專利名稱：植物碳同位素標記的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及同位素示蹤技術領域，更具體涉及一種植物碳同位素標記的方法，同時還涉及植物碳同位素標記的裝置。本發明適合于高等院校和科研單位的研究人員對植物進行碳-14或碳-13同位素標記和示蹤研究中應用。
背景技術：
同位素示蹤技術由于其高度的靈敏性，被稱為繼顯微鏡技術發明后的又一大發明，在生物學科各領域的研究中已被廣泛應用。在土壤學研究中，土壤有機質不僅是土壤肥力重要的物質基礎，而且對于保持土壤團聚結構和保水通氣性能具有重要作用，研究土壤有機碳的循環與積累的研究對于保持土壤肥力和農業可持續發展具有重要的意義。同時土壤有機質的積累與分解和礦化對于大氣“溫室氣體”起著關鍵的調控作用，近20年來研究土壤碳循環已成為土壤學熱點問題之一。采用碳-14或碳-13示蹤技術是研究植物殘體在土壤中分解和轉化動力學以及植物根系分泌的有機碳量輸入土壤的關鍵手段，對于了解土壤有機質循環和積累以及為建立土壤有機質計算機模擬模型提供參數方面具有重要的作用。而植物碳同位素標記和示蹤技術是上述研究的基礎。由于通常只有氣體狀態的碳-14或碳-13標記的二氧化碳才能被植物吸收和利用，而且二種碳同位素價格均很貴，在進行標記時既要保證植物正常生長，又要嚴格密閉防止碳同位素標記的二氧化碳外逸，特別是由于碳-14標記的二氧化碳具有放射性。因此，建立合適的植物碳同位素標記的方法和裝置是非常重要的。
二十世紀六十年代英國土壤學家Jenkinson設計了一種生產碳-14同位素標記的植物的裝置，但較為復雜，不便于操作，而且箱內壓力控制方法存在缺陷，特別是在進行標記時加入鹽酸與碳-14標記的碳酸氫鈉時，因反應劇烈難于保證防止泄漏。此外該裝置由于采用液體培養方法進行植物生產，不僅易滋生藻類等非目標生物，而且與土壤中生長的植物可能存在差異，有些木本植物甚至很難在液體培養液中正常生長；且該方法也不適合用于研究植物根系分泌的有機物碳量。在國內很多研究者通常采用間歇標記法，即采用土壤盆栽的植物在自然空氣環境條件下進行生長，每隔一定時期將植物移入標記箱中進行碳同位素標記一天，該方法也存在難于嚴格控制標記的二氧化碳氣體的泄漏，也同樣不適合用于研究植物根系分泌有機碳量，且標記的植物材料中物質間碳同位素的標記強度不均一，不適合用于研究標記植物的有機碳在土壤中的分解和轉化。
發明內容
本發明的目的是在于提供一種植物碳同位素標記的方法，該方法簡便，易于操作，實用性廣，對植物進行碳同位素標記和研究植物根系向土壤輸入碳量。
本發明的另一個目的是在于提供一種碳同位素標記植物的裝置，該裝置結構簡單，成本低，易于制作，使用操作簡便，標記過程完全密閉，嚴格控制了碳-14或碳-13標記的二氧化碳泄漏，提高了碳-14或碳-13同位素材料的利用率，采用土壤栽培適合于各種植物的碳同位素標記和示蹤。
為了實現上述目的，本發明的植物碳同位素標記的方法，包括下列步驟A、在栽培盤中加入13-15公斤過2毫米孔徑篩的新鮮土壤，在土壤中噴施硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀營養液，將已發芽的種子播種于栽培盤土壤中，根據植物種類調節土壤含水量至飽和持水量的55％-105％，在23-27℃使小苗生長2-3天。
B、將栽培盤置于標記箱內底板上，在箱門和箱壁連接處涂一層高溫真空硅脂，擰緊穿過箱壁和箱門的所有螺絲，密閉箱門。關閉箱體左邊吸附瓶二端的閥門，打開箱體右邊吸附瓶二端的閥門，開啟真空泵抽真空，使箱體內真空度到達-0.01至-0.02Mpa；關閉吸附瓶二端的閥門，關閉真空泵；24小時后壓力計上負壓力沒有變化，表明箱體密閉性良好。
C、在密閉條件下緩慢加入碳-14(或碳-13)標記的碳酸納溶液與鹽酸溶液于反應槽中，反應產生碳-14(或碳-13)標記的二氧化碳供植物進行光合作用生長。
D、箱體內采用電風扇混勻產生的二氧化碳。用日光燈補充光照。采用冷卻水流經冷卻管降低箱內溫度至24-26℃，降低箱體內空氣相對濕度至65％-75％。通過輸液瓶向栽培盤中補充水或硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀營養液。反應槽中的反應殘液通過殘液排出管排出箱外，箱內冷凝水通過冷凝水排出管排出箱外。
E、栽培結束時，殘留箱內的碳-14(或碳-13)標記的二氧化碳采用真空泵抽氣使其通過吸附瓶時吸附于氫氧化鈉溶液中。然后打開箱門，完整地取出植株，經洗凈、殺青、烘干后得到碳-14(或碳-13)標記的植物。
實現上述標記的方法，必須依靠本發明的裝置才能完成，該裝置包括一個密閉的聚乙烯板制成的箱體置于木質箱架上。箱體左右二邊各設一個圓型箱門，箱門通過穿過箱壁和箱門的16-18個螺絲固定在箱壁上。箱頂內壁安裝2-4根日光燈，日光燈電源線穿過箱壁至箱外，再通過開關與電源相連。箱體左右二邊內壁各安裝一個電風扇，電風扇電源線穿過箱壁至箱外，在通過開關與電源相連。箱體左右二邊內壁各安裝一個總長為1-1.5米的銅質蛇型冷卻管，冷卻管二端穿過箱壁，再通過閥門分別與冷卻水進水管和排水管連接。箱內底板上放置3-4個栽培盤。箱內底板左邊放置一個反應槽，反應槽底部安裝一根反應殘液排出管，殘液排出管穿過反應槽壁和箱壁至箱外，再與閥門連接。箱體右邊底部安裝一根冷凝水排出管，冷凝水排出管穿過箱壁至箱外，再與閥門連接。箱體左邊安裝3-4個裝有氫氧化鈉溶液的吸附瓶，吸附瓶之間用橡膠管連接；吸附瓶一端通過橡膠管連接閥門，再通過橡膠管穿過箱壁與箱內連通，吸附瓶另一端通過橡膠管連接閥門，再與大氣連通。箱體右邊也安裝3-4裝有氫氧化鈉溶液的吸附瓶，吸附瓶之間也用橡膠管連接，吸附瓶一端通過橡膠管連接閥門，再通過橡膠管穿過箱壁與箱內連通，吸附瓶另一端通過橡膠管連接閥門，再與無油真空泵連接。箱體正面外壁左邊分別固定一個鹽酸輸液瓶和一個碳-14或碳-13標記的碳酸溶液輸液瓶，輸液瓶下端分別連接一根帶壓閥開關的塑料輸液管，輸液管下端分別穿過箱壁進入箱內，然后置于反應槽中。箱體正面外壁右邊固定3-4個營養液輸液瓶，輸液瓶下端分別連接一根帶壓閥開關的塑料輸液管，輸液管下端穿過箱壁進入箱內，再置于栽培盤中。箱體左邊壁上安裝一根溫度計，溫度計探頭穿過箱壁置于箱內空氣中。箱體左邊壁外安裝一個彎管式壓力計，壓力計一端穿過箱壁與箱內連通，另一端置于箱外與大氣連通，彎管壓力計內加入液體石蠟。整個箱體嚴格密閉，穿過箱壁所有管道周圍用玻璃膠密封。
本發明具有以下優點1.在密閉條件下緩慢加入碳-14(或碳-13)標記的碳酸納溶液與鹽酸溶液于反應槽，可防止反應過于劇烈，產生的碳-14或碳-13標記的二氧化碳沒有任何外逸損失；2.整個栽培期中植物都在密閉箱內生長，不僅提高了碳-14(或碳-13)同位素原料的利用效率，且標記的植物中碳同位素具有很好的均一性；3.采用土壤栽培比用液體栽培更適合于各種植物的生產，特別是木本植物，且生長的植物更接近自然條件栽培的植物4.采用冷卻管不僅可降低箱溫度，而且可降低箱內由于密閉帶來的高濕度，同時采用日光燈補充光照，這樣更有利于植物正常生長；5.箱內安裝了風扇，使空氣流動保證了箱內空氣中碳-14(或碳-13)標記的二氧化碳均勻，使植株間碳同位素的標記強度相同；6.箱內按裝了溫度計和壓力計，有利于隨時了解箱內溫度和壓力并對其進行調控7.該裝置結構簡單、成本低，操作方法簡便、安全；8.實用性廣，不僅適合于直接對植物進行碳同位素標記，且適合于植物根系向土壤輸入(分泌)的碳量以及植物的光合作用等方面研究的使用。
圖1為植物碳同位素標記裝置的示意圖。
具體實施例方式
本發明的植物碳同位素標記的方法，包括下列步驟A、在栽培盤中加入土壤，取相當于烘干重40-60公斤有機質含量較低的新鮮表層(0-20厘米)土壤，去掉可見的植物殘體，適當風干后，過2毫米孔徑篩，在土壤中均勻地噴施硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀混合溶液，施入的氮、磷和鉀量分別為80、20和80毫克/公斤土，將土壤分裝于長×寬×高為45×45×15厘米的栽培盤中，每盤裝土壤13-15公斤。將水稻或玉米等種子先用水清洗，置于墊有濾紙的培養皿中，加入10毫升蒸餾水，將培養皿置于25℃下培養3-4天，使種子發芽。將已發芽的水稻或玉米等種子播種到栽培盤中，根據植物種類調節土壤含水量至飽和持水量的55％-105％。在23-27℃使小苗生長2-3天。
B、將栽培盤置于標記箱中，在箱門和箱壁連接處涂一層高溫真空硅脂，擰緊穿過箱壁和箱門的16-18個螺絲，密閉箱門。在彎管式壓力計中加入液體石蠟。在箱兩端的吸附瓶中加入200毫升2摩爾氫氧化鈉溶液。先關閉箱左邊吸附瓶兩端的閥門，用真空泵抽氣使箱內形成-0.01至-0.02Mpa真空度，當壓力計彎管兩邊液體石蠟液面相差為3-5厘米時，關閉箱左邊吸附瓶兩端的閥門，24小時后壓力計彎管兩邊液體石蠟液面差沒有明顯變化時，表明箱體密封良好可進行下一步植物標記操作。
C、通過碳酸鈉溶液輸液瓶加入碳-14(或碳-13)標記的碳酸鈉溶液300-500毫升于反應槽中，采用碳-14標記時其碳酸鈉濃度為1摩爾，碳-14放射性強度為0.15-0.25毫居里，且該碳酸鈉溶液中加有3-4滴酚酞指示劑。再通過鹽酸輸液瓶加入2.5摩爾鹽酸溶液300-500毫升于反應槽中，通過調節輸液管上閥門使鹽酸溶液在12-24小時內慢慢滴完，以防止反應劇烈。當反應液變為紅色時，表明碳酸鈉已反應完全。根據植物生長情況每周加入1-2次碳-14標記(或碳-13)的碳酸鈉和鹽酸溶液。
D、標記栽培過程中，開啟箱內電風扇使氣體中碳-14標記的二氧化碳濃度均勻；開啟冷卻水通過蛇形冷卻管降低箱內溫度和空氣濕度，每天觀察和記錄箱內溫度1-2次，箱內溫度保持應在24-26℃左右；開啟日光燈12小時以補充光照；根據植物生長情況和栽培盤中土壤干濕程度，通過營養液輸液瓶加入硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀混合營養液或者水溶液；反應槽中完全反應的廢液通過打開反應殘液排出管閥門排出箱外，箱內水蒸氣冷凝后聚集的冷凝水通過打開冷凝水排出管閥門排出箱外。
E、通常標記栽培60-90天即可達到所需要的植物生物量，此時結束栽培。在結束栽培前一周停止加入碳-14(或碳-13)標記的碳酸鈉溶液。然后打開吸附瓶兩端的閥門，開啟真空泵使殘留在箱內氣體中的碳-14(或碳-13)標記二氧化碳通過氣流吸附到氫氧化鈉溶液中。再打開標記箱兩邊的箱門，取出栽培盤，加水淹沒栽培盤中土壤，浸泡4-8小時。然后輕輕從栽培盤土壤中取出植株，應盡量保持植株根系完整，小心地用水清洗植株上殘留的土壤，瀝干植株上的水。再置于烘箱中經80-105℃殺青30分鐘后，在50-60℃條件下烘干，得到碳-14(或碳-13)標記的植物材料。標記的植物材料經粉碎，測定其碳-14(碳-13)放射性強度(或風度)后，即可用于植物殘體碳在土壤中轉化和循環等方面的研究。此外，通過測定栽培盤中土壤殘留的碳-14(或碳-13)標記的有機碳放射性強度(或風度)，可計算得到植物根系分泌的有機碳量。(見下表)標記箱法栽培碳-14標記的水稻生物量及其放射性強度(表1)
試劑配制1、硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀混合溶液20.0g(NH4)2SO4、4.08g NaH2PO4、8.0g KCl溶于蒸餾水定容至2L。
2、氫氧化鈉溶液(2mol/L)80.0化學純NaOH溶于蒸餾水定容至1L。
3、鹽酸溶液(2mol/L)167.0ml化學純濃鹽酸(HCI，比重為1.19g/ml)溶于蒸餾水釋釋到1L。
4、碳-14標記的碳酸鈉溶液1166.0g Na2CO3溶于10L蒸餾水，加入5毫居里C14-Na2CO3，得碳-14標記的碳酸鈉溶液。
5、碳-13標記的碳酸鈉溶液583.0g豐度為10Atom％的C13-Na2CO3溶于5L蒸餾水。
本發明的方法的裝置如圖1所示，箱體1由厚12毫米的聚乙烯板制成，其長×寬×高為2.5-2.8×1.3-1.5×1.0-1.5米，箱體1嚴格密封，箱體1置于長×寬×高為2.5-2.8×1.3-1.5×0.4-0.6米的木質箱架10上。箱體1左右二邊壁上各設一個直徑為40-50厘米的圓型聚乙烯板箱門2(箱門2或為橢圓型或正方形或長方形)，箱門2通過穿過箱壁和箱門2的16-18個螺絲固定在箱壁上。箱頂內壁安裝2-4根40瓦的日光燈3，日光燈3電源線穿過箱壁至箱外，再通過開關與電源相連，日光燈3的作用為增加光照。箱體1左右二邊內壁各安裝一個30-50瓦的電風扇4，電風扇4電源線穿過箱壁至箱外，再通過開關與電源相連，電風扇4的作用是混合箱內氣體。箱體1左右二邊內壁各安裝一個總長為1-1.5米的銅質蛇型冷卻管5，冷卻管5二端穿過箱壁，再通過閥門與冷卻水管連接，冷卻管5的作用為降低箱內溫度和濕度。箱內底板上放置3-4個長×寬×高為45×45×15厘米的聚乙烯栽培盤6，栽培盤6內放有土壤用于栽培植物。箱內底板左邊還放置一個長×寬×高為25×15×45厘米的聚乙烯反應槽7，用于碳-14(碳-13)標記的碳酸鈉溶液與鹽酸溶液反應產生碳-14(碳-13)標記的二氧化碳，供作物生長利用。反應槽7底部安裝一根玻璃反應殘液排出管8，殘液排出管8穿過反應槽7壁和箱壁至箱外，再與閥門連接，用于反應殘液排出。箱體1右邊底部安裝一根玻璃冷凝水排出管9，冷凝水排出管9穿過箱壁至箱外，再與閥門連接，用于箱內冷凝水排出。箱體1左邊安裝3-4個400毫升的吸附瓶11，吸附瓶11內裝有200-250毫升2摩爾的氫氧化鈉溶液；吸附瓶11之間用橡膠管連接，吸附瓶11一端通過橡膠管連接閥門，再通過橡膠管穿過箱壁與箱內連通，吸附瓶11另一端通過橡膠管連接閥門，再與大氣連通，吸附瓶11的作用主要是栽培結束時吸收箱內殘余的碳-14(碳-13)標記的二氧化碳氣體。箱體1右邊同樣安裝3-4裝有氫氧化鈉溶液的吸附瓶11，吸附瓶11之間也用橡膠管連接，吸附瓶11一端通過橡膠管連接閥門，再通過橡膠管穿過箱壁與箱內連通，吸附瓶11另一端通過橡膠管連接閥門，再與無油真空泵12連接，真空泵12的作用是抽真空或箱內氣體。箱體正面外壁左邊分別固定二個500毫升的輸液瓶13、14，一個為2摩爾的鹽酸溶液輸液瓶13，一個為1摩爾的碳-14(或碳-13)標記的碳酸納溶液輸液瓶14，輸液瓶13、14下端分別連接一根帶壓閥開關的塑料輸液管16，輸液管16下端分別穿過箱壁進入箱內，再置于反應槽7中，分別用于輸送鹽酸溶液和碳-14(或碳-13)標記的碳酸納溶液至反應槽7中。箱體1正面外壁右邊固定3-4個500毫升的輸液瓶15，輸液瓶15下端分別連接一根帶壓閥開關的塑料輸液管16，輸液管16下端穿過箱壁進入箱內，再置于栽培盤6中，用于輸送氮磷鉀營養液或者水至栽培盤6中。箱體1左邊壁上安裝一根量程100度的溫度計17，溫度計探頭穿過箱壁置于箱內空氣中，用于觀察箱內溫度。箱體1左邊壁上安裝一個高度為50-80厘米高的玻璃彎管式壓力計18，壓力計18一端穿過箱壁與箱內連通，另一端置于箱外與大氣連通，壓力計18彎管內裝液體石蠟，用于觀察箱內壓力變化。箱壁所有穿過管道處均用玻璃膠密封，以保證箱體嚴格密封。
權利要求
1.一種植物碳同位素標記的方法，其特征在于它包括下列步驟A、在栽培盤中加入新鮮土壤，在土壤中噴施硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀營養液，將已發芽的種子播種于栽培盤土壤中，調節土壤含水量，在23-27℃使小苗生長2-3天；B、將栽培盤置于標記箱內底板上，在箱門和箱壁連接處涂一層高溫真空硅脂，擰緊穿過箱壁和箱門的螺絲，密閉箱門，關閉箱體左邊吸附瓶二端的閥門，打開箱體右邊吸附瓶二端的閥門，開啟真空泵抽真空，使箱體內真空度到達-0.01至-0.02Mpa，關閉吸附瓶二端的閥門，關閉真空泵；C、在密閉條件下加入碳-14或碳-13標記的碳酸納溶液與鹽酸溶液于反應槽中，反應產生碳-14標記的二氧化碳供植物進行光合作用生長；D、箱體內采用電風扇混勻產生的二氧化碳，用日光燈補充光照，采用冷卻水流經冷卻管降低箱內溫度至24-26℃，降低箱體內空氣相對濕度至65％-75％，通過輸液瓶向栽培盤中補充水或硫酸銨、磷酸二氫鈉和氯化鉀營養液，反應槽中的反應殘液通過殘液排出管排出箱外，箱內冷凝水通過冷凝水排出管排出箱外；E、栽培結束時，殘留箱內的碳-14標記的二氧化碳采用真空泵抽氣使其通過吸附瓶時吸附于氫氧化鈉溶液中，然后打開箱門，取出植株，經洗凈、殺青、烘干后得到碳-14標記的植物。
2.一種用于實現權利要求1所述的植物碳同位素標記方法的裝置，其特征在于箱體(1)左右各設一個箱門(2)，箱門(2)穿過箱壁和箱門(2)的螺絲固定在箱壁上，箱頂內壁安裝日光燈(3)，箱體(1)二邊內壁各安裝一個電風扇(4)，箱體(1)二邊內壁各安裝銅質蛇型冷卻管(5)，箱內底板放置反應槽(7)，反應槽(7)底部安裝反應殘液排出管(8)，殘液排出管(8)穿過反應槽(7)壁和箱壁至箱外，再與閥門連接，箱體(1)底部安裝冷凝水排出管(9)，冷凝水排出管(9)穿過箱壁至箱外，再與閥門連接，箱體(1)左邊安裝盛有氫氧化鈉溶液的吸附瓶(11)，吸附瓶(11)之間用橡膠管連接，吸附瓶(11)通過橡膠管連接閥門，再通過橡膠管穿過箱壁與箱內連通，吸附瓶(11)另一端通過橡膠管連接閥門，再與大氣連通，箱體(1)右邊安裝盛有氫氧化鈉溶液的吸附瓶(11)，箱體(1)外壁分別固定鹽酸輸液瓶(13)和一個碳-14或碳-13標記的碳酸溶液輸液瓶(14)，輸液瓶(13、14)下端分別連接一根帶壓閥開關的塑料輸液管(16)，輸液管(16)下端分別穿過箱壁進入箱內，然后置于反應槽(7)中，箱體(1)外壁固定輸液瓶(15)，輸液瓶(15)下端分別連接一根帶壓閥開關的塑料輸液管(16)，輸液管(16)下端穿過箱壁進入箱內，再置于栽培盤(6)中。
3.根據權利要求2所述的一種植物同位素標記方法的裝置，其特征在于吸附瓶(11)之間用橡膠管連接，吸附瓶(11)一端通過橡膠管連接閥門，再通過橡膠管穿過箱壁與箱內連通，吸附管(11)另一端通過橡膠管連接閥門，再與真空泵(12)連接。
4.根據權利要求2所述的一種植物同位素標記方法的裝置，其特征在于箱體(1)上裝溫度計(17)，壓力計(18)。
全文摘要
本發明公開一種植物碳同位素標記的方法及裝置，將種子播種于裝在土壤的栽培盤中，將栽培盤置于密閉標記箱中。在密閉條件下加入碳－14或碳－13標記的碳酸納與鹽酸溶液于反應槽中，反應產生二氧化碳供植物光合作用。箱內采用電風扇混勻二氧化碳，用日光燈補充光照，以冷卻管降低溫度和濕度。通過輸液瓶向栽培盤中補充水分。栽培結束后取出植株，得到碳－14或碳－13標記的植物。該發明方法操作方便、安全，可防止碳同位素標記的二氧化碳外逸，提高了碳同位素原料的利用率，適合于對各種植物進行碳同位素標記，特別是木本植物。
文檔編號A01G9/18GK101015248SQ20061001974
公開日2007年8月15日 申請日期2006年7月28日 優先權日2006年7月28日
發明者肖和艾, 吳金水, 李玲, 唐國勇 申請人:中國科學院亞熱帶農業生態研究所