專利名稱：一種耐高溫棉花雜交種的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種耐高溫棉花雜交種的選育方法，專用于耐高溫棉花雜交品種的選育，屬于農作物抗逆育種領域。
背景技術：
全球氣候變暖已經引起了農業學家們的廣泛關注。根據預計，到本世紀下葉氣溫將升高1.4～5.8℃，而且極端氣候如高溫、干旱等將會更加頻繁發生。隨著全球氣候的變暖，高溫脅迫已成為影響作物生產的一個重要因素。模擬結果表明，如不采取措施，到本世紀后半期，我國的小麥、水稻、玉米等幾種主要農作物產量最多可能下降37％。在我國棉花種植區域，特別是長江流域棉區，周期性的高于35℃的熱害在7至8月份期間經常發生，此時棉花正處于盛花期和結鈴期，從而影響授粉受精，導致蕾鈴脫落，并嚴重影響結鈴率和皮棉產量。為了穩定棉花產量，適應當前的植棉環境和將來變暖的氣候條件，選育耐高溫的棉花品種已成為迫切的育種目標。
研究者們曾將在田間或人工氣候室中棉株結鈴的高度(Feaster CV and TurcotteEL(1985).Use of heat tolerance in cotton breeding.InNational Cotton Council ofAmerica，ed.Proceedings of the Beltwide Cotton Conference.National Cotton Council，Memphis，TN.364-366)、生殖階段的鈴重和結鈴率等農藝性狀(Brown PW andZeiher CA(1998).Varietal response to heat stress during reproductive development.InNational Cotton Council of America，ed.Proceedings of the Beltwide CottonConference.National Cotton Council，Memphis，TN.1451-1452)以及葉片的氣孔導度(Lu ZM，et al(1998).Stomatal conductance predicts yields in irrigated Pima cottonand bread wheat grown at high temperatures.J Exp Bot 49，453-460)和細胞膜熱穩定性(Rahman H，et al(2004).Heat tolerance of upland cotton during the fruiting stageevaluated using cellular membrane thermostability.Field Crops Res 85，149-158)作為棉花耐高溫特性的篩選指標。這些篩選方法要么依賴于高溫逆境條件，要么通過測定生理指標進行間接的選擇。然而，在實際的育種工作中，田間自然的高溫脅迫常常難以預期發生，在人工溫室中的選育結果往往與實際不符，而且還增加了育種成本；通過測定氣孔導度和細胞膜熱穩定性進行的間接篩選與棉花產量關系不密切，這些耐熱生理指標表現高的，產量性狀不一定表現好，而這些生理指標在棉花的不同生育時期和不同的部位有變化，育種者不好掌握，還需要特定的測定儀器。也有研究者提出以室內離體花粉的萌發率和生長長度的不同來區分耐高溫和敏感型棉花(Kakani VG，et al.(2005).Differences in in vitro pollen germinationand pollen tube growth of cotton cultivars in response to high temperature.Ann Bot 96，59-67)，這種篩選方法雖然不需要溫室設施條件，但離體花粉在培養基上的萌發率和生長狀況不能直接反映田間棉花花粉的授粉受精和結鈴性狀，因而在實際的應用中僅有離體花粉培養實驗是遠遠不夠的，另外該方法需要比較復雜的數據處理過程，在應用中一般的操作者難以掌握。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的選育耐高溫雜交棉花品種的方法，培育出結鈴性強、高產和適應性強的耐高溫棉花雜交種，解決我國長江流域雜交棉花種植區域在7月至8月份期間經常出現高溫逆境而導致蕾鈴脫落，并嚴重影響皮棉產量和品質的問題，以增強品種的適應性，并穩定棉花產量。
本發明提供的技術方案是一種耐高溫棉花雜交種的選育方法，步驟如下1)選擇親本，并在田間栽培，進行雜交，獲得棉花雜交種F1；2)按隨機區組試驗設計種植所述棉花雜交種F1，在田問調查單株結鈴數和成鈴率；3)室內離體花粉培養測定所述棉花雜交種F1的花粉萌發率和花粉管生長長度；4)采用主成分分析方法進行篩選，根據第2)步和第3)步獲得的結果進行主成分分析，然后以主成分分析后的第一和第二主分量數值即PC1和PC2對所測定的棉花雜交種F1進行篩選，其中，PC1和PC2均為正值，所測定的雜交種為耐高溫品種，PC1和PC2均為負值，所測定的雜交種為高溫敏感型品種，PC1為正值而PC2為負值，所測定的雜交種為中等耐高溫品種，PC1為負值而PC2為正值，所測定的雜交種為中等敏感型品種。
上述的選育方法，其中所述第1)步選擇的親本是蘇棉12號、中棉12號、蘇棉16號和J011分別與新優棉68和K-79雜交。當然，在應用該發明的方法時，親本可以選自任何具有高產、優質和抗病蟲等性狀的親本材料。
所述的選育方法，其中所述第2)步調查單株結鈴數和成鈴率分別于盛花期和結鈴期(長江流域棉區的時間為7月下旬和8月下旬)調查兩次，分別獲得盛花期和結鈴期平均單株結鈴數和成鈴率，用于第4)步的主成分分析方法的篩選。
所述的選育方法，其中所述第3)步的室內離體花粉培養在20℃～40℃范圍多個溫度條件下測定，獲得不同溫度培育條件下的平均花粉萌發率和平均花粉管長度，并以其中最高花粉萌發率和最長花粉管生長長度用于第4)步主成分分析。
所述的選育方法，其中所述的不同溫度條件分別是20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃。
所述的選育方法，其中第4)步所述的主成分分析的具體方法是(參見唐啟義，馮明光著《實用統計分析及其DPS數據處理系統》，科學出版社，2002年5月，第19章多因素分析)首先組成觀測樣本矩陣X為X=x11x12···x1px21x22···x2p············xn1xn2···xnp]]>其中n為樣本數即配制的棉花雜交種F1的數目，p為變量數即盛花期單株平均結鈴數和成鈴率、結鈴期單株平均結鈴數和成鈴率、最高花粉萌發率和最長花粉管生長長度共6個變量；然后將觀測樣本矩陣中的原始數據進行標準化處理，即對樣本集中元素xik作xik=xik-x‾kSk]]>(i＝1，2，…，n；k＝1，2，…，p)變換后獲得標準化矩陣V，其中x‾k=1nΣi=1nxik,]]>Sk2=1n-1Σi=1n(xik-x‾k)2,]]>并計算矩陣V的相關系數矩陣(協方差矩陣)RR=r11r12···r1pr21r22···r2p············rp1rp2···rpp;]]>最后計算特征值和特征向量，通過雅可比(Jacobi)方法求解特征方程|λI-R|＝0(I為單位陣)，得出p個非負的特征值λi(i＝1，2，…，p)，按其大小排列，即λ1≥λ2≥……≥λi≥λp，特征值是各主成份的方差，特征向量矩陣U可以通過方程|R-λI|U＝0求得；若令F＝UTV(UT為U的轉置矩陣)，就可以得到各個樣本的主成分分析因子得分系數矩陣F，矩陣中fik(i＝1，2，…，n；k＝1，2，…，p)即為第i個樣本的第k主分量數值。上述主成分分析過程可以借助于SPSS、SAS和DPS等軟件系統實現。
所述的選育方法，其中第3)步所述的室內離體花粉培養測定過程是按照100ml培養基中含有2g瓊脂，30g蔗糖，5.3mg KNO3，51.7mg MnSO4，10.3mg H3BO3和10.3mg MgSO4·7H2O的配方，將配好的培養基煮沸后倒入直徑為6cm的培養皿中，每個培養皿10ml；在棉花初花到盛花時期，于早晨7:00～8:00分別摘取所述田間種植的各個雜交種F1剛開放的新鮮花朵，帶回室內等花藥開裂后用手輕彈花藥，使花粉均勻落在培養基的表面，每個培養皿500～800粒花粉；蓋上培養皿蓋，并留縫隙以保證培養皿內相對濕度約50％左右，將培養皿分別放置在溫度為20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃的生長培養箱中黑暗條件下培養，每個溫度處理中各雜交種重復3次；培養24h后，計數花粉的萌發率，測定花粉管的生長長度；以花粉管長度超過花粉粒直徑作為花粉粒萌發的標準；計算每個視野中的萌發率，每個培養皿觀察10個視野，并統計平均萌發率；每個培養皿隨機測定20個萌發的花粉管長度，計算平均花粉管長度。
本發明提供的耐高溫棉花雜交種的選育方法具有如下優點和積極效果1)直接從雜交組合中進行篩選，增加了棉花親本配組的自由度。棉花的耐高溫特性是一個比較復雜的綜合性狀，其遺傳機制尚不清楚。在棉花雜種優勢利用中，可以廣泛配組，選擇任何具有高產、優質和抗病蟲等優良性狀的親本材料自由地配制雜交組合，在田間品系比較試驗的同時采用該發明的技術方案就可以對所配制的雜交種進行耐高溫特性的測試，確定所配制的雜交組合對高溫逆境的耐性程度，篩選出既耐高溫，又具有高產、優質或抗病蟲等性狀的適應性強的棉花雜交品種，從而減少因高溫逆境導致的減產，保證了育種家選育的雜交品種在省級或國家級區域試驗以及生產應用中的穩產性，增強育種的選擇效果。
2)將室內離體花粉培養和田問棉花結鈴性狀相結合，既能反映溫度對花粉萌發和花粉管生長(花粉育性)的影響，又能了解棉株的結鈴性狀，從而將耐高溫特性與產量性狀很好的結合起來。該篩選方法篩選出的耐高溫品種在自然高溫和人工高溫逆境下的花粉育性正常，幾乎沒有空癟花粉粒，結鈴性強，而高溫敏感型品種則空癟花粉粒的比率在30％以上，蕾鈴脫離嚴重，因而篩選結果與實際表現相符，篩選方法準確性高。
3)不需要溫室設施提供高溫逆境，整個操作方法簡單，一般的育種者容易掌握，實用性強；一般只需要一次篩選，可以不經過多年多點試驗，從而縮短了選育時間，并節約了成本。
具體實施例方式
下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。
2004年以常規棉品種蘇棉12號、中棉12號、蘇棉16號和J011(湘雜棉2號自交后代系譜法選育的品系)為母本分別與轉Bt基因抗蟲棉花品系新優棉68(常規抗蟲棉魯棉研22號自交后代中的優質選系)和K-79(以常規轉Bt基因抗蟲棉GK-12進行連續多代的系統選擇而獲得的結鈴性強、抗蟲性好的高產品系)配制了8個雜交組合(名稱見表1)。2005年將8個雜交種F1按隨機區組設計進行田問試驗，小區面積為10m2，每個組合重復3～5次(在本實施例中重復3次)，種植密度為每畝1500株，田問管理按照當地的抗蟲雜交棉花品種的栽培管理方式進行。每個小區隨機選10株棉株，在7月25日盛花期間和8月25日結鈴期間分兩次調查各小區的單株結鈴數和成鈴率，得到小區的平均單株結鈴數和成鈴率后，通過簡單的方差分析獲得每個棉花雜交種F1的平均單株結鈴數和成鈴率(表1)。
在2005年7月1日到5日的早晨7:00～8:00分別摘取田間種植的各個雜交種剛開放的新鮮花朵，并帶回室內稍稍風干。然后，按照100ml培養基中含有2g瓊脂，30g蔗糖，5.3mg KNO3，51.7mg MnSO4，10.3mg H3BO3和10.3mg MgSO4·7H2O的配方，將配好的培養基煮沸后倒入直徑為6cm的培養皿中，每個培養皿約10ml，每天做一個溫度處理，共配制24個含有培養基的培養皿(若有足夠恒溫培養箱的條件，可以每天做2～5個溫度處理)。等培養基完全冷卻凝固后，用手輕彈花藥，使花粉均勻落在培養基的表面，每個培養皿約500～800粒花粉(1～2朵花)。蓋上培養皿蓋，并留縫隙以保證培養皿內相對濕度在50％左右，將培養皿分別放置在溫度為20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃的生長培養箱中黑暗條件下培養，每個溫度處理中各雜交種重復3次。在培養的第二天上午10:00左右開始用光學顯微鏡計數花粉的萌發率，測微尺測定花粉管的生長長度。計算每個視野中的萌發率，每個培養皿觀察10個視野，并統計平均萌發率。每個培養皿隨機測定20個萌發的花粉管長度，計算平均花粉管長度，各個雜交種花粉粒最高的萌發率和花粉管生長長度結果見表1。
表1不同棉花雜交組合的單株結鈴數、成鈴率、最高花粉萌發率和最長花粉管生長長度
對表1中8個雜交種的單株結鈴數和成鈴率、最高花粉萌發率和最長花粉管生長長度共6個變量進行主成分分析。將表1中的觀測數據組成8×6的樣本矩陣，通過標準化變換后，并計算出該標準化矩陣的相關系數矩陣(見表2)，然后計算出相關系數矩陣的特征值、特征向量以及各個樣本的主成分分析因子得分系數矩陣(分別列于表3、4和5)。
表2相關系數矩陣
注X(1)、X(2)、X(3)、X(4)、X(5)和X(6)分別為7月25日的單株平均結鈴數和成鈴率、8月25日的單株平均結鈴數和成鈴率、最高花粉萌發率以及最長花粉管生長長度。
表3相關系數矩陣的特征值及主成分貢獻率
表4相關系統矩陣的特征向量表
表5各個棉花雜交組合的主成分分析因子得分系數矩陣表
注表3、4和5中的PC1、PC2、PC3、PC4、PC5和PC6分別表示第一、二、三、四、五和六主分量。
表6主成分分析后不同棉花雜交組合的第一和第二主分量值以及對高溫的耐性
表5中列出了各個雜交組合的第一到第六主分量的數值，根據PC1和PC2的正負值，可以從8個棉花雜交組合中判斷出雜交組合“JL06”和“JL07”屬于耐高溫型的棉花(見表6)。其中“JL06”不但耐高溫特性強，而且還表現出較強的雜種優勢，具有以下主要特點1)高溫逆境時段花粉育性正常，蕾鈴脫落少，結鈴性強。2005年在長江流域棉區于7～8月期間出現了多次連續多天最高氣溫超過35℃的高溫天氣，此時正值棉花進入盛花期和結鈴期，許多棉花品種出現花藥空癟和花粉量減少的現象，蕾鈴脫落非常嚴重。高溫時段，采用顯微鏡對自交授粉后的柱頭上的花粉粒進行連續的觀察表明，試驗中的雜交組合“JL06”的花柱上空癟和形狀不規則的花粉粒數量很少，而其它組合特別是敏感型的雜交種中有30％以上的空癟和形狀不規則的花粉粒；田間結鈴性狀調查結果顯示，“JL06”在高溫時段的成鈴率仍然在70％以上，單株結鈴數也是最高的，而敏感型雜交組合由于高溫導致花粉育性不正常使得授粉受精受到影響，從而蕾鈴脫落嚴重，單株結鈴數減少。
2)適應性強，產量高。“JL06”參加2006年湖南省棉花雜交種的區試，在湖南常德、華容、安鄉和長沙地區均表現出很好的結鈴性，單株平均結鈴數為46.9個，平均籽棉產量為346kg/畝，比對照現有推廣雜交棉品種“湘雜棉8號”增產4.5％。另外，在湖北、江西和安徽等省進行的多點多地區示范試驗結果也表明，該雜交品種的結鈴性好，在棉株上的分布均勻，單株結鈴數都超過45個，大面積示范產量均在300kg/畝左右，可見產量高而且穩定，表現出適應性強的特點。
3)綜合性狀優良。“JL06”綜合了雙親“J011”和“K-79”的優點，生長優勢強，株型好，生長穩健，鈴大(單鈴籽棉重6.5g)，纖維品質優良，對棉鈴蟲具有很好的抗性，具有較強的雜種優勢。
權利要求
1.一種耐高溫棉花雜交種的選育方法，步驟如下1)選擇親本，并在田間栽培，進行雜交，獲得棉花雜交種F1；2)按隨機區組試驗設計種植所述棉花雜交種F1，在田間調查單株結鈴數和成鈴率；3)室內離體花粉培養測定所述棉花雜交種F1的花粉萌發率和花粉管生長長度；4)采用主成分分析方法進行篩選，根據第2)步和第3)步獲得的結果進行主成分分析，然后以主成分分析后的第一和第二主分量數值即PC1和PC2對所測定的棉花雜交種F1進行篩選，其中，PC1和PC2均為正值，所測定的雜交種為耐高溫品種，PC1和PC2均為負值，所測定的雜交種為高溫敏感型品種，PC1為正值而PC2為負值，所測定的雜交種為中等耐高溫品種，PC1為負值而PC2為正值，所測定的雜交種為中等敏感型品種。
2.根據權利要求1所述的選育方法，其中所述第1)步選擇的親本是以蘇棉12號、中棉12號、蘇棉16號和J011為母本分別與新優棉68和K-79雜交。
3.根據權利要求1所述的選育方法，其中所述第2)步調查單株結鈴數和成鈴率分別于盛花期和結鈴期調查兩次，長江流域棉區的調查時間為7月下旬和8月下旬，分別獲得盛花期和結鈴期單株平均結鈴數和成鈴率，用于第4)步的主成分分析方法的篩選。
4.根據權利要求1所述的選育方法，其中所述第3)步的室內離體花粉培養在20℃～40℃范圍多個溫度條件下測定，獲得不同溫度下的平均花粉萌發率和平均花粉管長度，以最高花粉萌發率和最長花粉管生長長度用于第4)步主成分分析。
5.根據權利要求4所述的選育方法，其中所述的不同溫度條件分別是20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃。
6.根據權利要求1所述的選育方法，其中第4)步所述的主成分分析的具體方法是首先組成觀測樣本矩陣X為X=x11x12···x1px21x22···x2p············xn1xn2···xnp]]>其中n為樣本數即配制的棉花雜交種F1的數目，p為變量數即盛花期平均單株結鈴數和成鈴率、結鈴期平均單株結鈴數和成鈴率、最高花粉萌發率和最長花粉管生長長度共6個變量；然后將觀測樣本矩陣中的原始數據進行標準化處理，即對樣本集中元素xik作xik=xik-x‾kSk]]>(i＝1，2，…，n；k＝1，2，…，p)變換后獲得標準化矩陣V，其中x‾k=1nΣi=1nxik,]]>Sk2=1n-1Σi=1n(xik-x‾k)2,]]>并計算矩陣V的相關系數矩陣即協方差矩陣RR=r11r12···r1pr21r22···r2p············rp1rp2···rpp]]>最后計算相關系數矩陣R2的特征值和特征向量，通過雅可比(Jacobi)方法求解特征方程|λI-R|＝0(I為單位陣)，得出p個非負的特征值λi(i＝1，2，…，p)，按其大小排列，即λ1≥λ2≥……≥λi≥λp，特征值是各主成分的方差，特征向量矩陣U可以通過方程|R-λI|U＝0求得；若令F＝UTV(UT為U的轉置矩陣)，就可以得到各個樣本的主成分分析因子得分系數矩陣F，矩陣中fik(i＝1，2，…，n；k＝1，2，…，p)即為第i個樣本的第k主分量數值。
7.根據權利要求1所述的選育方法，其中第3)步所述的室內離體花粉培養測定過程是按照100ml培養基中含有2g瓊脂，30g蔗糖，5.3mg KNO3，51.7mg MnSO4，10.3mg H3BO3和10.3mg MgSO4·7H2O的配方，將配好的培養基煮沸后倒入直徑為6cm的培養皿中，每個培養皿10ml；在棉花初花到盛花時期，于早晨7:00～8:00分別摘取所述田間種植的各個雜交種F1剛開放的新鮮花朵，帶回室內等花藥開裂后用手輕彈花藥，使花粉均勻落在培養基的表面，每個培養皿500～800粒花粉；蓋上培養皿蓋，并留縫隙以保證培養皿內相對濕度約50％，將培養皿分別放置在溫度為20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃的生長培養箱中黑暗條件下培養，每個溫度處理中各雜交種重復3次；培養24h后，計數花粉的萌發率，測定花粉管的生長長度；以花粉管長度超過花粉粒直徑作為花粉粒萌發的標準；計算每個視野中的萌發率，每個培養皿觀察10個視野，并統計平均萌發率；每個培養皿隨機測定20個萌發的花粉管長度，計算平均花粉管長度。
全文摘要
一種耐高溫棉花雜交種的選育方法，屬農作物抗逆育種領域。該選育方法如下1)選擇親本，進行雜交，獲得棉花雜交種F
文檔編號A01H5/00GK101019507SQ200710086690
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者劉志, 袁小玲, 陳金湘, 余筱南, 饒力群 申請人:湖南農業大學