04后固定，使用水沖洗，梯度乙醇(70-80-90-96-100%)和環氧丙烷脫水。最后將樣本包埋于環氧樹月旨(印on)中。使用ReichertUltracutE切成超薄切片(80咖)，使用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進行對比染色。使用100kV下的PhilipsEM420研究切片；使用SISMegaviewn相機來獲得圖像。使用Kruskall-Wallis檢驗法對所有組進行比較。如果出現顯著性結果，則使用非參數MannWhitney-U檢驗法來評估每個組之間的差異。對于氨清除率脲產率，則使用Bonferroni的post-hoc枱r驗法對重復的測量結果進行分析。文中和圖中的結果表示為平均值土SEM。統計學顯著性定義為p<0.05。結果絲平均大鼠體重和肝重分別為289±7g和14.8±0.3g(n=18)。M(Vt7J過在吵^^勿慮源務和,j^遂諒f在MP過程中，在t-0、t=l、t-2和t-22小時時，使用UW-G時的AST釋放量顯著高于使用Polysol。在所有的時間點，使用UW-G時的ALT釋放量顯著高于使用Polysol(圖1A、B)。與MP-Polysol相比，MP-UW-G組中MP過程中的灌注液流量減少，導致在t-22、t-23和t=24小時時的流量較^f氐(p=0.01)(圖2A)。4滲;^(^7t7J3趕#^^勿^"#務々凜^濕諒#與CS相比，在t=30和t=45分鐘時，MP-UW-G之后AST釋放量較低(圖3A)(p<0.05)。若使用Polysol，則該釋放量在所有時間點均較低(p<0.005)。與CS相比，MP-Polysol的ALT釋放量顯示出相同的趨勢(圖3B),但只有t=60分鐘時達到顯著性(9.7士2.4和47.2±14.2IU/L，p<0.05)。與CS相比在t-45和60分鐘時，與MP-UW-G相比在所有時間點，使用MP-Polysol進行再灌注過程中的灌注液流量都顯著較高(圖2B)。另外，在所有時間點，CS組的灌注液流量都好于MP-UW-G組(p<0.05)。存滲a使用Polysol進行MP后，膽汁產量高于使用UW的CS以及UW-G的MP(分別為390±23和34±19和153±55^1/小時，p<0.01)。CS-UW和MP-UW-G(表l)之間未觀察到顯著性差異。使用Polysol進行MP后，氧消耗量在所有時間點均高于使用UW-G的MP，在t=60時高于使用UW的CS(圖4)。最高的氨清除率發生于使用Polysol進行MP之后，在t=15、t=45和t=60分鐘時顯著優于使用UW-G，在t-15分鐘時顯著優于使用CS。在所有時間點，Polysol組的脲產量都顯著高于UW-G組。Polysol和CS之間沒有差異，然而在t-45分鐘時，CS組的脲產量高于UW-G組(圖5A、B)。使用Polysol進行MP之后，在再灌注階段結束時的ATP含量顯著高于使用UW進行的CS和使用UW-G進行的MP(分別為7.5±0.6和4.0±0.8和2.5±0.6jiMol/克干重)。對蘇木精和伊紅染色的切片的損傷進行半定量評估，使用Polysol保存的肝臟的平均得分為2.2±0.2。該分數顯著好于CS和使用UW-G進行的MP(分別為3.7±0.3和4.4±0.3)。再灌注后提取的活組織檢查樣本表明，使用Polysol進行MP保存之后，千/濕重比要顯著低于(因此組織水腫要少于)在UW中CS以及使用UW-G進行MP(分別為72.6±0.8和77.1±1.1和75.2±0.9%)。因此得出結論，使用新開發的保存溶液Polysol對NHBD大鼠肝臟進行24小時機械灌注保存，結果與在UW中冷藏和使用UW-G進行機械灌注相比，肝臟損傷更小，肝臟功能更強。在本實施例中，使用的是實施例l中所定義的polysol-2制劑。實施例6肝移植是末期肝疾病患者所選的治療方法(33,34)。肝移植的質量與許多因素有關，其中包括保存方法以及保存時間長短，即冷缺血時間等。當前肝臟M的金標準(35)是使用適當的保存溶液沖洗肝臟，然后冷藏(CS)，使得人肝臟異體移植物可安全地保存長達16h(36)。這種情況下，在保存階段之后就將肝臟植入受體，而對移植物的活力沒有任何客觀了解。缺少一種在靜態冷藏的器官中，事先評估肝細胞損傷和肝功能的可靠方法。供體病史、肉^J見察和肝臟活組織檢查分析只能給出冷藏的肝移植物的活力的跡象(37)。CS在保存多數腹器官的應用中已經達到了極限。作為替代方法，肝臟的機械灌注保存(MP)又一次成為了實驗研究的焦點。MP已經于60年代早期得到應用(38-40)。在沖洗除去殘余血液后，將肝臟與再循環機械灌注系統相連接，在該系統中，以低體溫保存溶液來灌注運輸中的肝臟。已推測MP相對于CS有幾項優點l)持續供應氧和營養物，2)除去代謝終產物，3)保存過程中評估肝臟存活狀況(41)，以及4)缺血損傷器官如非心跳供體(NHBD)器官可能復蘇(42)。實驗研究表明，MP后的肝臟在移植后的功能要好于CS后的肝臟(43-45)。該結果可解釋為，盡管器官被冷卻到41C,但仍然保持了原來代謝的7-35%(46)。該代謝雖然已經減弱，但仍能從能量底物和氧中獲得益處，而能量底物和氧只能通過持續氧合的MP來提供。改良的威斯康星大學溶液(UW-葡糖酸鹽UW-G)在實驗MP中最為常用，它缺少用于肝臟能量、糖類和脂肪代謝的底物(47-51)。盡管論述營養物在低體溫器官保存溶液中的作用的文獻非常罕見(52-54)，但我們仍然推測，富含營養物的灌注溶液可使肝臟保存的質量更好。這促使我們開發了新的保存溶液Polysol,Polysol含有肝代謝所需的營養物，以及強力緩沖液和自由基清除劑。使Polysol區別于其他MP保存溶液的組分有氨基酸(如谷氨酰胺、組氨酸、色氨酸和精氨酸)和維生素(如抗壞血酸和OC-生育酚)等等。^研究的目的是評估使用Polysol對大鼠肝臟進行的MP,并將結果與使用UW-G的MP的結果相比較(并將這兩種都與使用冊的金標準CS法相比)。為此，保存方法和MP溶液都在分離的灌注大鼠肝臟模型(IPRL)中評估。材料和方法動參々手^將重350g(+/-50g)的雄性Wistar大鼠(Harlan,Horst,TheNetherlands)用作肝臟供體。這些動物在標準化條件下飼養，提供12/12小時黑暗/光照周期，無限制供應水和標準pelletchow食物(HopeFarms,Woerden，TheNetherlands),直到實驗之前。所有的動物處理都根據荷蘭法規和動物保護原則進行，并經過阿姆斯特丹大學動物倫理委員^(theAnimalEthicalCommitteeoftheUniversityofAmsterdam)批準。將大鼠使用02/空氣/異氟烷(1L/min:1L/min:3%)以及,內注射0.1ml/100g體重的FFM(Hypnorm/Dormicum/aquadest:1:1:2)進行麻醉。手術過程中，通過面罩吸入02/空氣/異氣烷來保持麻醉。中線剖腹并向兩側肋緣下切口之后，移動肝臟，在膽管中插入0.9mm導管(B-Braun，Melsungen，Germany).在將導管插入門靜脈之前，通過腔靜脈以0.1ml肝素(5000IU/ml，LeoPharma，Malm6，Denmark)將該動物肝素化。通過門靜脈導管(0.8fr，enteralfeedingtube,Vygon，Valkenswaard，theNetherlands)以50mlRingerLactate(37X3,10cmH20，Baxter,Utrecht,theNetherlands)洗滌肝臟。在洗滌過程中，通過在腹部的腔靜脈切口放出動物血液。將0.6fr的導管(Vygon)插入肝上腔靜脈，連接肝下腔靜脈，清理周圍組織后，切下肝臟并稱重。在嫌濟;^遂；雙重機械灌注系統由MedicalTechnicalDevelopmentDepartmentoftheAcademicMedicalCenter(AMC，Amsterdam,theNetherlands)開發，該系統能夠在一個裝置(附加2)中進行MP和再灌注(RP)階段。在連接切下的肝臟之前，將回路用200ml無菌aquadest液洗滌，然后用50ml^溶液洗滌。壓控灌注系統包括一個貯液器，貯液器中含有350ml無菌MP溶液。將肝臟與該系統連接之后，收集最早的100ml灌注溶液。剩下的250ml溶液通過滾子泵(Ismatec，Glattbrugg，Switzerland)進行再循環。在玻璃充氧器中，使用卡波金(95%02/5%C02，1L/min，HoekloosMedical,TheNetherlands)對灌注溶液進行氧合，使肝前氧張力大約為700mmHg。在氣泡捕捉器中除去系統中的氣栓，然后使用熱交換器(腹T-200，Heto，Breda,theNetherlands)使溶液冷卻。灌注溶液經過一個線內流量表(HT-207,TransonicSystemsInc，Maastricht:theNetherlands),通過門靜脈導管進入肝臟，再經肝上腔靜脈導管自由流入貯液器中。沿如上所勤目同的回路進行再灌注，但這次使用第二個貯液器，該貯液器含有37"C下的400mlKrebs-Henseleit緩沖液(KHB)溶液。在重新連接肝臟前，使用200ml無菌aquadest液和50mlKHB洗滌系統。重新連接肝臟后，放掉最早的100ml以防止它重新i4^回路中。剩下的250ml灌注液使用卡波金進行氧合。從緊鄰肝前或肝后的管處獲得樣本。由放置于肝下的探頭(Lam6ris，Nieuwegein，TheNetherlands)記錄溫度。每次操作后，洗滌回路并進行蒸汽消毒(134*C，16分鐘)。錄為、#絲絲本研究包括3個實驗組1)CS-UW(N=5);2)MP-UW-G(N-5)以及3)MP-POLYSOL(N=5)。分離的肝臟通過CS或MP保存24小時，然后進行再灌注。使用RL(41C)洗滌后，將肝臟在原位置使用保存溶液沖洗。將CS肝臟使用50mlUW(4"C)沖洗，放置于盛有100mlUW的無菌杯中，在冷室(41C)中融水上保存24小時。MP肝臟在洗滌并取出后立即通過門靜脈連接灌注系統，使用100ml冊-G或POLYSOL沖洗，并在4"C下使用該溶液連續灌注24小時。M階段結束后，所有的肝臟在37匸下使用氧合的KHB再灌注60分鐘。絲敘冷藏時，使用威斯康星大學保存溶液(Viaspan，BristolMyersSquibb,NewYork,USA)。用于MP的UW-G溶液根據Belzer的方法制備(pH7.4,4"C，330mosmol/kg)(55)。MP保存溶液P0LYS0L(pH7.4，4匸，330mosmol/kg)由AMC的外科實驗室開發。再灌注時，使用不含牛血清清蛋白的Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)(pH7.4，37°C，320mosmol/kg)。UW-G、P0LYS0L和KHB均在我們的實驗室中制備，制備使用的是購自下列廠商的分析試劑級別(或更好的)的化學藥品Sigma-Aldrich(Zwijndrecht，TheNetherlands)，Merck(Haarlera，TheNetherlands)，Cambrex(Verviers，Belgium),Centrafarm(Etten-Leur，TheNetherlands)和NovoNordisk(AlphenaandenRijn，TheNetherlands)。鞋乙基淀粉(HES)購自Fresenius(Tau謂stein，Germany),使用前，溶液通過0.45jim的ampul濾器(DowCorning，Allesley，UnitedKingdom)和0.22jnm濾器(Millipack60,Millipore，Amsterdam,theNetherlands)過濾除菌。一餅勿詹資辦贈..在60分鐘的RP過程中，每10分鐘取樣，用于肝細胞損傷的評估。在肝后灌注液樣本中直接分析天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)來評估肝損傷(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands)(56)。使用大鼠ot-GSTELISA試劑盒(Biotrin，Dublin,Ireland)來測定oc-GST(a-谷胱甘肽-S-轉移酶)水平。在60分鐘的RP過程中，通過監控膽汁的產生來評估肝功能。而且，在再灌注過程中還測定了乳酸鹽產量(LaboratoryofClinicalChemistry,AMC，theNetherlands)以及灌注液pH值(ABL，Radiometer,Zoetermeer，TheNetherlands)。逸歡穸和f/濕,竑在RP階段結束時，從尾狀葉和右側葉取得活組織檢查樣本。將活組織檢查樣本保存于曱醛(10%)并包埋于石蠟中。石蠟切片(4pm)使用蘇木精和伊紅(H&E)染色，并用光學顯微鏡檢查。使用9個等級對肝損傷的形態學進行分類，分為等級l(好)到等級9(差)(57,58)。1.正常矩形結構，2.圓形肝細胞，竇狀空間增大，3.3區形成空泡，4.2區形成空泡，5.1區形成空泡，6.3區形成空泡和核固縮，7.2區形成空泡和核固縮，8.1區形成空泡和核固縮，以及9.壞死。為獲得干/濕重比，肝臟活組織檢查樣本在再灌注后立即稱重，然后保存于60'C溫箱中。將活組織檢查樣本每隔7天再次稱重，直到肝重不再減少。使用下式計算肝水腫的量l-(干重/濕重)x100%。財夢》、浙使用Kruskall-Wallis檢驗法對三組數據進行總體比較。如果顯示出顯著性差異，則使用非參數MannWhitney檢驗法來評估每個組之間的差異。文中和圖中的結果表示為平均值土SEM。統計學顯著性定義為p<0.05。結果在各實驗組之間，肝重沒有顯著性差異(16.5±0.5克)。在低體溫MP和正常體溫RP過程中，灌注壓保持恒定在20cmH20(重力控制)。低體溫MP過程中灌注流量最大達到1ml/min/克肝臟。正常體溫RP過程中，記錄到的最大流量為3ml/min/克肝臟。低體溫MP過程中的氧M得灌注液p02大約為700咖Hg，在正常體溫RP過程中，由于溫度較高，p02大約為500咖Hg。正常體溫RP過程中記錄到的溫度為37.1±0.4*C。與使用UW-G的MP相比，使用UW進行CS后，在24小時冷缺血時間之后ALT的釋放量顯著增高，所述釋放的時間分別是tH)min(4.6±2.4和0.4±0.2IU/L)以及t=10min(5.4士1.7和1.4±0.2IU/L)(圖1A)。然而，當CS-UW與MP-POLYSOL相比時，除t=0min和t-50min之外的所有時間點，MP-POLYSOL后ALT水平都顯著降低。24小時CS-UW后LDH水平顯示升高，但不顯著。與使用W-G或POLYSOL進行MP相比，CS-UW后t=10min時LDH顯著升高(圖1B)。灌注液流量、pH和乳酸鹽的產量沒有顯著差異(數據未給出)。當與兩種MP溶液相比時，24小時MP-POLYSOL后觀察到的損傷較少，這表現為AST水平較低(圖1C)。盡管在所有時間點，Polysol的趨勢總是比較好，但ALT(圖1A)、LDH(圖1B)、灌注液流量、pH和乳酸鹽產量(數據未給出)沒有顯著差異。t-40min時，MP-POLYSOL后a-GST的釋放量(圖2)低于CS-UW(分別為125.5±10.51和46.4±9.1，p<0.02)和MP-UW-G(分別為101.6±12.0和46.4±9.1，p<0.02)。，雄潔MP-POLYSOL后膽汁的產量高于MP-UW-G之后或者CS-UW之后(分別為355±82,3和256±26.2和180±61.99yl/h)。然而，并沒有達到顯著性(圖3)。逸歡夢對肝切片進行組織病理學評分之后，與CS-UW肝臟(4.5±0.9分)相比，使用UW-G和POLYSOL的MP組具有更好的平均得分(分別為2.0±0.6和1.6±0.4分)(對于UW-G，p=0.06;對于POLYSOL,p=0.03)。MP組之間沒有顯著性差異(圖4)。肝切片的干/濕重比在MP組中最高，說明水腫的百分比最低(圖5)。百分比分別為76±1.0和72±0.5和72±0.7。總之，與冷藏相比，通過機械灌注來保存心跳供體大鼠肝臟可使M肝臟的質量提高。與UW-G相比，使用新的、成分增加的保存溶液POLYSOL-2進行機械灌注，可使保存肝臟的質量相同或提高。在本實施例中使用的Polysol-2制劑如實施例1所定義。Polyso1指的是polysol-2。參數文獻列表1.KhnJSBoudjemaD'AlessandroA，SouthardJH.Machineperfusionofthelivenmdntenanceofmitochondrialftinctionafter48-hourpreservation,TransplantProc1997:29:3452-3454.2.FienaarBH，lindellSL，V朋Gu股T，SouthardJH，BdzerFO.Sev啤-two-hourpreservationofthecani加liverbymachineperfiiskm.Transplantation1990:49:258-260,3.SouthardJH,LindellS,AmetaniM，RicherJP，VosAW.Kupffo*cellactivationinliverpreservation:coldstoragevsmachineperfusion.TransplantProc2000:32:27-28.4.KimJS，BoudjemaD，AkssandroA，SouthardJH.Machinepo"ftisionoftheliver:maintenanceofmitochondrialfimctbnafter48-hourpresCTvatioiLTransplantftoc1997:29:3452-3454.5.SouthardJH,LindellS，Ame加iM，RicherJP,VosAW.Kupflfercellactivatkminliv紅preservation:coldstoi^evsmachineperfusion.TransplantProc2000:32:27-28*6.XuH，LeeCY，Clem咖MG，ZhangJX.Pronloiigedhypothermicmachineperfiiskmjpr欲rveshepatocellularfiinctkmbutpotentiatesendothelialcelldysftmctioninmtlivers.TKmspl幼tation2004:77:16764682.7.BergmeyerHU,St旭dardizatkmofenzymeassays.CMnCh咖1972:18:1305-13U.8.F加seca-WollheimF.[Diiectdet^minationofplasmaammoniawithoutdqoteinizatioiit.Animprovedenzj^nicdeteiminationofammoiiHn(犯thor'stransl).Z幻inChemKlinBfochem1973:11:426431.9.CrockerCL.Rapiddeterminationofur幼ni加geninserumotplasmawithoutdeproteinizatioii.AmJMedTechnol1967:33:361-365.10.UnitedNetworkforOrganSharing.Lanc改2003:340:1373-1376.11.GridelliB，SpadaM，拘tzWetal.Split-livertransplantationeliminatestheneedforliving-donorKvertraiKpl節tationinchildreDwithend-stagecholestaticliverdisease.Transplantation2003:75:1197-1203-12.Neub^gerJM，LuceyMR.Living-relatedliverdonation:theinevitabledonordea也shighlightedtheneedforgreatertransparency.Transpl油tatkm2004:77:489-490.13.NunezA，Go<K%)astorSE，GossJA，WashburnWK^HalffGA.Enlargementofthecadaveric-liverdo加rpoolusingin-situsplit-liv改transplantetiondespitecomplexhepaticarterialanatomy.Transplantation2003:76:1134-1136.14.OtteJB.Donorcomplicationsandoutcomesinlive-livertransplantation.Transpantetion2003:75:1625-1626.i5.FukumoriT，KatoT，IxviDetal.Useofoldercontrollediion-heart-beatingdo加rsfiwlivertransplantation,Tmn^plantetion2003:75:1171-1174.16.OhSanfeyHA，PelletierSJ,SawyerRG，McCulloughCS，PraettTL.Iirplicationofadvanceddonoragecmtheoutcomeoflivertransplantetion.ClinTransplant2000:14:386-3卯.17.VerranD，KusykT,PainterDetal.Clinicalexperiencegainedfromtheuseof120欲eatoticdonorliv鵬fororthotopiclivertran印kntetioiLLiverTranspl2003:9:500-505.18.KimJS,BoudjemaKjD'AlessaodroA,SouthardJH,MachineperAisionoftheliver:maintenanceofmitochondrialfimctkmaiter48-hourpreservation.Tr幼spl肌tPmc1997:29:3452-3454.19.SouthardJH，LindellS,AmetaniM，RicherJP，VosAW.Kupffercellactivatioiiinliverpre幼rvatkra:coldstoragevsmachineperfusion.TransplantProc2000:32:27-28.20.H,LeeCY，demensMG，Zh加gUCPronl加gedhypothermicmachineperfosionpreserveshepatocellularfimctionbutpotentiatesendothelialcelldysftoictkminratlivers.Txa啤lantation2004:77:1676-1682.21.MarshDC,LindellSL,FoxBelzerFO，SouthardJH.Hypothermicpreservationofh鄰atocytes.LRoleofcellswelling.Ciyobiology1989:26:524-534.22.PienaarBH，LindellSL,VanGulikT，SouthardJH，Bel微FO.Seventy-two-hourpreservationofthecanineliverbymachineperfiisi肌T咖splantotion1990:49:258掘.23.MorariuAM，VdP入OeverenVet^1.HyperaggregatingeffectofhydroxyethylstarchcomponentsandUniversityofWisconsinsolutionoahumanredbloodcells:ariskofimpairedgraftperfiiskminorganprocurementTransplantation2003:76:3743.24.RuWnskyB,Mndplesoflowtemperaturecellpreservation.HeartFaUTRev2003:8:277-284.25.BessemsM，DoorschodtBM^vanVHetA.KL，VanGulikT.ImprovedratliverpreservationbyhypothermiccontinuousmacW加perfusion腿itigPolysolanew,enrichedpreservatkmsolution.LiverTranspl2005:11:539-546.26.PienaaiBH，LindeUSL，VanGuHkT，SouthardJH，BelzerFO.Seventy-two"hourpieseavationofthecani加Kv枕bymachineperfiision.Transplantation1990:49:258-260,27.B改gmeyerHU.Standardirationofenzymeassays.ClinChem1972:18:1305-1311,28.Fonseca-WollheimF.[DirectdeterminationofplasmaammoniawithoutZOnCh咖KlinBiochem1973:11:42"31.29.CrockerCL.Rapiddbterminatkmofureanitrogeninsmimorplasmawithoutd鄰rotei11i2ati(m,AmJMedTechnol1967:33:361-365.30.Willia咖cmJR，CorkeyBE.Assayofcitricacidcycleintermediates幼drelatedcon^ounds-updatewithtissuemetabolitelevelsandintracellulardistribution.MethodsEnzymol1979:55:200-222.31.MartinH，Boumiq股B，SarsatJP，AlbaloiejoV，Lerche-LangrandC.Cryopreservedratliverslices:acriticalevaluationofceMviability,histologicalintegrity,抑ddrag-咖tebolizii^enzymes.Ciyobiology2000:41:135-144.32.TojimbaiaT,WicombWN，Garcia-KennedyRetaLLivertransplan祖tionftcmi加n-heartbeatingdo加rsinrate:influenceofviscosityandteiqperatureofinitialflushingsolutb加ongraftftmctkm.liverTransplSurg1997:3:39>45.33.NeuhausP，BechsteinWO，HopfU，BlumhaidtG，Stef&nIL[Indicatk)加抑dcvurentdevelopmentsinUvertransplantation].LeberMagenDarm1989:19:289-308.34.HingeB.Quadr咖ialreviewonlivertranspl油tatioaAmJGastroenterol1994:89:S18-S26.35.StPeterSD，ImberCJ，FriendPJ.Liver油dkidneypreservationbyperfbsion.Lancet2002:359:604-613.36.PorteRJ，PloegRJ，H加senBetaLLong-termgraftsurvivalafterlivertransplantationintheUWera:lateeffectsofco〗dischemiaandprimaiydysfonctkm.EuropeanMulticentreStudyGroup.TransplInt19訴:11Su效l1:S164-S167.37.StPeterSD，ImberCJ,FriendFT.Liver油dIddneypreservationbyperfusion.Lancet2002:359:604-613.38-LeeD，WalkerJM.Maintenanceoftheftuictionalstateofisolatedratliverbyhypothermicperfiisionwithanerythrocyte-fireemedium.Transplantation〗977:23:136-141.39.TurnerMD,Alic油F,Successfiil20-hourstorageofthecanineliverbycontinuoushypothermicperfaskm,Cryobiology1970:6:293-301.40.StPeterSD，ImberCJ,FriendPJ.Liverandkidneypreservationbyperfiisioii.Lancet2002:359:604-613.41.Adh咖M，PeyrolS，ChevallierMetal.Theisolatedperftisedporcineliver:assessmentofviabilityduringandaftersixhoursofparfosion,T咖splhit1997:10:299-311,42.SchonMRH加tCJ，PeggDE,WightDG.ThepossibilityofresuscitatingHvereafterwarmischemicinjuiy.Transplantation1993:56:24-31.43.Co啤agnonP，Cl加entB，CampionJP，BoudjemaK.Effectsofhypotheimkmachinepedbsiononratliverfunctiondependingontherouteofperfbsioii.T咖spl幼tation2001:72:606-614.44.KimJS，BoudjemaD'AlessandroSouthard瓜Machineperflisionoftheliver:maintenanceofmitochondrialftmctkmafter48-lurarpreservation.TransplantProc1997:29:3452-3454.45.PfenaarBH，LindellSL，VanGu〗汰T，SoufhardJH，Be，zer1FO.Sev節ty-two-hoiirpr然ervationofthecaaineH卿bym^;hineperfiision.Transpl肪tation1990:49:258-260.46.RubinskyB.Principlesoflowtemperaturecelpreservation.HeartFailRev2003:8:277-284.47.BoudjemaLindellSL，Belza*FO，SouthardJH.Effectsofm她odofpreservationcmflinctio加ofliversfromfedandfastedrabbits.CryoWolo舒1991:28:227-236.48.KimJS，BoudjemaK,D，Ales咖droA,SouthardJH.Machineperfiisionoftheliver:maintenanceofmitochondrialfiinctkmafter48-hourpreservation.TransplantProc1997:29:3452-M54.49.PienaarBH，LindellSL，VanGulikT，Sou也ardJH,BelzerFO.Seventy-two-ho加pj^servatkmofthecanineliverbymachineperfusion.Transplantaticm19卯:49:258-260.50.SouthardJH，LinddlS,AmelaniM，RicherJP，VosAW.Kupffereel!activationinliverpreservation:coldstoragevsm^>hineperfiision.Tmn印lantProc2000:32:27-28.51UchiyamaMateuiioN,NakamuraYetal.Usefulnessofpf傷ervationbymachineperfusionoflivergrailsfrom加n-heart-beatingdo加rs-汰porcinemode，TranspkntProc2003:35:105-106.52.MarsliDC,BelzerFO，SouthanlJH.Hypothermicpreservationofhepatocytes.TLImportanceofCa2andaminoacids.Cryobiology1990:27:1-8.53.ChamieauC，Bloikte"CynoberF，Coudray-LucasCetal.Preventionofproteolysisincold-st鵬dratliveradditionofaminoacidstothepreservationsolution.JGastroetit咖lUepatoi2000:15:154.ChurchillTA，GreenCJ,FuMerBJ.Pro敏tivepropertiesof咖i加addsinliverpreservatkm:effectsofglycineandacombinationofaminoacidsonanaerobicmetabolismandraiergetics.JHepatol1995:23:720-726.55.PienaarBH，LinMlSL，V幼GuHkT，SouthardJH，BelzerFO.Sevarty-two-hourpreservatkmofthecanineliv改l^ymachineperfoskm,Tm^plantation1990:49:258-260.56.BergmeyerHU.Standardizationofenzymeassays.ClinGbem1972:18:13054311.57.MartinH，BoumiqueB，SarsatJP，AlbaladejoV，Leiche-Langr肪dC.Ciyopreservedratliverslices:acriticalevduationofcellviability,histologicalintegrity,anddrug-metabolizingenzymes.Cryobblogy2(XX):41:135-144.58.TojimbaraT,WicombWN，Garcia-KemiwiyHetal.Livertranspl幼1ationfrom加n-heartbeatingdo加tsin飾influenceofviscosity油dtefflperatureofinitialflushingsolutkmsongraftftmctkm.LiverTransplSurgl柳:3:39-45.權利要求1.一種保持供體器官活力的器官保存和灌注溶液，含有一種組織培養基，其特征在于a)含有組織培養基的溶液的緩沖容量提高到β至少為20，b)加入至少一種高分子量化合物以提高膨脹壓，所述化合物選自葡聚糖、PEG、羥乙基淀粉(HES)和清蛋白，c)所述溶液的[Na+]濃度小于140mM，[K+]濃度小于25mM，[Na+]與[K+]的比例至少為2∶1，優選為5∶1。2.根據權利要求1的溶液，其中生理膨脹壓保持在20到35mmHg之間，優選大約25mmHg。3.根據權利要求1的溶液，其中生理滲量保持在300到400mOsm之間，優選300到350mOsm之間，最優選大約330mOsm。4.根據權利要求l的溶液，其中所述組織培養基選自最小必需培養基Eagle(MEM)、Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)、RPMI1640培養基、DMEM/F-12培養基、HamsF-10、HamsF12、Iscove改良Dulbecco培養基、LeibovitzL-15培養基、帶有Earle鹽的最小必需培養基、以及WilliamsE培養基。5.根據權利要求4的溶液，其中所述組織培養基是WilliamsE培養基。6.根據權利要求5的溶液，其中至少一種下列單種氨基酸的濃度相比標準WilliamsB的濃度提高2到10倍精氨酸、天冬酰胺、胱氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸。7.根據權利要求l的溶液，其中提供一種硒源，優選NaSe03.5H20。8.根據權利要求l的溶液，其中通過加入一種緩沖液來提供額外的緩沖容量，所述緩沖液選自HEPES、PIPES、M0PS、TES、BES、N，N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥曱基)曱基甘氨酸、Tris、檸檬酸鹽、組氨酸、KH2P04、K2HP04、Na跳。9.根據權利要求l的溶液，其中將25.000到45,000道爾頓，優選大約30，000道爾頓的高分子量化合物聚乙二醇(PEG)用作膠體添加劑。10.根據權利要求l的溶液，其中提供額外的抗氧劑，所述抗氧劑選自別噤呤醇、trolox、谷胱甘肽、維生素E、亞曱藍和抗壞血酸。11.根據權利要求l的溶液，其中加入額外的非透膜體，所述非透膜體選自棉子糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、木糖醇和乳糖酸鹽。12.—種保存器官的方法，所述方法包括將所述器官放置于權利要求1到ll任一項的溶液中。13.—種保存器官的方法，所述方法包括使用權利要求l到ll任一項的溶液清洗或沖洗所述器官。14.一種保存器官的方法，所述方法包括使用權利要求1到11任一項的溶液連續灌注或脈動灌注所述器官。15.根據權利要求14的方法，其中所述器官選自心臟、肺、胰、腎或肝。16.根據權利要求12或14的方法，其中溶液溫度在01C到20*€之間，優選在ox:到IO匸之間，并且該溶液是被氧合的。17.根據權利要求11到16任一項的方法，其中待移植器官從非心跳供體獲得。18.根據權利要求ll到17任一項的方法，其中所述器官是人器官。全文摘要本發明提供了一種適用于機械灌注的新的器官保存溶液，用于保持器官、器官的部分以及組織的活力。該溶液被設計為可以克服供體器官(特別是來自非心跳供體的器官)的低體溫機械灌注所帶來的多種問題。該溶液可防止或盡量減小由缺血、缺氧、能量和營養耗竭、酸化、低體溫和再灌注損傷所導致的副作用，這可通過對氨基酸、維生素、抗氧劑、高分子量添加劑提高濃度并優化它們的平衡，以及提高緩沖能力來實現。文檔編號A01N1/02GK101098622SQ200580046317公開日2008年1月2日申請日期2005年11月11日優先權日2004年11月12日發明者B·M·多爾肖特,M·貝西姆斯申請人:多爾燦德氣動股份有限公司