專利名稱：：微藻培養生產同位素葡萄糖的方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用微藻生物合成生產同位素葡萄糖的方法，包括培養基的配置，光生物反應器的構建，微藻的接種和擴種以及微藻在光生物反應器中的培養等環節。
背景技術：
：同位素葡萄糖是指由碳或氫等元素的同位素構成的葡萄糖。例如標記有碳13，碳14，氘或氚等同位素的葡萄糖。同位素葡萄糖是生物技術研究用新型試劑，在生物工程和新醫藥產業有特殊的應用。一般的葡萄糖廣泛地用于生物工程和新醫藥產業，幾乎是所有的數以萬計的生物過程的主要原材料。有了同位素葡萄糖，就可以非常容易地利用現有的成熟的生物工程工藝生產數以萬計的同位素生化分子。這些同位素生化分子在當代生命科學產業中有著特殊的，甚至在某些情況下不可替代的應用。例如用碳13葡萄糖制備的穩定性同位素蛋白質，核酸和多糖等大分子可以用于大分子結構研究。同位素葡萄糖的制備有化學合成和生物合成兩種方法。同位素葡萄糖的生物合成一般用微藻培養的方法。在微藻培養基里提供無機同位素的碳或氫同位素，微藻通過進行光合作用，合成淀粉，蛋白質和脂肪等生物大分子。將這樣培養的微藻中的淀粉分離純化，再水解則可獲得同位素葡萄糖。
發明內容本發明的目的是提供一種生物合成同位素葡萄糖的方法。包括培養基的配置，光生物反應器的構建，微藻的接種和擴種以及微藻在光生物反應器中的培養等環節。本發明的方法實現同位素100％的利用和高產率同位素葡萄糖的生產。本發明的方法具體步驟如下1.選擇藻種和配置同位素微藻培養基本發明采用螺旋藻作為藻種來生產同位素葡萄糖。本發明采用如下所述的兩種培養基，分別用于螺旋藻的擴種和在光生物反應器中的培養。用于擴種的培養基配方是13C碳酸氫鈉16.8g/L硝酸鈉2.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L用于光生物反應器培養的培養基配方是氫氧化鈉0.1g/L硝酸鈉0.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L2.構建全封閉式光生物反應器本發明采用特殊的全封閉式光生物反應器來培養微藻。全封閉式光生物反應器由以下裝置組成A、反應器主單元，為20L塑料透明桶，開有3個可以傳輸氣體或液體的進出口，還開有一個可以密封放置pH電極的開口。B、反應器光源，為6盞25WT5日光燈，在反應器主單元周圍均勻放置。C、氧氣吸收裝置，為10L容器內置20g/L硫酸鈉溶液。D、真空氣泵，為10L/min的真空氣泵，從反應器主單元吸取尾氣，將氣體通過氧氣吸收裝置再泵回反應器主單元。E、pH控制系統，包括pH探頭，pH計，自控電磁閥和同位素二氧化碳供給裝置。F、溫控裝置，為一溫控水浴裝置，置于反應器底部。請參見光生物反應器的示意圖。3.微藻的接種和擴種取5ml普通螺旋藻液加入到用于200ml擴種的同位素培養基中，培養一段時間，在螺旋藻濃度達到大約0.6g/L的時候，轉移到1L的用于擴種的同位素培養基中，待螺旋藻濃度達到大約0.6g/L的時候，接種到光生物反應器。4.微藻光生物反應器的培養向微藻光生物反應器中放19L的用于培養的微藻培養基，控制光照600-1000uE，控制溫度26-28度，控制通氣量0.4-0.6L/min，通過向培養基輸入同位素二氧化碳控制pH8.8-9.2。待系統平衡后，接種1L螺旋藻液到光生物反應器。維持光生物反應器的生長條件，大約8天，螺旋藻濃度會達到1.0-1.2g/L。這時停止光反應器運行，采收藻液，分析葡萄糖含量。附圖是本發明的光生物反應器的結構示意圖。圖中1是反應器主單元2是反應器光源3是氧氣吸收裝置4是真空氣泵5是pH電極6是pH控制器7是同位素二氧化碳氣瓶8是氣體導管9是亞硫酸鈉溶液10是微藻培養液具體實施方式1.配制擴種用同位素微藻培養基向燒杯中倒入5L蒸餾水，向其中加入各種營養成分如下13C碳酸氫鈉84g硝酸鈉12.5g硫酸鉀5.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g硫酸鎂1.0g氯化鈣0.2g硫酸亞鐵0.05g乙二胺四乙酸二鈉0.4g硼酸14mg氯化錳9mg硫酸鋅1.1mg硫酸銅400ug鉬酸鈉200ug礬酸銨110ug硫酸鉻鉀480ug硫酸鎳240ug鎢酸鈉85ug硫酸鈦200ug硝酸鈷220ug2.配制培養用同位素微藻培養基向塑料桶中加入蒸餾水20L，向其中加入各種營養成分如下氫氧化鈉2g硝酸鈉10g硫酸鉀20g氯化鈉20g磷酸氫二鉀10g硫酸鎂4g氯化鈣0.8g硫酸亞鐵0.2g乙二胺四乙酸二鈉0.4g硼酸560mg氯化錳36mg硫酸鋅4.4mg硫酸銅1.6mg鉬酸鈉800ug礬酸銨440ug硫酸鉻鉀1.9mg硫酸鎳960ug鎢酸鈉340ug硫酸鈦800ug硝酸鈷880ug3.螺旋藻擴種取5ml普通螺旋藻液加到裝有200ml擴種用同位素微藻培養基的500ml三角瓶中，放置日光燈下培養8天，測量藻液濃度為0.65g/L。將藻液轉移到有1000ml擴種用同位素微藻培養基的2L三角瓶中，放置日光燈下培養4天，測量微藻濃度為0.68g/L.4.構建光生物反應器將反應器主單元，反應器光源，氧氣吸收裝置，真空氣泵，pH控制系統，和溫控裝置按示意圖所示組裝(標點)，加入19L培養用同位素微藻培養基，調整溫度控制設定為26-28度，pH控制為8.8-9.2，檢查氣泵的鼓氣量在0.4-0.6期間，調整日光燈和反應器主單元的距離，使反應器主單元表面的光量子通量為600-1000uE。5.微藻在光生物反應器中的培養將步驟3擴大的螺旋藻液接種到光生物反應器里，控制反應條件不變，培養8天，觀察到螺旋藻顏色轉黃，取藻液測量微藻濃度為1.2g/L，測量淀粉濃度為0.8個/L，葡萄糖含量約68％。參考文獻1.ZviE.KahanaandAvivaLapidot.AdaptionofBiotechnologicalProcessesforPreparationofCompoundsLabeledwithStableIsotopes.SynthesisandApplicationofIsotopicallyLabeledCompounds1985.ProceedingsoftheSecondInternationalSymposium，KansasCity，MO，USA.，3-6September1985，R.R.Muccino(Ed.)，511-512.2.PaulW.Behrens，ValerieJ.SicotteandJacquesDelente.MicroalgaeasaSourceofStableIsotopicallyLabeledCompounds.JournalofAppliedPhycology6113-121，1994.3.RichardJ.RadmerandBruceC.Parker.CommercialApplicationofAlgaeOpportunitiesandConstraints.JournalofAppliesPhycology693-98，1994.4.XiaJinlan，NieZhenyang，andJ.M.Levert.Biosynthesisof13C-labeledAminoAcidandSugarsbySpirulina(Arthrospira)inaParallelepipedPhotobioreactor.ChineseJournalofChemicalEngineering10(5)592-596(2002)5.FranciscoG.AcienFernandez，CelesteBrindleyAlias，MariaC.Carcia-MaleaLopez，JoseM.FernandezSevilla，MariaJ.IbanezGonzalezRafaelNunezGomez，EmilioMolinaGrima.AssessmentoftheProductionof13C-labeledCompoundsfromPhototrophicMicroalgaeatLaboratoryScale.BiomolecularEngineering20(2003)149-162.6.HeinerKBerthold，DavidL.Hachey，PeterJ.ReedsP.Thomas，ScotHoeksemaandPeterD.Klein.Uniformly13C-labeledAlgalProteinUsedtoDetermineAminoAcidEssentialityinvivo.ProceedingsofNationalAcademyofSciencesUSA88(9)8091-80951991.7.GernaldineBrandner，VincentPhalip，EstherKellenbergerandCheng-caiZhang.OptimizationofaCyanobacterialCultureusedforProductionofIsotopes-labelledRecombinantProteins.BiotechnologyTechniques13177-180，19998.TakanoriKigawa，TakashiYabuhi，YasuhiloYoshida，MichioTsutsui，YutakaIto，TakehikoShibata，ShigeyukiYokoyama.Cell-freeProductionandStable-IsotopeLabelingofMilligramQuantitiesofProteins.FEBSLetters442(1999)15-199.ElizabethBoyle-Roden，J.B.German，andB.J.B.Wood.TheProductionofLipidsAlternativelyLabelledwithCarbon-13.BiomolecularEngineering20(2003)285-28910.Ross，W.Kessler，D.Krumme，U.Menge，J.Wissing，J.vandenHeuvel，andLFlohe.OptimizedFermentationStrategyfor13C/15NRecombinantProteinLabellingInEscherichiacoliforNMR-structureAnalysis.JournalofBiotechnology108(2004)31-39權利要求1.一種利用封閉式光生物反應器微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，包括以下步驟A、選擇微藻藻種和配置同位素微藻培養基選擇一種適宜的微藻作為生產用藻種，配置兩種培養基，分別用于微藻的擴種和培養。B、光生物反應器的構建利用透明的細胞培養設備，加上人工光源、溫度控制、pH值控制、真空氣泵、氧氣吸收器等裝置，構建用于培養微藻的全封閉式光生物反應器。C、微藻的擴種將微藻接種到用于擴種的培養基里，用三角瓶擴大培養微藻，使其達到一定的濃度和體積。D、藻的光生物反應器培養將達到一定濃度和體積的微藻液接種到生物反應器內，在一定的光線溫度、pH值條件和鼓氣量的條件下，培養微藻，并在一定濃度下采收藻液。2.如權力要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用螺旋藻作為生產藻種。3.如權力要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用含有以下成分的培養基用于微藻的擴種13C碳酸氫鈉16.8g/L硝酸鈉2.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L4.如權力要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用含有以下成分的培養基用于微藻的培養氫氧化鈉0.1g/L硝酸鈉0.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L5.如權力要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用特制的封閉的帶有氧氣吸收器的光生物反應器，在控制的光照、溫度、pH值和鼓氣量的條件下培養微藻生產同位素葡萄糖。6.如權力要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權力要求3所述的用于擴種的培養基在三角瓶中擴大培養微藻，在濃度為0.6g/L細胞干重的情況下接種微藻細胞到如權利要求5所述的光生物反應器中。7.如權利要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權利要求5所述光反應器進行培養時，控制光照條件為600-1000uE。8.如權利要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權利要求5所述光反應器進行培養時，控制溫度為26-28度。9.如權利要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權利要求5所述的光反應器進行培養時，控制pH值為8.8-9.2。10.如權利要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權利要求5所述的光反應器進行培養時，控制鼓氣量為0.4-0.6L/L。11.如權利要求1所述的一種微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權利要求5所述的光生物反應器進行培養時，在微藻濃度為1.0-1.2g/L時進行采收。全文摘要本發明公開了一種利用封閉式光生物反應器微藻培養生產同位素葡萄糖的方法，包括封閉式光生物反應器的構造和微藻培養的生產工藝。采用封閉的真空氣泵循環使用同位素二氧化碳，避免了昂貴的同位素二氧化碳的流失，使同位素二氧化碳的利用率可達到100％。采用適宜的微藻品種和優化的微藻培養基，提高了微藻葡萄糖含量，含量高達細胞干重的60－80％。文檔編號C12P19/00GK1810978SQ20051000669公開日2006年8月2日申請日期2005年1月27日優先權日2005年1月27日發明者李健,毛延發,劉小玲申請人:深圳市東西方生物技術有限公司