通過對經工程化而耐受逆境的植物施用新煙堿類化合物增強其逆境耐受性的制作方法

專利名稱：通過對經工程化而耐受逆境的植物施用新煙堿類化合物增強其逆境耐受性的制作方法
通過對經工程化而耐受逆堍的植物施用 新煙堿類化合物增強其逆境耐受性提供增強植物和其細胞逆境耐受性的方法，其中將新煙堿類化合物(例如但不限于吡蟲啉(imidacl叩rod)、噻蟲胺(clothianidin)、瘞蟲溱 (thiamethoxam) 、 p夫蟲胺(dinotefuran)、 烯蟲靈(nitenpyram) 、 ？比蟲；青 (acetamiprid)或噻蟲啉(thiacloprid))施用于植物或其細胞，其中所述植 物或其細胞包含經過修飾從而使所述植物或其細胞更耐受逆境的基 因組，即是經工程化從而耐受逆境的植抹。與基因修飾型逆境耐受性 植物或其細胞聯用的特別有效的逆境耐受增效劑是包含氯吡咬側鏈 的新煙堿類化合物，如吡蟲啉、p塞蟲啉、吡蟲清、烯蟲靈和6-氯煙酸 (6-CNA)。
背景技術：
經工程化從而耐受逆境的植物在本領域是已知的。植物細胞和植 物的逆境耐受性可以通過如降低內源性聚ADP-核糖聚合酶(ParP)或 聚(ADP-核糖)糖原水解酶的水平或活性而達到，如WO 00/04173 Al 和PCT/EP2004/003995所述。據認為，以這種方式，可以避免或足以 延遲經受了逆境條件的植物細胞中的導致創傷性細胞死亡的致死性 NAD和ATP缺乏，從而使經受逆境的細胞存活并適應所述逆境條件。歐洲專利申請第04077624.7號中描述，植物和其細胞的逆境耐受 性可以通過使用編碼參與NAD拯救合成途徑和/或NAD從頭合成途 徑的酶的核苷酸序列，例如在植物中過表達來達到。為除了昆蟲控制以外的目的，在植物中施用新煙堿類化合物，在 本領域也是已知的(WO 01/26468 A2， WO 03/096811 Al)。WO 01/26468 A2公開了 一種改善植物生長的方法，其包括在植 物或其所在地施用至少一種選自新煙堿類的化合物。WO03/096811 Al描述，可以通過用新煙堿類化合物處理植物種 子，可以在昆蟲侵襲水平低于顯示需要應用殺蟲劑以防制昆蟲之水平 的場所增加或改善農作物的產量和/或活力。該方法褲認為可用于非轉基因植物和具有編碼用于產生修飾型蘇云金芽孢桿菌(^7C/〃1^Awhwg/ewwi) 5-內毒素蛋白的外源基因的才直物。但是，本領域沒有提及下迷可能性通過施用化合物，增強諸如 本領域所述的逆境耐受性植物的健康狀況和活力，此外，還進一步增 強已經過工程化而成為逆境耐受性的植物的逆境耐受性。發明概述簡言之，本發明是涉及一種增強經工程化而成為逆境耐受性植物 和植物細胞的逆境耐受性的新方法，其包括用新煙堿類化合物處理植 物和/或該植物的生境、植物細月包或培育出該植物的種子。本發明還涉及一種增強經工程化從而耐受逆境的植物和植物細 胞的健康狀況和活力的新方法，其包括用新煙堿類化合物處理植物和 /或所述植物的生境、植物細胞或用于培育所述植物的種子。本發明還涉及一種用于培育逆境耐受性植物的新種子，它是被新 煙堿類化合物處理過。詳述在此處，"經工程化從而耐受逆境的植抹"或"經工程化從而耐受 逆境的植物細胞"，是指含有外源性DNA的植物或細胞和種子，所述 外源性DNA包含外源性逆境耐受性增強基因或對應于所述外源性逆 境耐受性增強基因的內源基因的變異體，所述變異體導致含有該變異 體的植物細胞或植物的逆境耐受性更高。依據本發明，已經發現用有效量的新煙堿類化合物處理經工程 化從而耐受逆境的植物或所述才直物的種子和/或所述植物的生境，可增 強所述植物的逆境耐受性、健康狀況和活力。令人驚訝的是，這些新煙堿類化合物有能力導致那些已經比相應的野生型有更高逆境耐受 性的植物在抗逆性和健康狀況方面得到增強。這種效應甚至超過了由僅依賴于下述性能和效應的加性效應所能預期的新煙堿類化合物施 用于植物時的生長增強性能(如WO 01/26468 A2中描述的)，和給定植 沖朱經工程化的耐受逆境性的效應。該效應并不依賴作為上述新煙石咸類 化合物的輩巴的昆蟲的存在。因此，該效應與植物或植物細胞或用于培 育植物的種子的逆境耐受性的生物化學改進相關聯。已經發現，該效 應提高了這些工程化植物和植物細胞的遺傳工程化逆境耐受性。在此處，"逆境耐受性"是指當植林遭遇逆境時，與非工程化植株 相比，具有對逆境的更強耐受性，這些逆境如施用化合物(如除草劑、 殺菌劑、殺蟲劑、植物生長調節劑、輔助劑、肥料)、暴露于非生物脅 迫(如干旱、強光照條件、極端溫度、臭氧和其他大氣污染物、土壤鹽 度或重金屬)或生物脅迫(如病原體或病害感染包括感染真菌、病毒、 細菌、昆蟲、線蟲、支原體和支原體樣有機體等)。在本發明的一個實施方式中，描述了可用于提高經工程化從而耐 受逆境的植物或植物細胞或用于培育該植物的種子的逆境耐受性和 健康狀況的方法，所述方法包括對所述植物和/或其生境、植物細胞或 用于培育所述植物的種子施用有效量的式(I)新煙^5威類化合物，<formula>formula see original document page 9</formula> (I)其中Het表示在各種情況下任選被氟、氯、曱基或乙基單取代或多取代的 雜環，所述雜環選自以下雜環吡啶-3-基、吡啶-5-基、3-吡啶基、l-氧化-5-吡啶基、1-氧化-5-p比咬基、四氫呋喃-3-基、p塞唑-5-基， A表示C廣C6-烷基、-N(R"(R2)或S(R2), 其中R1 表示氫、C「C6-烷基、苯基-CrCV烷基、C3-CV環烷基、CrC6-烯基或CrC6-炔基，和 R2 表示C,-CV烷基、C2-CV烯基、C2-(V炔基、-C(=0)-CH3或R表示氬、C廣C6-烷基、C2-C6-烯基、CrC6-炔基、-(:(=0)-013或千 基，或者同f一起表示下列基團-CH2-CH2- 、 -CH2-CH2-CH2- 、 -CH2-OCH2- 、 -CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2-， -CH2-N(CH3)-CH2-， X表示N-N02、 N-CN或CH-N02。飽和或不飽和的烴基，如烷基或烯基，只要可能則在各種情況下 可以是直鏈或支鏈，包括與雜原子結合，例如，在烷氧基中。這些化合物已知具有殺蟲活性(參見例如EP-A1-192 606、 EP-A2-580 533、 EP-A2-376 279、 EP-A2-235 725)。可提及的優選式(I)化合物是在"The Pesticide Manual",第13版, 2003 (British Crop Protection Council)中列舉的新煙堿類化合物。一種非常特別優選的化合物是例如由EP A 1 0 192 060可知的具有下式的吡蟲啉。<formula>formula see original document page 10</formula>再一種非常特別優選的化合物是例如由WO Al 91/04965可知的 具有下式的吡蟲清。再一種非常特別優選的化合物是例如由EP A2 0 235 725可知的 具有下式的噻蟲啉。芐基,<formula>formula see original document page 11</formula>再一種非常特別優選的化合物是例如由EP A2 0 302 389可知的 具有下式的烯蟲靈。<formula>formula see original document page 11</formula>再一種非常特別優選的化合物是例如由EP A2 0 376 279可知的 具有下式的噢蟲胺。<formula>formula see original document page 11</formula>再一種非常特別優選的化合物是例如由EP A2 0 580 553可知的 具有下式的噻蟲嗪。<formula>formula see original document page 11</formula>再一種非常特別優選的化合物是例如由EP Al 0 649 845可知的 具有下式的呋蟲胺。<formula>formula see original document page 11</formula>吡蟲啉是用于本發明方法的特別優選的化合物。P塞蟲胺也將作為 一種優選化合物在本發明的內容中被提到。在本發明的另一個實施方式中，描述了可用于提高經工程化從而 耐受逆境的植物或植物細胞或用于培育該植物的種子的逆境耐受性 和健康狀況的方法，包括對所述植物和/或其生境、植物細胞或用于培育所述植物的種子施用有效量的具有下式的6-氯煙酸(niacin， CAS NO: 5326-23-8)。6-氯煙酸可以在上述帶有該基團的新煙堿類化合物(如吡蟲啉、 噻蟲啉、吡蟲清、烯蟲靈)降解期間被釋放。例如，吡蟲啉被逐步降解 為初級代謝物6-氯煙酸，后者最終分解為二氧化碳。發現該代謝產物 也能提高經工程化從而耐受逆境的植物或植物細胞或用于培育該植 物的種子的逆境耐受性和健康狀況。上述化合物導致了含有外源性DNA的植物或其細胞和其種子的 逆境耐受性的增強，所述外源性DNA包括外源性逆境耐受性增強基 因或對應于所述外源性逆境耐受性增強基因的內源基因的變異體，所 述變異體導致含有該變異體的植物細胞或植物的逆境耐受性更高。通常，逆境耐受性的增強意味著逆境指示參數至少有顯著性減 少，可以采用，比較對象是未經處理的經受逆境的、非轉基因參比植 林或細胞和種子與經處理的轉基因參比植林或細胞和種子相比時的 形態、生理或生化差異來測量該參數。此處提到的"健康狀況"，是指 植物、細胞和種子的蟲害和病害侵害水平顯著性降低，所述侵害水平 可以以存在的各種病害的數目或宏觀癥狀表現(如相對葉面積減少、葉 面積侵害、葉面積壞死)來計算或估計。顯著性用Colby公式來證明。 此外，對逆境條件的抗性也可以通過檢測在逆境條件下DAD(H)水平 (相對于經受逆境的對照植抹，在逆境耐受性植株中該水平較高)和活 性氧物質水平沐對于經受逆境的對照植林，在經受逆境的耐受性植株中該水平較低)而測量，如歐洲專利申請書EP04077624.7 (在此引作參 考)。本發明的優勢之一是，本發明化合物和包含所述化合物的組合物 的特殊系統性特性，意味著用這些組合物對經工程化而成為逆境耐受 性的植物的種子進行的處理，可提高出苗后正發芽植林和所得植林的 逆境耐受性。以這種方式，可以不用在播種時或其后不久立即對作物 進行處理。在本發明的另一個實施方式中，描述了可用于提高經工程化從而 耐受逆境的植物或植物細胞或用于培育該植物的種子的逆境耐受性 和健康狀況的方法，包括對所述才直物和/或其生境、植物細胞或用于培 育所述植物的種子施用有效量的含有具式(I)化合物的組合物。的組合物。式(I)化合物還可以與其它活性化合物(例如殺蟲劑、殺細菌劑、 殺螨劑、殺真菌劑等)結合的混合物，以其在商業上有效的制劑或以由 該制劑制備的應用形式來應用。這樣可以得到組合物，該組合物除了 依據本發明改進植抹的逆境耐受性和健康狀況，還可以對抗可能存在 的蟲害。可被利用的殺蟲劑是例如有機磷劑、氨基甲酸酯或鹽劑、羧 酸類化學物質、氯化烴類化學物質、由微生物產生的殺蟲物質，等等。在許多情況下，這導致協同效應，即混合物的活性超過了各個成 分的活性。這種制劑及應用形式是商業上和生態上特別有用的，因為 可以使用較低量的活性成分。然而，增效劑不一定本身必須有活性， 只要它能增強活性化合物的活性即可。含有其他已知的活性化合物(如除草劑)或含有安全劑、化肥和生 長調節劑的混合物也是可行的。依據本發明對植物和植物部分用活性化合物進行的處理，可用慣 常的處理方法直接進行或通過讓化合物作用于其周圍、環境或存儲工間，所述慣常的處理方法例如為浸漬、噴灑、蒸發、噴霧、撒布、涂 抹，'以及對繁殖材料，特別是種子，還通過施用一種或多種包衣。可將活性化合物轉變為常規制劑，如溶液、乳劑、可濕性粉劑、混懸劑、粉末(powder)、粉劑(dust)、糊劑、可溶性粉劑、顆粒劑、混 懸劑-乳劑濃縮物、浸漬有活性化合物的天然和合成材料，以及封于聚 合物質中的微膠嚢。可以在寬泛的范圍內改變。由商業化制劑制備的使用形式中的活性化 合物含量可以在寬的限度內變化。這些制劑以已知方式生產，例如通過將活性化合物與補充劑(其 為液體溶劑和/或固體載體)混合來生產，任選使用表面活性劑，其為乳化劑和/或分散劑和/或起泡劑。如果所用的補充劑是水，還可以使用例如有機溶劑作為輔助溶 劑。基本上，適合的液體溶劑有芳香烴(如二甲苯、甲苯或烷基萘)、 氯化芳香烴或氯化脂族烴(如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷)、脂族烴(如環 己烷或石蠟，例如石油餾分、礦物油和^i物油)、醇類(如丁醇或甘醇 以及它們的醚類和酯類)、酮類(如丙酮、甲乙酮、曱基'異丁基酮或環 己酮)、強極性溶劑(如二曱基曱酰胺和二曱亞砜)以及水。合適的固體載體有例如，銨鹽和地面天然礦物(如高嶺土、粘 土、滑石粉、白堊、石英、綠坡縷石、蒙脫石或硅藻土)，和地面合成 礦物(諸如高度分散硅石、氧化鋁和硅酸鹽)；作為顆粒的固體載體， 合適的有例如，粉碎的和分級的天然巖石(如方解石、大理石、浮石、 海泡石和白云石)，無機和有機粗粉的合成顆粒，以及有機物質顆粒(如 鋸屑、椰子殼、玉米芯和煙草稈)；作為乳化劑和/或起泡劑，合適的 有例如非離子和陰離子乳化劑，如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂 肪醇醚(如烷芳基聚乙二醇醚)、烷基磺酸酯、烷基硫酸酯、芳基磺酸 酯以及蛋白質水解物；作為分散劑，合適的有例如，木質素亞硫酸 酯廢液和甲基纖維素。增粘劑，如羧曱基纖維素和粉末、顆粒或膠乳形式的天然的與合 成的聚合物(如阿拉伯樹膠、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯)以及天然磷脂 (如腦磷脂和卵磷脂)與合成磷脂，可用于制劑中。其他添加劑可以是礦物油禾。纟直物油。可以使用著色劑，如無機色素(如氧化鐵、氧化鈦和普魯士藍)、有機染料(如萏素染料、偶氮染^r+和金屬酞菁染料)以及微量營養素(如 鐵、錳、硼、銅、鈷、鉬和鋅的鹽)。該制劑一般包含0.1-98%(重量)的活性化合物，優選0.1-90%、特 別優選0.5-70%(重量)的活性化合物。新煙堿類化合物和6-CNA的有益的逆境耐受性增強作用在一定 的施用比率下尤為突出。然而，活性化合物的施用比率可在相對寬泛 的范圍內變動。 一般來說，施用比率是每公項lg至1600g活性化合 物，優選每公項10g至800g活性化合物，特別優選每公項10g至600g 活性化合物。如前面所提到的，本發明的一個實施方式是可用于增強經工程化 從而耐受逆境的植物的逆境耐受性和健康狀況的方法，包括將有效量 的含具式(I)化合物的組合物施用于植物繁殖材料，包括用于培育所述 植物的種子。在種植前處理該一直物繁殖材料，例如在播種前進行種子 拌藥。依據本發明的化合物也可通過或者用液體制劑浸漬谷粒或者用 固體制劑給谷粒包衣而施用于谷粒。也可以在種植繁殖材料時(如播種 期間)將組合物施用于種植場所。因此，本發明還涉及植物的種子，該植物是經工程化從而耐受逆 境，并經本發明的化合物處理過。關于對植物繁殖材料如種子的處理，有利的施用比率為一般每 100kg待處理的材料0.1-1000g、特別的是l-800g、優選是10巧00g所 述新煙堿類化合物之一或6-CAN。可以依據本發明方法得到改善的作物，包括任何經工程化從而耐 受逆境的植物、雙子葉和單子葉種子、植物細胞，尤其是棉花、菜籽(canola)、油菜(oilseed rape)、小麥、玉米或玉蜀黍、大麥、牙舀、燕麥、 黑麥、蕎麥、小黑麥、甘蔗、大豆、向日葵、苜蓿、菜豆、亞麻、芥 菜、豌豆、煙草、馬鈴薯、甘薯、甜菜、草坪草、高粱、小米、蕓苔 屬蔬菜、其他蔬菜(包括洋薊、，夢、胡蘿卜、芽菜、菊苣、黃瓜、茄 子、韭菜、萵苣、甜瓜、黃秋葵、洋蔥、胡椒、南瓜、蘿卜、蕪菁甘 藍、紅花、菠菜、西葫蘆(squash)、西紅柿、西瓜、山藥、綠皮南瓜 (zucchini))、杏仁、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可樹、柑桔(包 括葡萄柚、檸檬、橙、金橘、酸橙、橘子、桔、柚和溫州蜜柑)、櫻桃、 椰子、蔓越莓、海棗、獼猴桃、葡萄、番石榴、奇異果、芒果、油桃、 木瓜、西番蓮、桃、花生、梨、鳳梨、山核桃、阿月渾子、李子，覆 盆子、草莓、茶樹、胡桃以及用于園藝、花卉或林業的植物。所有的植物和植物部分都可以依據本發明進行處理。植物部分應 理解為指所有的地上和地下部分以及植物器官如芽、葉、花和根，可 以提及的例子有葉、針葉、稈、莖、花、子實體、果實、種子、根、 塊莖和根莖。植物部分還包括收獲的材料、無性繁殖和有性繁殖的材 料，例如插條、塊莖、根莖、短旬莖(offset)和種子。它們還包括植物 細胞，如可以被用于或來源于依據本發明的植物細胞的轉化的植物細 胞。也可能將上述化合物施用于土壤上或土壤中，如種植或播種前， 以達到描述的效果，如使種植后植物和從播種到處理過的土壤中的種 子生長后的出苗植物的逆境耐受性得到增強。本發明中提及的植物、植物細胞和種子以特定方式經工程化而增 強了所述植物的逆境耐受性。在本發明的一個實施方式中，外源性逆境耐受性增強基因能夠降 低植物細胞或植物中聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表達和/或活 性，如WO 00/04173 Al或EP 04077984.5 (在此引作參考)所述。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，也被稱為聚(ADP-核糖)轉移酶 (ADPRT)(EC 2.4.2.30)，是一種細胞核酶，存在于大局部真核生物中， 包括脊推動物、節肢動物、軟體動物、粘菌、腰鞭毛蟲、真菌和除了酵母以外的其他低等真核生物。在大量的植物中也發現有該酶活性(Payne等，1976; Willmitzer和Wagner, 1982; Chen等，1994， O，Farrell， 1995)。PAR 催化來自NAD+的ADP核糖基部分的轉移(主要轉移至靶 蛋白中谷氨酸殘基的羧基)和隨后的ADP-核糖聚合。主要的靶蛋白是 PARP本身，還有組蛋白、高速泳動族染色體蛋白、拓樸異構酶、內 切核酸酶和DNA聚合酶也已經^皮證明受到這種^"飾。在具體實施方式
中，逆境耐受性增強基因可包含下列操作性連接 的DNA片段a) 才直物可表達啟動子；b) DNA區，其被轉錄時產生能夠降低植物內源性PARP編碼基 因表達的RNA分子(PARP抑制性RNA分子)。c) 涉及轉錄終止和聚腺香酸化的DNA區。提到的DNA區可產生所謂的反義RNA分子，以轉錄或轉錄后后 方式降低靶植物或植物細胞中PARP編碼基因的表達，所述反義RNA 分子包含至少20個或21個連續的核苷酸，它們與所述植物細胞或植 物中PARP編碼基因的核苷酸序列的互補物有至少95%至100%的序 列同一性。提到的DNA區還可產生所謂的有義RNA分子，以轉錄或轉錄后 方式降低靶植物或植物細胞中PARP編碼基因的表達，所述有義RNA 分子包含至少20個或21個連續的核苷酸，它們與所述植物細胞或植 物中PARP編碼基因的核香酸序列有至少95%至100%的序列同一性。然而，PARP編碼區的大約20 nt的反義或有義RNA的最小核苷 酸序列，可以包含更大的RNA分子中，后者的長度變化范圍從20 nt 至等同于輩巴基因的大小。因此，所提及的反義或有義核酸區可以長大 約從約21 nt至約5000 nt，如長度為21 nt、 40 nt、 50 nt、 100 nt、 200 nt、 300 nt、 500 nt、 1000nt、 2000 nt或甚至約5000 nt或更長。此外， 對本發明的目的來說并不要求所用的抑制性PARP RNA分子或外源基因編碼區的核苷酸序列，與所述植物細胞中其表達被靶向以便降低的內源PARP基因完全相同或互補。序列越長，對總體序列同一性的 要求就越不嚴格。因此，所述反義或有義核酸區與內源性PARP基因 的核普酸序列或其互補序列的總體序列同一性為大約40%或50%或 60%或70%或80%或90%或100%。然而，所提及的反義或有義區應 該包含是與內源性PARP基因核苷酸序列有約100%序列同一性的20 個連續核普酸的核苦酸序列。優選約100%序列同一性的序列段長度 應該是大約50、 75或100 nt。對于本發明的目的，兩個相關序列的"序列同 一性"(用百分比表 示)，是指兩個最佳比對序列中具有同一殘基的位點數目除以被比位點 數目(x100)。空位，即序列比對中某個殘基存在于一個序列但在另一 個序列中不存在的位點，被認為是具有非相同殘基的位點。兩個序列 的序列比對用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970) 進行。計算機輔助序列比對可以很方便地用標準的軟件程序，例如 GAP (其為Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin)的部分)，使用默認打分矩陣來進行，其中空位開 放罰分為50，空位擴展罰分為3。很明顯，每當RNA分子的核苷酸序列參照相應DNA分子的核苷 酸序列來確定時，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應改為尿嘧啶(U)。所 提及的是RNA分子還是DNA分子，根據本申請的上下文來看將是清 楚的。上述外源基因降低內源性PARP基因表達的效率可以通過包含導進一步增強。 一種適合該目的的該類DNA元件是編碼自我剪接核酶 的DNA區，如WO 00/01133 Al所述。上述外源基因降低植物細胞中內源性PARP基因表達的效率還可 通過在植物細胞中同時引入本文描述的編碼反義PARP抑制性RNA 的外源基因和本描述的編碼有義PARP抑制性RNA的外源基因而得到進一步增強，其中，反義和有義PARP抑制性RNA分子能通過在 上述至少20個連續核苷酸間進刊^成基配對而形成雙鏈RNA區，如 WO 99/53050 Al所述。如WO 99/53050 Al中的進一步描述，能形成雙鏈RNA區的反義 和有義PARP抑制性RNA區，可以是存在于一個RNA分子中，優選 被間隔區分開。該間隔區可以包含內含子序列。這樣的外源基因可方 便地通過以倒置重復方式操作性連接DNA片段至植物可表達啟動子 和參與轉錄終止和多聚腺苷化的3'端形成區而構建，該DNA片段包 含來自分離的或經鑒定的內源性PARP基因(該基因的表達被靶向而 被降低)的至少20個核苷酸。為完成這種外源基因的構建，可以使用 WO 02/059294 Al中描述的載體。目前的命名是指稱為PARP1蛋白(和相應的parpl基因)的典型含 鋅指聚合酶，而結構上非典型的PARP蛋白目前被稱為PARP2蛋白(和 相應的parp2基因)，本文所用的PARP編碼基因可以指任一種類型。鑒別經實驗證明的和推定的聚ADP-核糖聚合酶蛋白序列、其部 分或同源序列的以下數據庫實體(在此引作參考)，可依據目前的發明 來使用BAD53855 (稻(Oyza犯r,:va)); BAD52929 (稻)；XP一477671 (稻)；BAC84104 (稻)；AAT25850 (玉蜀黍(Zra wa")); AAT25849 (玉蜀 黍)；NP一197639 (擬南齊(Jra^tto/w^ NP—850165 (擬南芥);NP一188107 (擬南芥)；NP 850586 (擬南芥)；BAB09119 (擬南芥); AAD20677 (擬南芥)；Q11207 (擬南芥)；C84719 (擬南芥)；T51353 (擬 南芥)；T01311 (擬南芥)；AAN12901 (擬南芥)；AAM13882 (擬南芥); CAB80732 (擬南芥)；CAA10482 (擬南芥)；AAC79704 (玉蜀黍): AAC19283 (擬南芥)；CAA10888 (玉蜀黍)；CAA10889 (玉蜀黍); CAA88288 (擬南芥)。在本發明的特定實施方式中，降低PARP基因表達的基因可以包 含下列操作性連接的DNA片段a)植物可表達啟動子b) DNA區，其在轉錄時產生RNA分子，該RNA分子包含a. 反義核苷酸序列，其包含至少約20個連續核香酸，所述 至少20個連續核苷酸與選自以下的核苷酸序列的約20個連續核 苷酸的核普酸序列有大約96%的序列同一性SEQ ID 1 (擬南芥 parpl編碼區)、SEQ ID 2 (擬南芥parp 2編碼區)、SEQ ID 3 (玉蜀 黍parpl編碼區)、SEQID4 (另一玉蜀黍parpl編碼區)、SEQ ID 5 (玉蜀黍parp2編碼區)或SEQ ID 6 (棉花parp2部分cDNA)的核 苷酸序列、或編碼具有與上述核苷酸序列所編碼氨基酸序列相似 或相同序列的蛋白的核苷酸序列；b. 有義核苷酸序列，其包含與所述反義核苷酸序列互補的 至少約20個連續核苷酸。因此，所述有義核苷酸序列可包含至 少約20個連續核苷酸的序列，所述至少20個連續核苷酸的序列 與選自以下的核苷酸序列的約20個連續核苷酸的核苷酸序列有 大約96%的序列同一性SEQ ID l(擬南芥parpl編碼區)、SEQ ID 2 (擬南芥parp 2編碼區)、SEQ ID 3 (玉蜀黍parpl編碼區)、 SEQID4(另一玉蜀黍parpl編碼區)、SEQ ID 5 (玉蜀黍parp2編 碼區)或SEQ ID 6 (棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列、或編碼 具有與上述核苷酸序列所編碼氨基酸序列相似或相同序列的蛋 白的核苷酸序列；藉此，所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA分子 (dsRNA);c) 用于轉錄終止和聚腺苷酸化的DNA區。然而，很明顯，在WO00/04173或EP 04077984.5中描述的其它 PARP編碼基因也可使用。很明顯，本發明增強逆境耐受性的目標也可以通過將上述化合物 施用于植物或植物細胞而達到，所述植物或植物細胞在其基因組中包 含有變異型PARP編碼基因，由此與相似植物中的PARP的表達和/ 或活性比較，該變異型PARP的表達和/或活性被降低，這也將導致帶有該變異型PARP的植物的逆境耐受性增強。這種變異型PARP編碼 基因可通過例如誘變誘導，或者也可以是自然產生的PARP編碼基因 的等位基因，它與宿主植物增強的逆境耐受性相關。在本發明的另一個特殊實施方式中，將上述化合物施用于含外源 性逆境耐受性增強基因的植物或植物細胞，該基因能降低植物或植物 細胞中ParG編碼基因的表達和/或活性，如WO 2004/090140所述(在 此引作參考)。PARG (聚(ADP-核糖)糖原水解酶；E.C.3.2丄143)通過其外切糖 原水解酶和內切糖原水解酶活性(PARG)將聚(ADP-核糖)聚合物轉化 為游離的ADP-核糖。在植物中，通過對擬南芥基因的時鐘控制型轉錄和從營養生長至 開花的光周期依賴性轉變(tej)方面受影響的突變體中被失活的野生型 基因進行基于圖譜的克隆，已經鑒別出 一種聚(ADP-核糖)糖原水解 酶。該基因的核苷酸序列可以用登錄號AF394690從核苷酸數據庫獲 得(Panda等，2002， Dev. Cell. 3, 51-61; SEQIDNo7)。可以在WO 2004/090140 A2中找到源自植物的其它植物PARG 編碼基因的核苷酸序列，如源自馬鈴薯(So/a抑/w m&mwm) (SEQ ID No 8)、稻(SEQIDNo9)或玉蜀黍(SEQIDNo IO)的PARG基因，以及 從其它植物中分離其他PARG編碼序列和其變異體的方法。因此，在一個實施方式中，經工程化從而耐受逆境的植物或植物 細胞可包含下列操作性連接的DNA片段a) 植物可表達啟動子b) DNA區，其在轉錄時產生抑制性RNA分子，該RNA分子包含i.反義核苷酸區，其包含至少20個連續核苷酸，所述至少20個 連續核苷酸與選自以下的核苷酸序列的大約20個連續核苷酸具有大 約96%的序列同一性編碼植物PARG蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID 7、 SEQ ID 8、 SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)的互補序列、或編碼具有與上述核苷酸序列所編碼氨基酸序列相似或相同序列的蛋白的核苷酸序列；或ii.有義核苦酸區，其包含至少20個連續核香酸，所述至少20 個連續核苷酸選自編碼植物PARG蛋白的核香酸序列(如SEQ ID 7、 SEQ ID 8、 SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)、或編碼具有與上述 核苷酸序列所編碼氨基酸序列相似或相同序列的蛋白的核苷酸序列； 或111.如上述i)或ii)中提到的有義和反義核普酸序列，由此所述有 義和反義核芬酸序列能夠形成雙鏈RNA分子；c)參與轉錄終止和聚腺苷酸化的DNA區。技術人員會立即明白，有義和反義核苷酸序列或dsRNA分子長 度以及ParG抑制性RNA分子的序列同 一性的額外參數，可以如同上 文關于PARP抑制性RNA分子所述來應用。在本發明的再一個實施方式中，外源性逆境耐受性增強基因可包 含下列操作性連接的DNA片段a) 植物可表達啟動子b) 編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成途徑中的植物功能性酶 的DNA區，這些酶選自煙酰胺酶、煙酸磷酸核糖基轉移酶、煙酸單 核普酸腺普酰轉移酶(nicotinic add mononucleotide adenyl transferase) 或煙酰胺腺噪呤二核普酸合成酶；和c) 參與轉錄終止和聚腺苷化的3，末端區，參見EP 04077624.7中 的描述(在此引作參考)。本文所用的"煙酰胺腺噤呤二核苦酸補救合成途徑中的植物功能 性酶"是這樣一種酶，當其與合適的控制元件(如植物可表達啟動子和 終止區)連接而導入4直物時，可^皮轉錄并翻譯從而產生在植物細胞中有 功能的NAD拯救合成途徑的酶。包括得自植物來源的NAD補救合成 途徑的酶(以及編碼基因)，也包括得自酵母(釀酒酵母(Sacc/2ara"^c^ cerev&rae))或其它酵母或真菌的這些酶。i人為后幾種蛋白可能甚至更適合用于依據本發明的方法中，因為這些蛋白不太可能經受相似的植 物源性酶所可能經受的酶反饋調節等。參與NAD補救合成途徑的酶包括以下酶-煙酰胺酶(EC 3.5丄19)，其催化煙酰胺的酰胺基團水解，由此 釋放出煙酸和NH3。該酶也被稱為煙酰胺脫氨酶、煙酰胺酰胺酶、YND 酶或煙酰胺酰胺水解酶。-煙酸磷酸核糖基轉移酶(EC 2.4.2.11),也被稱為煙酸核糖核苷 酸酶、煙酸單核普酸糖原水解酶、煙酸單核苷酸焦磷酸化酶、煙酸磷 酸核糖基轉移酶，其催化下述反應煙酸-D-核糖核普酸+ 二;粦酸=煙酸+ 5-磷酸-a-D-核糖-l-焦磷酸-煙酸核苷酸腺苷酰轉移酶(EC 2.7.7.18),也#皮稱為脫酰胺"^^+ 焦磷酸化酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉移酶、脫酰胺煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸焦磷酸化酶、NaMT-ATase、煙酸單核苷酸腺苷酰轉移酶，其催 化下述反應ATP+煙酸核糖核苷酸=二磷酸+脫酰胺-NAD十 -NAD-合成酶(EC 6.3.1.5),也一皮稱為NAD合成酶、NAD+合成酶、煙酰胺腺噪呤二核苷酸合成酶、二磷酸吡啶核苷酸合成酶，其催化下述反應脫酰胺^^+ + ATP + NH3 = AMP + 二磷酸+ NAD+ 在本發明的一個實施方式中，編碼NAD補救合成途徑的植物功 能性酶的DNA區可包含來自SEQ ID No 11、 12、 13、 14或15的核 香酸序列，或者編碼具有與上述核苷酸序列所編碼氨基酸序列相似或 相同序列的蛋白質的核苷酸序列。如Hunt等2004所描述的，已經鑒別出這些酶的植物同源物，這 些DNA序列可用于類似的效應(Hunt等，2004 ， New Phytologist 163(1): 31-44)。所鑒別出的DNA序列有下列登錄號煙酰胺酶 At5g23220 (SEQ ID No 16)、 At5g23230 (SEQ ID No 17)和At3gl6190(SEQ ID No 18);煙酸磷酸核糖基轉移酶At4g36940 (SEQ ID No 19)、 At2g23420 (SEQ ID No 20);煙酸單核苷酸腺苷酰轉移酶At5g55810 (SEQ ID No 21);以及NAD合成酶Atlg55090 (SEQ ID No 22)。然而，很明顯，經工程化從而耐受逆境的植物也可以包含這些核 苷酸序列的變異體，包括其插入、缺失和取代。同樣地，可以使用來 自不同于釀酒酵母(Sacc/267rawycw ce/^v/^a)的物種的上述核普酸序列 的同源物。它們包括但不僅限于來自植物的核苷酸序列、編碼具相同 氨基酸序列的蛋白質的核苷酸序列、以及這些核苷酸序列的變異體。所述核普酸序列的變異體與已鑒別的編碼NAD補救途徑的酶的 核苷酸序列(如序列表中所鑒別的序列)有序列同 一性，優選至少約 80%或85或90%或95%的序列同 一性。優選這些變異體將編碼與NAD 補救合成途徑的酶有相同酶活性的功能性蛋白。'本發明的才法可以用于提高植物或植物細胞對不同種類的脅迫 誘導條件的逆境耐受性，所述M^迫誘導條件尤其是非生物脅迫條件， 包括淹沒、高光照條件、高紫外線輻射水平、增加的過氧化氫水平、 千旱條件、高溫或低溫、增加的鹽度條件、以及除草劑、農藥、殺蟲物的細胞中活性氧水平(ROS),或提高細胞中NAD+、 NADH"或ATP 的水平，所述不利條件尤其是非生物脅迫條件，包括淹沒、高光照條 件、高紫外線輻射水平、增加的過氧化氫水平、干旱條件、高溫或低 溫、增加的鹽度條件等等。ROS水平或NADH水平可用本領域技術 人員已知的方法，包括在實施例中描述的那些方法來測定。植物逆境 耐受性的增強也可用測定線粒體電子流的方法進行分析，如 WO97/06267或WO02/066972中描述的。盡管無意限制本發明的具體作用模式，但是預期新煙堿類(尤其 是包含氯吡啶側鏈的新煙堿類化合物)的代謝產物進入NAD補救途 徑，并導致較高的NAD水平。從這個角度來說，預期將這類化合物 施用于經工程化從而抗逆境的才直物不會產生任何效應，因為在脅迫條件下，這類植物細胞中的NAD水平已顯著性高于未經工程化從而抗 逆境的植物細胞。本發明的通過對植物或才直物細胞施用新煙石威類化合物以提高逆 境抗性的方法，可以適用于任何經工程化從而抗逆境的植物，即雙子 葉和單子葉植物細胞和植物，包括但不限于棉花、蕓苔屬蔬菜、油 菜、小麥、玉米或玉蜀黍、大麥、向日葵、稻、燕麥、甘蔗、大豆、蔬菜(包括菊苣、萵苣、番茄)、煙草、馬鈴薯、甜菜、木瓜、菠蘿、 芒果、擬南芥，以及用于園藝、花卉或林業的植物，谷類植物，包括 小麥、燕麥、大麥、黑麥、水稻、草坪草、高粱、小米或甘蔗植物。 本發明的方法還可以于任何植物，包括但不限于棉花、煙草、油菜 籽(canola)、歐洲油菜(mpe)、大豆、蔬菜、馬鈴薯、浮萍屬植物(Lemna spp.)、煙草屬植物(Nicotianaspp.)、甘薯、擬南芥、苜蓿、大麥、菜豆、 玉米、棉花、亞麻、豌豆、油菜、水稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、 向曰葵、煙草、小麥、蘆筍、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰 菜、芽菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、油菜(oilseed rape)、胡椒、馬 鈴薯、南瓜、蘿卜、菠菜、西葫蘆、西紅柿、綠皮南瓜、杏仁、蘋果、 杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可樹、櫻桃、椰子、蔓越莓、海棗、葡萄、 葡萄柚、番石榴、奇異果、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、橙、木 瓜、西番蓮、桃、花生、梨、鳳梨、阿月渾子、李子、覆盆子、草莓、 柑橘、山核桃和西瓜。本文所用的"包含"或"包括"應^f皮解釋為限定所述特征、整 數、步驟或組分的存在，但并不排除一個或多個特征、整數、步驟或 組分或它們的群體的存在或添加。因此，例如，包含核苷酸序列或者 氨基酸序列的核酸或蛋白質，可以包含比實際記載的的更多的核苷酸 或者氨基酸，即嵌入更大的核酸或蛋白質中。包含功能上或結構上限 定的DNA區的外源基因，可以包含額外的DNA區等。除非在實施例中另有說明，否則所有重組DNA技術依照，如下 列文獻中描述的標準程序進行Sambrook等(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 和Ausubel等(1994) Current Protocols in Molecular Biology,笫 一巻禾口 第二巻,Current Protocols, USA。用于植物分子研究的標準材料和方法 在下列文獻中有描述Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy，由BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和Blackwell Scientific Publications, UK聯合出版。標準分子生物學技術的其它參考文獻包 括Sambrook和Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Brown (1998) Molecular Biology LabFax,第二版，第一巻和第二巻，Academic Press (UK)。聚合酶鏈式反應的標準材料和方法可以在下列文獻中找到 Dieffenbach和Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; McPherson等，(2000) PCR - Basics: From Background to Bench,第 一版，Springer Verlag, Germany 。在整個說明書和實施例中，提及下列序列SEQ ID No. 1:擬南芥的parpl編碼區。SEQ ID No. 2:擬南芥的parp2編碼區。SEQ ID No. 3:玉蜀黍的parpl編碼區1 。SEQ ID No. 4:玉蜀泰的parpl編碼區2。SEQ ID No. 5:玉蜀黍的parp2編碼區。SEQ ID No. 6:棉花的parp2部分編碼區。SEQ ID No. 7:擬南芥的paK}編碼區。SEQ ID No. 8:馬鈴薯(So/ahww m6emyww)的parG編碼區。SEQ ID No. 9:稻((9o^ ra"va)的parG編碼區。SEQ ID No. 10:玉蜀黍的pwG編碼區。SEQ ID No. 11:釀酒酵母的煙酰胺酶(PNC1)的核苷酸序列。SEQ ID No. 12:釀酒酵母的煙酸磷酸核糖基轉移酶(NPT1)的核 苷酸序列(互補)。SEQ ID No. 13:釀酒酵母的煙酸單核苷酸腺苦酰轉移酶1 (NMA1)的核普酸序列。SEQ ID No. 14:釀酒酵母的煙酸單核香酸腺苷酰轉移酶2 (NMA2)的核普酸序列。SEQ ID No. 15:釀酒酵母的NAD合成酶(QNS1)的核苷酸序列。SEQ ID No. 16:擬南芥煙酰胺酶(同種型(isoform) l)的核香酸序列。SEQ ID No. 17:擬南芥煙酰胺酶(同種型2)的核苷酸序列。 SEQ ID No. 18:擬南芥煙酰胺酶(同種型3)的核普酸序列。 SEQ ID No. 19:擬南芥煙酸磷酸核糖基轉移酶(同種型l)的核苷 酸序列。SEQ ID No. 20:擬南芥煙酸磷酸核糖基轉移酶(同種型2)的核苷 酸序列。SEQ ID No. 21:擬南芥煙酸單核苷酸腺苷酰轉移酶的核苷酸序列。SEQ ID No. 22:擬南芥NAD合成酶的核苷酸序列。 實施例實施例1;測量NADH含量和超氧化物含量的程序 用水溶性四氮鏘鹽進行胞內NAD(P)H定量參考文獻:Jun Nakamura, Shoji Asakura， Susan D, Hester, Gilbert de Murcia, Keith W. Caldecott禾口 James A. Swenberg (2003): Quantitation of intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strand break repair in base excision repair deficient cells in real time (對胞內 NAD(P)H)的定量測定可以實時監測堿基切除修復缺陷型細胞中的 DNA單鏈斷裂修復的失衡).Nucleic Acids Research 31(17), el04。植物材料大多數植物材料都可以被使用，例如，體外生長的14-18日齡但 未開花的擬南芥苗，或油菜(oilseedrape)的下胚軸外植體。 細胞計數試劑盒-8 (CCK-8)Sopachem n.v./Belgium, 72A. Avenue du Laarbeeklaan, 1090 Brussels, Belgium內容物5 mL瓶，內含5 mMol/L WST-8 (四氮輸鹽)，0.2 mMol/L 1 -Methoxy PMS, 15 mMol/L氯化鈉；反應液10mL25mM磷酸鉀緩沖液pH7.4; 0.5mLCCK-8; 0.1 mM曱基硫酸1-曱氧基-5-甲基吩嗪鏡(=甲基硫酸l-甲氧基吩嗪)1 ^L/mL 100 mM貯存液(MW- 336.4; 100 mg，于2.973 mL水中)；1滴 吐溫20/25 mL。操作程序收獲植物材料并放入25 mM磷酸鉀緩沖液pH7.4中(如，150個 油菜下胚軸外植體或1克擬南芥苗(無根))。用反應液替換緩沖液(l克 擬南芥苗15 mL，或150個油菜下胚軸外植體15 mL)。黑暗中于26 。C溫育約/2小時(后續反應(follow reaction))。測量反應液在450 nm 的吸光度。通過定量XTT的還原來測量超氧化物產量參考文獻:De Block, M.， De Bro冊er, D. (2002)， A simple and robust in vitro assay to quantify the vigour of oilseed rape lines and hybrids (量化油菜系和雜交種活力的 一種簡單而強有力的體外測定 法)，Plant Physiol. Biochem. 40, 845-852A.歐洲油菜(J /mw.cfl "fl戸力培養基和反應緩沖液播種培養基(培養基201):半濃縮的Murashige和Skoog鹽；2% 蔗糖，pH5.8; 0.60/o瓊脂(DifcoBacto Agar); 250 mg/1 triacillin。愈傷組織誘導培養基A2S3: MS培養基，0.5 g/1 Mes (pH 5.8)， 3%蔗糖，40mg/l腺噤呤-S04， 0.5%瓊脂，1 mg/1 2,4-D, 0.25 mg/1 NAA, 1 mg/1 BAP, 250 mg/1 triacillin。反應緩沖液25 mM磷酸鉀緩沖液pH 8; 1 mM3'-(l-[苯氨基羰 基]-3，4-四唑鏡)-二 (4-曱氧基-6-硝基)鈉 =XTT (BioVectra， Canada)(MW 674.53)。小心加熱'溶液(士 37。C)以溶解XTT (在使用前冷 卻至室溫)。25 mL緩沖液加入1滴吐溫20。種子消毒_種子預萌發-籽苗生長將種子在70%乙醇中浸泡2分鐘，隨后在含0.1%吐溫20的次氯 酸鈉溶液(具有約6%活性氯)中進行表面消毒15分鐘。最后，用l升 無菌自來水漂洗種子。讓種子在無菌自來水中溫育至少1小時(以讓可 能抑制發芽的組分從種子中擴散出)。將種子放入含有50ml無菌自來 水(+ 250 mg/1 triacillin)的250 mL錐形燒瓶中。振蕩約20小時。將有 胚根伸出的種子從Duchefa放入含有約125 mL播種培養基的Vitro Vent容器中(IO種子/容器，不要太多，以便降低污染所致的種子損失)。 種子在士24。C 、 10-30nEinstein s"W-2和16小時日照的條件下進行萌發。 為了計算必須播種的種子數目5個下胚軸節段/籽苗。下胚軸外植體的預培養及逆境的誘導在播種后12-14天，將下胚軸切割成7-10mm的節段。下胚軸外 植體(2個下胚軸/ Optilux培養皿，Falcon S1005, Denmark)在培養基 A2S3上于25。C培養5天(在10-30)iiEinstein s"m-2)。每種條件使用150 個下胚軸外;f直體。逆境的誘導將下胚軸外植體轉移至分別含有0、 25和50 mg/1乙酰水楊酸的 A2S3培養基。在25°C 、 10-30pEinstein s"W-2和16小時日照的條件下 培養24小時。XT丁測定將150個下胚軸外植體轉移至一個50ml Falcon試管中。用反應 液(不含XTT)清洗。加入20mL反應緩沖液+ XTT。必須將外植體淹 沒，但不能真空滲透。在黑暗中于26。C培養。在反應后，測量反應培 養基在470nm的吸光度。B.擬南齊(y4/Y^W。/7iiS ,/lfl//"fl)培養基和反應緩沖液植抹培養基半濃縮的Murashige和Skoog鹽；維生素B5; 1.5% 蔗糖，pH5.8; 0.7。/。Difco瓊脂。溫育培養基1/2濃縮MS鹽；1%蔗糖；0.5 g/1 MES pH 5.8; 25 mL 培養基加入1滴吐溫20。反應緩沖液25 mM磷酸鉀緩沖液pH 8; 1 mM 3'-{1-[苯氨基羰 基〗_3,4-四唑鏡)-二(4-甲氧基-6-硝基)鈉=XTT (BioVectra, Canada) (MW 674.53)。小心加熱溶液(士 37。C)以溶解XTT (在使用前冷卻至室 溫)。25 mL緩沖液加入1滴吐溫20。擬南芥屬G4m6 /cfopwV)斗直物擬南芥屬品系對照系(受試系所來源的母系)；受試系。擬南芥屬種子的消毒2分鐘，70%乙醇；10分鐘，漂白水(6% 活性氯)+每20 mL溶液1滴吐溫20;用無菌自來水清洗5次；在2 mLe卯endorf管內進行消毒。擬南芥屬種子下沉至管底部，允許用1 mLpipetman (移液器)除去液體。種子預萌發在含12 mL無菌自來水的9 cm Optilux培養皿 (Falcon)中進行。弱光通宵至24小時。擬南齊屬植物的培養將種子播在含士125 mL植林培養基的 Falcon Intergrid Tissue Culture盤(nr. 3025 ): 1粒種子/格。植物在24 °C 、 30nEinsteins"W2、 16小時光照-8小時黑暗的條件下生長約18天(在抽苔前)。進行測定時需要每種條件每品系lg植物材料(無根的苗)。lg苗對應40-60棵植抹。 逆境誘導百草枯(Paraquat):收獲擬南芥屬苗(不帶根)。將lg苗放入分別 含有0、 5、 10nM百草枯的溫育培養基中(必須將苗淹沒，但不能真空 滲透)。溫育培養基士150mL Falcon Intergrid Tissue Culture盤(nr. 3025 )。在24'C黑暗中、10-30—stein s"W^和16小時日照的條件下 培育±24小時。光照將一半的平板移至強光照(250pEinstein s"W、下，培育4 至20小時。 XXT測定從瓊脂平板(強光照逆境)或從液體溫育培養基收獲苗(不帶根)， 將其置入含反應緩沖液(不含XTT)的50ml Falcon試管中。用含XTT 的緩沖液(15mL/g)置換反應緩沖液。必須將苗淹沒，但不能真空滲透。 在黑暗中于26。C培養。在反應后，測量反應培養基在470nm的吸光 度(大約1小時)。實施例2:在對包含增強逆境耐受性的轉基因的植抹施用新煙堿類化 合物后的逆境耐受性分析用不同濃度的吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、吡蟲清、烯蟲靈、 呋蟲胺、6-氯煙酸和瘞蟲啉，處理如WO 00/04173 Al所述的(例 如，在實施例8中)包含轉基因的蕓苔屬(^ra^/ca)植抹，并使其 經受各種逆境條件，特別是高低溫、高光強或干旱脅迫或它們的 任何組合，所述轉基因編碼能降低內源性PARP基因的雙鏈RNA 分子。在處理后，目測記錄所述植林的存活和損害，并與下列植抹比較 未經處理的轉基因對照植株，和用上述化合物以類似方式處理的非轉基因同基因植抹。測定活性氧物質、NAD和ATP的水平，并與對照 植林比較。經所迷化合物處理的轉基因蕓苔屬植株可比未經處理的轉基因 對照植抹更好地經受住逆境條件。與在未經處理的轉基因蕓莒屬植抹 中的情況相比，在經處理的轉基因蕓苔屬植林中ROS水平較低，而其 NAD或ATP水平較高。用不同濃度的吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲。秦、吡蟲清、烯蟲靈、呋蟲 胺、6-氯煙酸和嗔蟲啉，處理如WO 00/04173 Al所述的包含轉基因 的玉米植抹，并讓其經受各種逆境條件，特別是高低溫、高光強或干 旱脅迫或它們的任何組合，其中所述轉基因編碼能降低內源性PARP 基因的雙鏈RNA分子。在處理后，目測記錄植林的存活和損害，并與下列植株比較未 經處理的轉基因對照植抹，和用上述化合物以類似方式處理的非轉基 因同基因植林。測定活性氧化物種類、NAD和ATP的水平，并與對 照植株比較。照植株更好地經受住逆境條件。與在未經處理的轉基因玉米植抹中的 情況相比，在經處理的轉基因玉米植抹中ROS水平較低，而其NAD 或ATP水平較高。用不同濃度的吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、吡蟲清、烯蟲靈、呋蟲 胺、6-氯煙酸和p塞蟲啉，處理如EP 04077984.5所述的包含轉基因的 棉花植林，并使其經受各種逆境條件，特別是高低溫、高光強或干旱 脅迫或它們的任何組合，其中所述轉基因編碼能降低內源性PARP基 因的雙鏈RNA分子。在處理后，目測記錄植抹的存活和損害，并與下列植林比較未 經處理的轉基因對照植林，和用上述化合物以類似方式處理的非轉基 因同基因植林。測定活性氧物質、NAD和ATP的水平，并與對照植 抹比較。經所述化合物處理的轉基因棉花植抹可比未經處理的轉基因對 照植株更好地經受住逆境條件。與在未經處理的轉基因棉花植抹中的情況相比，在經處理的轉基因棉花植抹中ROS水平較低，而其NAD 或ATP水平較高。用不同濃度的吡蟲啉、瘞蟲胺、p塞蟲。秦、吡蟲清、烯蟲靈、吹蟲 胺、6-氯煙酸和噢蟲啉，處理如WO2004/090140所述的包含轉基因的 蕓苔屬或水稻植株，并使其經受各種逆境條件，特別是高低溫、高光 強或干旱脅迫或它們的任何組合，其中所述轉基因編碼能降低內源性 PARG基因的雙鏈RNA分子。在處理后，目測記錄植林的存活和損害，并與下列植抹比較未 經處理的轉基因對照植抹，和用上述化合物以類似方式處理的非轉基 因同基因植抹。測定活性氧物質、NAD和ATP的水平，并與對照植 抹比較。經所述化合物處理的轉基因蕓莒屬或水稻植抹可比未經處理的 轉基因對照植株更好地經受住逆境條件。與在未經處理的轉基因蕓苔 屬或水稻植抹中的情況相比，在經處理的轉基因蕓苔屬或水稻植林中 ROS水平較低，而其NAD或ATP水平較高。用不同濃度的吡蟲淋、噻蟲胺、噻蟲嗪、吡蟲清、烯蟲靈、呋蟲 胺、6-氯煙酸和噢蟲啉，處理如EP0477624.7所述的包含轉基因的擬 南芥屬植林，并且使其經受各種逆境條件，特別是高低溫、高光強或 干旱脅迫或它們的任何組合，其中所述轉基因編碼參與NAD拯救途 徑的植物功能性酶。在處理后，目測記錄植林的存活和和損害，并與下列植抹比較 未經處理的轉基因對照植林，和用上述化合物以類似方式處理的非轉 基因同基因植林。測定活性氧物質、NAD和ATP的水平，并與對照 植抹比較。經所述化合物處理的轉基因擬南芥屬植抹可比未經處理的轉基 因對照植株更好地經受住逆境條件。與在未經處理的轉基因擬南芥屬植抹中的情況相比，在經處理的轉基因擬南芥屬植林中ROS水平較低，而其NAD或ATP水平較高。
權利要求
1. 一種用于增強植物逆境耐受性的方法，包括將有效劑量的6-氯煙酸或具有式(I)的化合物，id="icf0001" file="A2006800292940002C1.gif" wi="41" he="23" top= "46" left = "76" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中Het表示在各種情況下任選被氟、氯、甲基或乙基單取代或多取代的雜環，所述雜環選自以下雜環吡啶-3-基、吡啶-5-基、3-吡啶基、1-氧化-5-吡啶基、1-氧化-5-吡啶基、四氫呋喃-3-基、噻唑-5-基，A表示C1-C6-烷基、-N(R1)(R2)或S(R2)，其中R1表示氫、C1-C6-烷基、苯基-C1-C4-烷基、C3-C6-環烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基，和R2表示C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、-C(＝O)-CH3或芐基，R表示氫、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、-C(＝O)-CH3或芐基，或者同R2一起表示下列基團-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2-，-CH2-N(CH3)-CH2-，和X表示N-NO2、N-CN或CH-NO2施用于所述植物或其所在地、或所述植物的種子，其特征在于，所述植物是經工程化從而耐受逆境的植物。
2. 權利要求1所述的方法，其中所述經工程化從而耐受逆境的植 物是轉基因植物，其包含增強逆境耐受性的外源基因。
3. 權利要求2所述的方法，其中所述外源基因編碼PARP抑制性 RNA分子。
4. 權利要求3所述的方法，其中所述外源基因包含以下操作性連 接的DNA片段a. 植物可表達啟動子；b. 編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區，其包含從SEQ ID No 1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸 序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核香酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序列中選擇的20個連續核苷酸中的至少19個核苷脧；和c.轉錄終止和聚腺苷酸化DNA區。
5. 權利要求3所述的方法，其中所述外源基因包含以下操作性連 接的DNA片段a. 才直物可表達啟動子；b. 編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區，其包含從SEQ ID No 1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸 序列、SEQ ID No 4的核普酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQ19個核苷酸；和c. 轉錄終止和聚腺苷酸化DNA區。
6. 權利要求3所述的方法，其中所述外源基因包含以下操作性連 接的DNA片段a. 4直物可表達啟動子；b. 編碼PARP抑制性RNA分子的DNA區，所述RNA包括i.有義核普酸序列，其包含選自SEQ ID No 1的核苷酸序列、SEQ IDNo2的核苷酸序列、SEQIDNo3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的 核苷酸序列、SEQ ID No 5的核香酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序 列的20個連續核普酸中的至少19個核普酸；和ii. 反義核苷酸序列，其包舍與所述有義核苷酸序列中的所述至少 20個連續核苷酸互補的核普酸序列；iii. 其中所述有義和反義核普酸序列能夠形成雙鏈RNA區；和 c.轉錄終止和聚腺苷酸化DNA區。
7. 權利要求6所述的方法，其中所述反義核苷酸序列與所述有義 核苷酸序列有大約95%的序列同 一性或是完全相同的。
8. 權利要求2所述的方法，其中所述外源基因編碼ParG抑制性 RNA分子。
9. 權利要求8所述的方法，其中所述外源基因包含以下操作性連 接的DNA片段a. 沖直物可表達啟動子；b. 編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區，其包含選自SEQ ID No 7的核香酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核 苦酸序列或SEQ ID NolO的核苷酸序列的20個連續核苷酸中的至少 19個核苷酸；和c. 轉錄終止和聚腺苷酸化DNA區。
10. 權利要求3所述的方法，其中所述外源基因包含以下操作性 連接的DNA片段a. 沖直物可表達啟動子；b. 編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區，其包含選自SEQ ID No 7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核 普酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20個連續核苷酸中的至少 19個核苷酸；和c. 轉錄終止和聚腺苷酸化DNA區。
11. 權利要求3所述的方法，其中所述外源基因包含以下操作性 連接的DNA片段a. 才直物可表達啟動子；b. 編碼PARG抑制性RNA分子的DNA區，所述RNA分子包含i.有義核苷酸序列，其包含選自SEQIDNo7的核苷,列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10 的核苷酸序列的20個連續核苷酸中的至少19個核芬酸；和H.反義核苷酸序列，其包含與所述有義核苷酸序列中的所述至少 20個連續核苷酸互補的核苷酸序列；iii.其中所述有義和反義核苷酸序列能夠形成雙鏈RNA區；和c.轉錄終止和聚腺香酸化DNA區。
12. 權利要求11所述的方法，其中所述反義核苷酸序列與所述有 義核苷酸序列有大約95%的序列同 一性或是完全相同的。
13. 權利要求2所述的方法，其中所述外源基因編碼選自以下的 煙酰胺腺噪呤二核苷酸拯救合成途徑的植物功能性酶煙酰胺酶、煙 酸磷酸核糖基轉移酶、煙酸單核苷酸腺苷酰轉移酶或煙酰胺腺噪呤二 核香酸合成酶。
14. 權利要求13所述的方法，其中所述外源基因包含選自以下的 核苷酸序列:SEQ ID 11核苷酸序列、SEQ ID 12核苷酸序列、SEQ ID 13核苷酸序列、SEQ ID 14核苷酸序列、SEQ ID 15核苷斷列、SEQ ID16核苷酸序列、SEQID 17核苷酸序列、SEQID 18核苷酸序列、 SEQ ID 19核苷酸序列、SEQ ID 20核苷酸序列、SEQ ID 21核苷酸序 列、或SEQID22核苷酸序列。
15. 權利要求1 - 14中任一項的方法，其中所述選自新煙堿類的 化合物為吡蟲啉。
16. 權利要求1 - 14中任一項的方法，其中所述選自新煙堿類的 化合物為噻蟲胺。
17. 權利要求1 _ 14中任一項的方法，其中所述選自新煙堿類的 化合物為噻蟲啉。
18. 權利要求1 - 14中任一項的方法，其中所述選自新煙堿類的 化合物為烯蟲靈。
19. 權利要求1 - 14中任一項的方法，其中所述選自新煙堿類的 化合物為吡蟲清。
20. 權利要求1 - 14中任一項的方法，其中所述化合物為6-氯煙酸。
21. 權利要求1的化合物用于按照權利要求2-14中任一項的增 強經工程化從而耐受逆境的植物的逆境耐受性的用途。
22. 權利要求2 - 14中任一項所述的經工程化從而耐受逆境的植 物的種子，其中所述植物已經用權利要求1所述的化合物處理過。
23. 增強植物逆境耐受性的方法，包括用有效劑量的6-氯煙酸或 權利要求1中的式(I)化合物，處理權利要求2-14中任一項所述的經 工程化從而耐受逆境的植物的種子種植于其中的土壤。
24. 權利要求l所述的方法，其中所述植物是所述的轉基因雙子 葉或單子葉植物、植物細胞或其種子。
25. 權利要求1所述的方法，其中所述種子用0.1 g/100kg種子-1000 g/100kg種子的量的權利要求1中所述的化合物處理。
26. 權利要求1所述的方法，其中所述植物用權利要求1中的化 合物以每公項10g- 1600g的施用比例處理。
27. 包裝產品，其至少包含a. 權利要求l中所述的化合物，和b. 權利要求2-14中任一項所述的經工程化從而耐受逆境的植 物或所述植物的種子。
全文摘要
本發明涉及增強植物和其細胞逆境耐受性的方法，其中將新煙堿類化合物(例如但不限于吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、呋蟲胺、烯蟲靈、吡蟲清或噻蟲啉)施用于植物或其細胞，其中所述植物或其細胞包含經過修飾從而使所述植物或其細胞更耐受逆境的基因組，即是經工程化從而耐受逆境的植物。與基因修飾型逆境耐受性植物或其細胞聯用的特別有效的逆境耐受增效劑是包含氯吡啶側鏈的新煙堿類化合物，如吡蟲啉、噻蟲啉、吡蟲清、烯蟲靈和6-氯煙酸(6-CNA)。
文檔編號A01N47/40GK101267737SQ200680029294
公開日2008年9月17日 申請日期2006年5月26日 優先權日2005年6月4日
發明者M·德布洛克, M·梅特茲拉夫, W·蒂勒特 申請人:拜爾農作物科學股份公司