多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑、及其制備和應用的制作方法

專利名稱：：多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑、及其制備和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物農藥可濕性粉劑及其應用和制備方法。更具體地說，本發明涉及一種多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑及其制備方法，以及該多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑在防治植物細菌性和真菌性土傳病害以及葉部病害方面的應用。
背景技術：
：近年來，隨著環境的惡化、作物連作以及單一種植，土傳病害和葉部病害的發生越來越嚴重，這已經嚴重影響了整個農業的發展。因此，解決土傳病害和葉部病害顯得越來越重要。對植物細菌性和真菌性土傳以及葉部病害(如青枯病、枯萎病、角斑病、葉斑病等)，到目前為止還沒有很好的化學農藥進行防治，主要原因是這些病害容易對化學農藥產生抗藥性。現在研制和開發微生物農藥來防治植物細菌性和真菌性土傳以及葉部病害受到國內外的廣泛關注。現在土傳病害的防治一般采取如下方法輪作、品種選育、栽培防病(如深溝高畦栽培、嫁接防病等)、土壤消毒(如石灰消毒、高溫消毒等)、藥劑防治(防治真菌性土傳病害土菌消、敵克松、綠亨一號、五氯硝基苯、根腐寧、惡霉靈、多菌靈、托布津等；防治細菌性土傳病害水合霉素、農用鏈霉素、絡氨銅等)。但上述方法中有些在使用時受到限制或對技術要求較高，如輪作、嫁接等；而有些藥劑對土傳病害的防治效果不理想，特別是后期防效很差。而葉部病害的防治一般采取如下方法輪作、品種選用、種子處理、土壤處理、栽培管理、藥劑防治(防治真菌性葉部病害納農蔬福、普力克、安克錳鋅、菌立滅、易保、克露、755猛殺生干、百菌清、托布津、多菌靈、代森鋅、代森銨、炭疽福、農抗120等；防治細菌性葉部病害可殺得、豐護安、綠乳銅、細菌凈、農用鏈霉素、新植霉素、DT殺菌劑、抗菌劑401、DTM、甲霜鋁銅等)。由上述防治所使用的藥劑可知，雖然現在市場上有可同時防治土傳病害和葉部病害的藥劑，如多菌靈、農用鏈霉素、托布津等，但其防效不理想，特別是后期防效很差。更沒有可以同時防治植物細菌性和真菌性土傳以及葉部病害的藥劑，如多菌靈和托布津一般是防治真菌性病害，而農用鏈霉素一般用來防治細菌性病害。此外，上述藥劑全是以化學物質為有效成分的農藥，而非微生物農藥。在微生物農藥的研制與開發中，劑型的開發起著至關重要的作用。它決定一個生物防治用的菌株(下文簡稱"生防菌")是否能夠真正形成產品。很多在實驗室成功篩選出的生防菌株卻在田間應用時失敗，其主要原因就是劑型問題沒有得到很好的解決。與化學農藥相比，微生物農藥劑型加工更困難。首先，微生物是不溶于水的生物體，其顆粒大小可以從不足0.5nm到lOpm以上，這種顆粒的疏水性直接影響制劑的潤濕性、分散性和懸浮性等物理性能。其次，作為活的生物體，微生物對外界環境因素如溫度、濕度和光照等比較敏感，制劑貯存穩定性差，作用速度慢。微生物作為活體，與各種助劑的相容性一般比化學農藥差，某些助劑可能完全不能使用。因此，微生物農藥的劑型加工好壞或制劑化程度的高低已成為制約微生物農藥成功開發的瓶頸。我國已商品化的一些微生物農藥和農用抗生素已涵蓋了目前化學農藥所涉及的劑型。如熒光假單胞桿菌有水劑和粉劑，蠟質芽孢桿菌有可濕性粉劑和懸浮劑，蘇云金芽孢桿菌的劑型種類比較多，有顆粒劑、可濕性粉劑、水分散粒劑和懸浮劑等。微生物農藥的劑型加工很大部分是模仿化學農藥進行的，只有少部分是微生物農藥特有的。目前微生物農藥劑型加工也逐漸從水基制劑向油基制劑，從液體制劑向固體制劑，從粉末制劑向顆粒狀制劑方向發展。但是，由于生防菌株很容易從產品中分離獲取，微生物農藥劑型是對微生物農藥技術秘密的最有效的保護。因此，有關微生物農藥劑型的研究很少有文獻報道。目前，我國微生物農藥劑型的研究還不夠深入，主要表現為劑型單一、缺乏高水平的劑型、制劑質量不穩定(貯存期短)、助劑(保護劑和增效劑等)研究不夠以及劑型不規范和名稱混亂等。相當多微生物農藥制劑產品的指標，達不到質量標準的要求，或其標準所規定的指標比國外同類品種的指標要低得多，于是出現了含水量偏高、懸浮率低、穩定性差等現象，使微生物農藥的效果得不到充分的發揮。關于微生物活菌制劑可濕性粉劑方面的內容已公開了相關專利。US5304376和EP0381290公開了一種由真菌產生的物質的可濕性粉劑及其制備，主要用來防治由真菌病原菌引起的植物病害。加拿大專利(專利號2367775)公開了一株可防治植物真菌病害的短小芽孢桿菌(NRRLNo.B-30087)，并介紹了幾種制劑劑型，其中含有細粒劑、液體懸浮劑、可濕性粉劑、微膠囊劑和可乳化濃縮劑，但是沒有涉及如何制備可濕性粉劑。CN1232873公開了一種芽孢乳酸菌粉劑的生產方法，其主要內容是通過發酵的發酵液和麥芽糊精攪拌均勻后噴霧干燥，從而得到含耐熱芽孢乳酸菌活菌濃度較高的粉劑。該專利只是涉及到了該粉劑的整個生產過程，沒有涉及該粉劑的應用對象，也沒有說明其噴霧干燥操作工藝，更沒有提及采取的是何種噴霧干燥方式。CN1237346公開了一種枯草芽孢桿菌菌劑、制法及其使用方法。該發明中的菌劑含有菜豐寧B1菌株、菜豐寧B2菌株、麥豐寧B3菌株，活菌總量為5億/克以上。發酵液與吸附劑混合后，粉碎過篩，得到粉劑。采用拌種、灌根、蘸根、噴霧等方法進行種子處理或苗期處理來防治小麥紋枯病。中國專利CN1415210和CN1723780分別公開了一種真菌孢子可濕性粉劑，但其主要內容只是涉及載體、助劑、保護劑等的配比，并且其可濕性粉劑是由商品化的高含量的孢子粉和載體、助劑以及保護劑通過機械混合而得到的。其目的只是通過助劑和保護劑的作用提高真菌孢子粉的貯存期和所述粉劑能夠在生產、貯存、應用過程中保證孢子的生物活性和防治效果。中國專利CN1255541公開了"一種枯草芽孢桿菌菌株、制法、制劑及應用"，枯草芽孢桿菌培養物和膨潤土及高嶺土配制成可濕性粉劑，主要用來防治蘋果霉心病和枝干病害等。中國專利CN1398521公開了一種防病微生物農藥可濕性粉劑，所述可濕性粉劑由兩種芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌N,和芽孢桿菌N》發酵的發酵液和穩定劑、助劑混合后，通過高壓噴霧干燥而得。所得可濕性粉劑用來防治小麥全蝕病、蔬菜立枯病、灰霉病和疫病。中國專利CN1421139公開了一種含有蘇云金芽孢桿菌的懸浮劑和可濕性粉劑的方法，其可濕性粉劑制備方法為將一定比例的原料混合后利用氣流粉碎機粉碎到一定細度的粉劑即可，方法簡單，其主要目的是為了提高復配農藥的殺蟲效果。由上述公開的微生物農藥可濕性粉劑的專利可知，它們涉及到的可濕性粉劑制備方法大都是采用粉碎法和壓力噴霧干燥法，未見直接說明是采用離心式噴霧干燥法來制備可濕性粉劑的。在多粘類芽孢桿菌的專利方面，CN1353182公開了一株多粘類芽孢桿菌中的對稻瘟病具有拮抗作用的抗真菌蛋白及其基因。CN1844360公開了一株多粘類芽孢桿菌利用豆渣生產微生物絮凝劑的生產工藝。CN1475467公開了一種含有多粘類芽孢桿菌的生物肥料，主要用于竹林培育。CN1414093公開了一種直接分解秸稈為肥的微生物肥料菌劑，在該菌劑中一共有10種細菌，其中含有多粘類芽孢桿菌，其主要用途是有效利用秸稈等能源并提供環境友好的生物肥料。CN1687399公開了一種防病促生長植物內生多粘類芽孢桿菌，其主要內容只是涉及該菌的特征、形態和防病機理，并利用幾種植物病原菌進行了抑菌譜測定。該專利并沒有涉及多粘類芽孢桿菌制劑，也沒有利用該菌的制劑在田間進行防治試驗。US6602500公開了一株多粘類芽孢桿菌ATCC202127，其產生的蛋白可以抑制真菌的生長，特別是丄印tos/7/mm'fl5^。專利WO/2006/016558中也涉及到了多粘類芽孢桿菌，但只是公開了幾株對植物病害有防治作用的菌株和產生的物質，沒有涉及到利用多粘類芽孢桿菌制備成制劑及其制劑的大田防治試驗。專利WO/2002/072795發現了幾株對植物病害具有防治作用的菌株，其中包括多粘類芽孢桿菌。由本發明人發明的中國專利ZL02151019.9、PCT申請(WO2004/050861)和美國專利(US2006/0018883)主要涉及一種多粘類芽孢桿菌細粒劑及其在植物病害防治方面的用途。雖然該細粒劑在田間對青枯病表現較好的防治效果，但由于細粒劑在大面積使用時暴露出來的不能噴霧、有效成分即活菌含量低、使用前需長時間浸泡等問題，影響了多粘類芽孢桿菌細粒劑的大面積推廣。而關于多粘類芽孢桿菌的芽孢培養工藝、可濕性粉劑制備以及利用該可濕性粉劑進行的藥劑復配及其利用該可濕性粉劑和復配藥劑來進行植物病害防治，未見文獻報道。雖然目前利用細菌和真菌作為有效成分開發成微生物農藥可濕性粉劑的專利較多，但大部分是利用已經商品化的原藥來進行載體、助劑和保護劑等的篩選以提高防效或貯存期，并且其制備方式一般為壓力式噴霧或機械混合后粉碎而得可濕性粉劑，未見活菌制劑利用離心式噴霧法來制備的專利。而關于多粘類芽孢桿菌的專利，主要是關于其抗菌蛋白、絮凝劑和菌肥，即使涉及到利用該菌來防治植物病害，也只有本發明人以前發明的細粒劑及其用于植物病害的田間防治，其它的大部分專利還停留在實驗室階段，沒有形成制劑，更沒有利用形成制劑的產品在田間防治植物病害。也沒有一個專利是涉及到多粘類芽孢桿菌芽孢形成和將多粘類芽孢桿菌制備成可濕性粉劑。利用多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑進行藥劑復配也未見文獻報道。雖然由本發明人發明的專利和/或申請(ZL02151019.9、WO2004/050861、US2006/0018883)涉及到了多粘類芽孢桿菌細粒劑，但并未涉及可濕性粉劑，也沒有涉及到多粘類芽孢桿菌是芽孢狀態還是非芽孢狀態，并且其主要防治對象是青枯病。因此，研究多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的成分及其加工方法與應用，有利于進一步開發多粘類芽孢桿菌的用途，使其更好地被用來防治植物細菌性和真菌性土傳和葉部病害，促進農藥，特別是微生物農藥產品產業化的發展。
發明內容本發明的目的是為了提供一種可防治植物細菌性和真菌性土傳病害以及葉部病害的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑。本發明對已經在大田對土傳病害表現良好防治效果的多粘類芽孢桿菌進行培養，獲得高活菌含量的發酵液，然后將其與載體和助劑混合后，經過離心噴霧干燥得到一種可濕性粉劑，該可濕性粉劑可有效防治細菌性和真菌性土傳病害和葉部病害，從而完成了本發明。本發明第一方面提供了多粘類芽孢桿菌(戶ae"/^c///^/w/少m;;;ra)培養基和培養工藝的優化，以期獲得較為合適的可以進行可濕性粉劑生產的多粘類芽孢桿菌發酵液。本發明第二方面提供了一種制備上述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的方法，該方法包括將多粘類芽孢桿菌發酵液、載體、助劑混合，得到固含量重量百分比為5%50%的液固混合物，然后在10030(TC的進風溫度、每小時5kg200kg料的進料速度下經離心噴霧干燥，得到所述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑。所述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑中的活菌含量為lxl07cfb/glxl012cfU/g;所述載體選自白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土中的一種或多種；所述助劑包括潤濕劑和分散劑，其中潤濕劑選自十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、丁基萘磺酸鈉、烷基萘磺酸鹽中的一種或多種，分散劑選自六偏磷酸鈉、羥甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸鹽縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、黃原膠、(3—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的一種或多種。本發明第三方面涉及本發明的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑在防治植物細菌性和真菌性土傳病害及葉部病害中的應用。本發明首次將多粘類芽孢桿菌開發成微生物農藥可濕性粉劑，其對病害的防治范圍廣、防效高，不僅能有效地防治植物細菌性和真菌性土傳病害，而且對細菌性和真菌性葉部病害也具有很好的防效。該可濕性粉劑不僅可以單獨使用，而且也可以和其它微生物農藥和助劑復配來使用。具體實施方式本發明第一方面提供了一種多粘類芽孢桿菌(尸aem'^c/〃wjw/;^y;ra)可濕性粉劑，它由多粘類芽孢桿菌、載體和助劑組成，所述多粘類芽孢桿菌在可濕性粉劑中的活菌含量為Ixl07cfo/glxl012cfii/g。在一個較佳的實施方案中，所述載體選自白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土中的一種或多種；所述助劑包括潤濕劑和分散劑，其中潤濕劑選自十二垸基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、丁基萘磺酸鈉、烷基萘磺酸鹽中的一種或多種，分散劑選自六偏磷酸鈉、羥甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸鹽縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、黃原膠、(3—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的一種或多種。在另一個較佳的實施方案中，所述多粘類芽孢桿菌是多粘類芽孢桿菌HY96-2，其保藏號為CGMCCNo.0829。關于該菌株的鑒定和其它信息可參見中國專利ZL02151019.9，該文全部內容納入本文作為參考。然而，本領域技術人員應當理解，本發明的實施并不局限于這一具體的多粘類芽孢桿菌菌株。在本發明的另一較佳的實施方案中，所述潤濕劑優選為十二垸基苯磺酸鈉和烷基萘磺酸鹽中的1種或2種，所述分散劑優選為烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和P—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的1種或2種。上述助劑包括潤濕劑和分散劑，所述潤濕劑在可濕性粉劑中的重量百分比通常為0.01%10%，較佳為0.1%5%，更佳為1%3%;所述分散劑在可濕性粉劑中的重量百分比通常為0.01%10%，較佳為0.1%5%，更佳為1%3%。本發明上述的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑可用以下方法獲得，該方法包括將含有多粘類芽孢桿菌活菌的發酵液、載體和助劑混合，得到固含量重量百分比為5%50%的液固混合物，然后在10030(TC的進風溫度、每小時5kg200kg料的進料速度下經離心噴霧干燥，得到所述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑。本發明所用的術語"發酵液"、"活菌"、"載體"、"助劑"、"可濕性粉劑"、"土傳病害"、"葉部病害"、"離心噴霧"等具有本領域技術人員通常熟知且承認的含義。在一個較佳的實施方案中，所述多粘類芽孢桿菌活菌來自多粘類芽孢桿菌發酵液，所述發酵液含有芽孢狀態的多粘類芽孢桿菌活菌、非芽孢狀態的多粘類芽孢桿菌活菌、和/或所述多粘類芽孢桿菌的代謝產物。所述發酵液可通過在適合生長的條件下培養多粘類芽孢桿菌(具體例如上述的多粘類芽孢桿菌HY96-2)，使其生長至一定的濃度來獲得。用于培養本發明中菌株的培養基中的營養源沒有特別的限制。本領域技術人員可以根據公知的技術來選擇合適的碳源、氮源和其它營養源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米粉等。氮源可以是蠶蛹粉、大豆粉、花生餅粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麥皮、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其它有機或無機含氮化合物。另外，培養基中還可適當加入一些無機鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽如磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通常可采用各種已知的常規培養基，如LB瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養基和牛肉浸汁瓊脂培養基等。培養本發明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉速等條件沒有特別嚴格的限制，只要該條件適合該菌的生長即可。在培養時可采用豆油、泡敵等消泡劑進行消泡。在一些較佳的實施方案中，pH宜控制在5.58.0之間，培養溫度宜在2537T:之間。培養時間通常在12h72h之間，最終的菌濃度通常可高達5xlO、fli/mllxlOUcfU/ml。在本發明的一個較佳的實施方案中，宜使所述發酵液中含有較高含量的芽孢，以賦予微生物耐高溫的特性，以便在后續的噴霧干燥過程中獲得更高的活菌含量。為了獲得含芽孢的多粘類芽孢桿菌發酵液，通過培養基中的碳、氮源和無機鹽的優化得到了較合適的培養基組份，并且通過調節培養過程中的氣液比、轉速來改變培養環境的溶氧水平(DO)，通過調節培養基的pH和延長培養時間，可以使培養過程中的活菌芽孢率在0100%之間變化，較佳的是使活菌芽孢率在10%以上，更佳的是在30%以上，還要佳的是在50%以上。在本發明的一個較佳的實施方案中，所述多粘類芽孢桿菌通過以下方法培養獲得在含有碳源、氮源、無機鹽的培養基中，在通氣量控制在氣液比為0.2:12:1、轉速在100r/min或以上，培養所述多粘類芽孢桿菌24小時以上，發酵結束時的培養基pH控制為7.09.0，其中所述碳源選自葡萄糖、淀粉和大米粉中的1種或幾種，所述氮源選自蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和大豆粉中的l種或幾種，所述無機鹽除了常規的無機鹽(如MgS04、(NH4)2S04、KH2P04、NaCl、K2HP04和CaC03夕卜)還包含Mn2+，該Mn2+的濃度宜為0.005%0.01%。上述列舉的這些參數只是實現本發明的較佳方案。因此，本領域技術人員在上述范圍以外選擇合適的培養條件也能獲得本發明的發酵液。所述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑中的載體和助劑對本發明的多粘類芽孢桿菌活菌體、發酵液以及可濕性粉劑防治植物病害的生物效果無影響。所述載體可選自白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土及其混合物，其中較佳的載體是白碳黑、硅藻土、淀粉和輕質碳酸鈣中的一種或多種。助劑包括潤濕劑和分散劑，其中潤濕劑選自十二烷基苯磺酸鈉、十二垸基硫酸鈉、丁基萘磺酸鈉、烷基萘磺酸鹽中的一種或多種，分散劑選自六偏磷酸鈉、羥甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸鹽縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、黃原膠、P—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的一種或多種。在上述潤濕劑和分散劑中，較佳的是潤濕劑為十二垸基苯磺酸鈉和烷基萘磺酸鹽中的l種或2種；所述分散劑為烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和J3—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的l種或2種。潤濕劑和分散劑在可濕性粉劑中的重量百分比皆為0.01%10%。上述這些載體和助劑均可市售購得。載體細度要求通過44pm篩的比例大于95y。，更佳為大于98%。為了便于長期貯存，將發酵液與載體、助劑按照一定的比例混合后(固含量重量百分比為5%50%)得到的液固混合物，分別采用壓力式噴霧和離心式噴霧來試制可濕性粉劑。由于壓力式噴霧后的產品中的活菌含量較低(不足10、fo/g)，而離心式噴霧得到的可濕性粉劑活菌含量都高于10、fo/g，故采用如下的離心噴霧干燥工藝來生產高活菌含量的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑離心轉子轉速700015000r/min、進風溫度100。C300。C(優選為150。C250。C，更佳為180。C220'C)、風量10008000m3/h、物料的進料速度5kg/h200kg/h(根據進料的固含量、進風溫度和出風溫度來調整)、設備負壓1001000Pa、氣錘頻率0.11Hz。上述可濕性粉劑干燥步驟采用本領域中的常規技術，例如但不局限于離心式噴霧干燥。為了能使多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑中的有效成分盡可能保持較高的含量和較長的je存期，含有多粘類芽孢桿菌的可濕性粉劑含水量的重量百分比宜控制在小于20%，更佳為小于15%。在一個較佳的實施方案中，本發明涉及的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑其活菌含量為lxl()7dWglxl(^cfo/g，細度(通過44pm篩)大于95%，懸浮率大于34%，潤濕時間小于180s，滿足國家對農藥可濕性粉劑的要求D本發明中涉及的防治植物細菌性和真菌性土傳及葉部病害的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑使用方法就是農業中常用的灌根和噴霧的方法。上述用藥方法，如將可濕性粉劑稀釋一定倍數后對植物進行灌根的方法和稀釋后利用噴霧設備進行噴霧的方法是本領域中的常規技術。本發明者還發現，本發明的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑不僅可以通過灌根來防治植物細菌性和真菌性土傳病害，如青枯病、枯萎病、軟腐病、根腐病、莖基腐病、猝倒病、立枯病等，而且可以通過噴霧來防治細菌性和真菌性葉部病害，如角斑病、赤星病、葉斑病、斑枯病、潰瘍病、穿孔病、炭疽病、灰霉病、霜霉病等。本發明的內容、優點和目的可從下文進一步詳細描述中清楚地得知。實施例1多粘類芽孢桿菌發酵液中芽孢培養工藝本實施例通過培養基成分的優化和改變培養條件來實現多粘類芽孢桿菌的芽孢培養工藝。方法(1)培養基的優化本實施例從淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米等中篩選出合適的碳源。從蠶蛹粉、大豆粉、花生餅粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麥皮、酵母粉、玉米漿、銨鹽等中篩選出合適的氮源。從氯化鈉、磷酸鹽、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽中篩選出合適的無機鹽。以發酵液中的芽孢率高低為篩選標準，綜合考慮發酵液的活菌含量。本實施例的篩選步驟如下先采用單因子試驗進行碳、氮源的篩選，再采用正交試驗進行選定碳、氮源濃度的篩選。上述的單因子試驗和正交試驗為本領域技術人員通常熟知且承認的培養基優化的方法。(2)培養工藝的優化本實施例通過改變如下發酵參數來控制多粘類芽孢桿菌發酵液中的活菌芽孢率通氣量、轉速、pH、培養時間。結果與分析(1)培養基的優化本部分發明考察了幾種常用的碳、氮源和無機鹽對多粘類芽孢桿菌產芽孢的影響。不同碳源對多粘類芽孢桿菌培養后的芽孢和活菌含量影響見表1。由表可見，從菌體芽孢率的高低來看，葡萄糖、淀粉和大米粉是比較合適的碳源。表1不同碳源對多粘類芽孢桿菌活菌及芽孢形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從蠶蛹粉、大豆粉、花生餅粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麥皮、酵母粉、玉米漿、銨鹽中選出幾種氮源，考察不同氮源對多粘類芽孢桿菌培養后的芽孢和活菌含量的影響，部分結果見表2。由表可見，從菌體芽孢率的高低來看，蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和大豆粉是比較合適的氮源。表2不同氮源對多粘類芽孢桿菌活菌及芽孢形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上面的單因子試驗結果，選出葡萄糖、淀粉、大米粉、蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和大豆粉作為碳、氮源作進一步的篩選，通過正交試驗確定碳氮源合適的使用濃度，以芽孢率的高低為主要篩選標準，參考發酵液的活菌含量，最后得到的比較合適的碳氮源重量百分含量為葡萄糖0.1°/。3%;淀粉0.5%3%;大米粉1%3.5%;蛋白粉0.01%3%;酵母粉0.01%4%;花生餅粉0.5%4%;大豆粉0.2%4.5%。在多粘類芽孢桿菌的培養基中，已經含有部分無機鹽，故本部分試驗在其它無機鹽種類和含量不變的情況下，優化了Mr^+濃度對多粘類芽孢桿菌培養后的芽孢和活菌含量的影響，其結果見表3。表3不同Mi^對活菌及芽孢形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表3可知，隨著Mi^+濃度的增加，芽孢率先增加，后減少，故最后確定Mn^的重量百分含量為0.005%0.01%左右。(2)培養工藝的優化本部分發明考察了通氣量和轉速的改變來改變DO以及pH的調節和培養時間的延長對多粘類芽孢桿菌產芽孢的影響。發酵結果表明，當多粘類芽孢桿菌在上述優化后的培養基中發酵時，氣液比(每小時通氣量(m3)與發酵液體積(m3)的比)由0.2:1調整為2:1時，發酵不同時間后的芽孢率如下表4。表4不同通氣量對芽孢形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表4可知，當通氣量加大時，芽孢形成時間提前。在2:l的氣液比下，24h就可觀察到有芽孢形成，在44h時，其芽孢率可達100%;而0.2:1的氣液比在32h才觀察到有芽孢形成，在48h時，其芽孢率才為80%。由此可知，加大通氣量，可以縮短芽孢形成的時間，提高芽孢率。由表4數據也可知，發酵時間的延長有利于芽孢率的提高。發酵罐攪拌速度對多粘類芽孢桿菌發酵液中活菌芽孢率(以培養36h為參考)的影響見表5。由該表可見，在其它發酵條件不變的情況下，當攪拌轉速逐漸升高時，發酵液中的活菌芽孢率逐漸提高。由此可見，提高攪拌速度可以提高芽孢率。表5不同攪拌轉速對芽孢形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>此外，通過調節發酵液的pH考察了pH對多粘類芽孢桿菌芽孢率的影響。當通過自動補加酸堿來控制整個培養過程中發酵液的pH在7左右時，即使在發酵時間為36h時，菌體也沒有芽孢形成。當pH調節為偏堿時(pH為7.09.0)，芽孢大量形成。由此可知，可以通過調節發酵液的pH來控制多粘類芽孢桿菌芽孢率的高低。綜合該部分的結果，多粘類芽孢桿菌芽孢培養工藝為培養基中除了基本的無機鹽外，其它的成分及其重量百分含量為葡萄糖0.1%3%;淀粉0.5%3%;大米粉1%3.5%;蛋白粉0.01%3%;酵母粉0.01%4%;花生餅粉0.5%4%;大豆粉0.2%4.5%;Mn2+:0.005%0.01%，通氣量控制在氣液比為0.2:12:1，轉速控制在100r/min或以上，發酵結束時的培養基pH控制在偏堿(pH為7.09.0)，培養時間大于24h。實施例2多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑載體的選擇本實施例從白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土及其混合物中篩選適合多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的載體，以產品中的活菌含量高低作為篩選標準。多粘類芽孢桿菌HY96-2按照實施例1所述的培養工藝進行培養，得到多粘類芽孢桿菌發酵液。然后將上述載體逐步加入所述多粘類芽孢桿菌發酵液中，混合至載體完全潤濕但無明顯游離水后，將混合物放在烘箱中干燥后碾磨，得到細粉。由于不同載體吸附能力不同，因此單位重量的載體吸附的發酵液重量不盡相同。測定干燥前后樣品的活菌量。活菌含量的測定采用本領域技術人員通常熟知且承認的稀釋涂平板法。結果與分析本發明利用同一批多粘類芽孢桿菌的發酵液和不同載體混合后制備成制劑，干燥后其活菌含量分別為白碳黑5.7xl0、fii/g，硅藻土2.8xl0、fb/g、淀粉5.9xl0ScfU/g、高嶺土4.8xl08cfU/g、滑石粉1.0xl08cfo/g、膨潤土9.9xl07cfo/g、輕質碳酸鈣8.3xl08cfo/g、凹凸棒土6.8x107cfo/g、草炭土5.6xl0cfo/g。其中，白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣、高嶺土作為載體制備的制劑的活菌含量比較高，故從制劑的活菌含量來看，適合于制備高含量活菌可濕性粉劑的載體可選用白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣和高嶺土。實施例3多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑助劑的篩選本實施例篩選的助劑包括潤濕劑和分散劑。本實施例從十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、丁基萘磺酸鈉、烷基萘磺酸鹽中篩選合適的潤濕劑；從六偏磷酸鈉、羥甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸鹽縮聚物、聚乙烯、烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、黃原膠、|3—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中篩選合適的分散劑。潤濕劑的篩選以可濕性粉劑潤濕時間的長短作為篩選標準，時間越短，潤濕效果越好；分散劑的篩選以可濕性粉劑的懸浮率高低作為篩選標準，懸浮率越高，效果越好。本實施例的助劑篩選步驟如下將上述已經篩選好的載體和按照實施例1所述的培養工藝進行培養獲得的發酵液混合后干燥，碾磨得到粉末狀物質，再分別與潤濕劑或分散劑以一定比例混合均勻，分別測定各樣品的潤濕時間和懸浮率。潤濕時間和懸浮率的測定方法為本領域技術人員通常熟知且承認的方法，具體可參考農藥可濕性粉劑國家標準中的相應部分。結果與分析(1)潤濕劑的灘選本部分發明考察了幾種常用潤濕劑對以白碳黑、硅藻土、淀粉和輕質碳酸鈣為載體的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的潤濕時間的影響(見表6)。表中對照1為水和載體混合樣品、對照2為滅菌后空白培養基和載體混合樣品、對照3為發酵液和載體混合樣品。表6顯示了加入不同潤濕劑后樣品的潤濕時間。由表可知，加了潤濕劑的樣品潤濕時間明顯少于對照l、2和3，其中十二烷基苯磺酸鈉和烷基萘磺酸鹽的效果最為明顯。根據潤濕時間越短潤濕性越好的原則，選擇十二烷基苯磺酸鈉和垸基萘磺酸鹽作為合適的潤濕劑。表6潤濕劑的篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)分散劑的篩選本部分發明考察了幾種分散劑對可濕性粉劑活菌懸浮率的影響，結果見表7，表中的對照為未加入助劑的樣品。從表7可以看出，與對照相比，這9種分散劑都能提高樣品的懸浮率，但是以烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和P—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽的效果最為明顯。加入這兩種分散劑后，白碳黑樣品的懸浮率可以提高31%33%;硅藻土樣品的懸浮率可以提高32.8%36%;淀粉樣品的懸浮率可以提高26.3%29.6%;輕質碳酸鈣的懸浮率可以提高5.42%23.1%。可見分散劑的加入能顯著提高制劑的懸浮性能，在制劑活菌含量不變的情況下，解析到水中的活菌量能增加5.42%36%。這預示著在大田使用時，和對照相比，如要達到同樣的防治效果，用量可以減少5.42%36%。這可明顯降低使用成本，有利于產品的大面積推廣。表7分散劑的篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(3)潤濕劑和分散劑使用濃度的篩選對選出的潤濕劑(十二烷基苯磺酸鈉和烷基萘磺酸鹽)和分散劑(烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和P—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽)進行合適濃度的篩選。利用單因子試驗和正交試驗對潤濕劑和分散劑的濃度進行了篩選，潤濕劑的濃度的篩選以可濕性粉劑潤濕時間的長短作為標準，時間越短，潤濕效果越好；分散劑濃度的篩選以可濕性粉劑的懸浮率高低作為標準，懸浮率越高，效果越好。最后確定了其比較合適的濃度潤濕劑為十二烷基苯磺酸鈉和垸基萘磺酸鹽中的l種或2種，其在可濕性粉劑中的重量百分比為0.01%10%，分散劑為烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和P—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的1種或2種，其在可濕性粉劑中的重量百分比為0.01%10%。由實施例2和實施例3可以得出多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的載體和助劑配方為載體為白碳黑、硅藻土、淀粉和輕質碳酸鈣，潤濕劑為十二烷基苯磺酸鈉和烷基萘磺酸鹽中的1種或2種，分散劑為烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和P—萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的1種或2種，其在可濕性粉劑中的重量百分比皆為0.01%10%。實施例4多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法下面對多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法進行進一步的說明，并對制備出的可濕性粉劑參照國家標準進行了各項指標的測定。干燥方式壓力式噴霧、離心式噴霧。干燥條件按照實施例1所述的培養工藝獲得多粘類芽孢桿菌發酵液，該多粘類芽孢桿菌發酵液不僅含有活菌(包括芽孢狀態和非芽孢狀態)，而且還含有活菌的代謝產物。活菌含量、含水量、芽孢率、pH、懸浮率、潤濕時間以及細度的測定方法為本領域技術人員通常熟知且承認的方法。將該發酵液與實施例2和3篩選出的載體、助劑混合，得到的液固混合物通過料泵輸送到噴霧塔內進行噴霧干燥，要求可濕性粉劑的水份重量百分比低于15%。結果與分析(1)壓力式噴霧在壓力式噴霧中，首先采用了一個條件摸索該干燥方式是否可行，其操作條件為發酵液和載體以及助劑混合后的液固混合物中的固含量為5%(重量)，噴霧干燥處理溫度為190°C220°C，壓力式噴霧設備的高壓泵壓力為13MPa。其壓力式噴霧干燥結果見表8。表8通過壓力式噴霧制備多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注解"對照"為無固形物的多粘類芽孢桿菌發酵液直接經過壓力式噴霧設備的高壓泵后得到的液體，然后測定其活菌含量。該發酵液進高壓泵前活菌含量為3.5X108cfo/mL。由表8的數據可知，通過壓力式噴霧設備的高壓泵后的發酵液中，多粘類芽孢桿菌活菌含量只有6.5X104cfo/mL，鏡檢發現視野中只有少數的完整細胞，大部分菌體都已經破裂。即使在有載體(白碳黑、硅藻土、淀粉和輕質碳酸鈣)吸附時，噴霧干燥后的產品中活菌含量也很低，最高才2.9Xl(^cfo/g。由此可見，由于壓力式噴霧對細胞的破碎太強，因此該方法不適合多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的生產。(2)離心式噴霧利用離心式噴霧塔采用如下的操作工藝來試制多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑，其操作步驟如下①開啟總電源；②開啟蒸汽或/和電加熱系統，開啟空壓系統；③開啟風機；④開啟離心轉子冷卻泵，開啟離心轉子和氣錘；當進風和出風溫度達到要求后，開啟料液輸送泵進行噴霧。⑥結束時，按照如下順序逐一關閉電路輸料泵、加熱系統、離心轉子、氣錘、空壓、風機、冷卻泵、總電源。相關的控制條件如下離心轉子轉速700015000r/min、進風溫度100。C300。C(優選為150°C250°C，更佳為180°C220°C)、風量10008000m3/h、物料的進料速度5kg/h200kg/h(根據進料的固含量、進風溫度和出風溫度來調整。優選為50kg/h150kg/h，更佳為80kg/h120kg/h)、設備負壓1001000Pa、氣錘頻率0.1lHz。表9中列出了16個批次離心式噴霧后的可濕性粉劑產品的活菌和水含量數據，由表9中數據可知，在上述離心式噴霧塔的操作工藝下，當進料的液固混合物中的固含量為5%50%時，經過離心式噴霧塔干燥后得到的可濕性粉劑的活菌含量都在107cfo/g上。由此可看出，通過離心式噴霧來制備高活菌含量的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑是成功的。表9通過離心噴霧制備多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑制備的離心式噴霧干燥工藝確定為含有非芽孢或芽孢狀態活菌的多粘類芽孢桿菌發酵液和載體、助劑混合后的固含量為5%50%，噴霧干燥進風溫度為10(TC30(TC，進料速度根據出風溫度和可濕性粉劑的水含量來控制，為了使產品的水含量低于15%，出風溫度控制在55。C15(TC左右。對得到的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑，根據農藥可濕性粉劑的要求進行了各項指標的測定，其結果見下表IO。表10多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的各項指標測定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>由表IO結果可知，噴霧得到的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑各項指標都符合農藥可濕性粉劑的國家標準。實施例5多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑對植物病害的防治自2006年以來，利用實施例4中制備的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑，分別在山東、廣東、海南、上海、河北、內蒙古、江西、四川、浙江、廣西等地進行了防治植物細菌性和真菌性土傳病害以及葉部病害的初步藥效試驗，結果見表U表14。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表12多粘類芽孢桿幽Bj濕性粉劑(l抑倍)防治葉商[!病害田間試驗示范效果(2006年6月U月)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表13多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑對大白菜軟腐病的防治效果統計表(江西南昌2006年11月)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表14多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑對大白菜黑腐病的防治效果統計表(江西南昌2006年11月)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由上述防治數據可知(1)多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑灌根可有效防治土傳病害，如青枯病、軟腐病、枯萎病、根腐病、莖基腐病、猝倒病、立枯病等植物細菌性和真菌性土傳病害；(2)多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑可通過噴霧來防治細菌性和真菌性葉部病害，如角斑病、赤星病、葉斑病、斑枯病、潰瘍病、穿孔病、炭疽病、灰霉病、霜霉病等；(3)可濕性粉劑濃度越高，防效越好。上述初步的試驗結果表明，本發明涉及的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑有望成為可同時防治細菌性和真菌性土傳及葉部病害的廣譜性微生物農藥。盡管上面已經描述了本發明的具體例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。權利要求1.一種多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)可濕性粉劑，它由多粘類芽孢桿菌、載體和助劑組成，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌在可濕性粉劑中的活菌含量為1×107cfu/g～1×1012cfu/g。2.如權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌是多粘類芽孢桿菌HY96-2，其保藏號為CGMCCNo.0829;所述載體選自白碳黑、硅藻土、淀粉、輕質碳酸鈣、滑石粉、凹凸棒土、草炭土、膨潤土、高嶺土中的一種或多種；所述助劑包括潤濕劑和分散劑，其中潤濕劑選自十二垸基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、丁基萘磺酸鈉、烷基萘磺酸鹽中的一種或多種，分散劑選自六偏磷酸鈉、羥甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉、聚乙烯吡咯啉酮、烷基萘磺酸鹽縮聚物、聚乙烯、垸基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽、黃原膠、卩一萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的一種或多種。3.如權利要求1或2所述的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述潤濕劑為十二垸基苯磺酸鈉和烷基萘磺酸鹽中的1種或2種，潤濕劑在可濕性粉劑中的重量百分比為0.01%10%;所述分散劑為烷基萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽和卩一萘磺酸鹽縮聚物鈉鹽中的1種或2種，所述分散劑在可濕性粉劑中的重量百分比為0.01%10%。4.如權利要求1或2所述的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的含水量小于15%(重量)，通過44um篩的比例大于95嘰，懸浮率大于34%，潤濕時間小于180s。5.—種制備如權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將含多粘類芽孢桿菌活菌的發酵液與載體、助劑混合，得到固體重量百分比為5%50%的液固混合物，然后在10030(TC的進風溫度、每小時5kg200kg料的進料速度下經離心噴霧干燥，得到所述多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌活菌來自多粘類芽孢桿菌發酵液，所述發酵液含有芽孢狀態的多粘類芽孢桿菌活菌、非芽孢狀態的多粘類芽孢桿菌活菌、和/或所述多粘類芽孢桿菌的代謝產物。7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌的芽孢率高于10%。8.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述多粘類芽孢桿菌是通過以下方法培養獲得的在含有碳源、氮源、無機鹽的培養基中，在通氣量控制在氣液比為0,2:12:1、轉速在100r/min或以上，培養所述多粘類芽孢桿菌24小時以上，發酵結束時的培養基pH控制在7.09.0,其中所述碳源選自葡萄糖、淀粉或/和大米粉，所述氮源選自蛋白粉、酵母粉、花生餅粉或/和大豆粉，所述無機鹽包含0.005%0.01%的Mn2+。9.權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑在防治植物細菌性和真菌性土傳病害及葉部病害中的應用。10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述植物細菌性和真菌性土傳病害或葉部病害選自青枯病、枯萎病、軟腐病、根腐病、莖基腐病、猝倒病、立枯病、赤星病、角斑病、葉斑病、斑枯病、潰瘍病、穿孔病、炭疽病、灰霉病或霜霉病。全文摘要本發明涉及一種多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑及其應用，該可濕性粉劑由載體、助劑和多粘類芽孢桿菌發酵液混合后經離心噴霧干燥而得到。本發明的多粘類芽孢桿菌可濕性粉劑可單獨或與其它藥劑復配，通過灌根來防治植物細菌性和真菌性土傳病害，以及通過噴霧來防治細菌性和真菌性葉部病害。文檔編號A01N25/14GK101243801SQ20071003880公開日2008年8月20日申請日期2007年3月30日優先權日2007年3月30日發明者蜀李,李元廣,李淑蘭,李際軍,汪榮津,沈國敏,偉王,盛保偉,陳智旺,魏鴻剛申請人:上海澤元海洋生物技術有限公司