專利名稱：：一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法
技術領域：
：本發明涉及植物脫毒組培快繁
技術領域：
，尤其涉及一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法。
背景技術：
：浙貝母(Frj'"'"arj'a^朋&2^77Miq.)是百合科貝母屬植物，其干燥鱗莖是著名中藥材"浙八味"之一，是化痰止咳、治療氣管炎、感冒等呼吸道疾病的常用良藥。浙貝母原產象山縣，故又稱象貝母。據傳清康熙年間，象山農民開始將貝母從野生轉入家種。一直以來，浙貝母以磐安、鄞州為主產地，約占全國浙貝母總產量的70%，江蘇、江西、上海、湖北和湖南省亦有栽培。隨著種植業結構調整的深入，近年來浙江省浙貝母的栽培面積迅速擴大。但在人工栽培中，浙貝母生產由于采用大鱗莖作種，其繁殖系數極低，約為1.61.8倍，用種量極大，用種500kg/畝，種子地下休眠期長，約4個月。浙貝母如此低的繁殖系數和如此高的耗種量，導致生產用地和留種地面積的增加及生產成本增加。同時，長期的營養繁殖導致浙貝母種質嚴重退化，鱗莖產量和品質下降，已成為嚴重地阻礙了浙貝母產業的發展的重要問題之一。近年來的研究揭示，植物病毒的侵染也是引起浙貝母種質退化的主要原因之一。最近我們在浙江磐安縣田間對浙貝母進行調査發現，絕大部分植株均表現花葉和斑駁等典型的馬鈴薯Y病毒科成員侵染癥狀。通過對該病毒病原的普通生物學、血清學特征和基因組全序列的研究，結果表明存在二種新病毒的復合侵染，一種是浙貝母花葉病毒(ThunbergfritillarymosaicVirus,TFMV)，另一種命名為貝母Y病毒(/^rj'^7Z32TvirusY，FVY)，該病毒病害普遍發生是引起浙貝母種質嚴重退化的重要原因之一；同時提出以田間浙貝母上發生的病毒，經擴增、克隆和原核表達制備成病毒特異性抗血清，對浙貝母植株樣品進行病毒ELISA檢測的方法(WeiCBetal.(2005)ArchivesofVirology,150:1271-1280;ChenJetal.(2006)ArchivesofVirology,151:439-447;韋傳寶等(2006).科技通報，22(4):506-509)。浙貝母莖尖脫毒組培培養研究到目前為止尚未見報道。因此建立浙貝母脫毒組培快繁技術體系，生產優質無病毒種球，為真正實現GAP栽培和規模化生產提供技術平臺，具有較大的應用前景。
發明內容本發明目的是，針對現有浙貝母常規生產繁種技術中采用大鱗莖作種，繁殖系數極低，用種量極大，種子地下休眠期長，生產和留種地面積大，并有植物病毒侵染，導致品質差，產量低，生產成本高等缺陷；提供一種能大量、快速繁殖鱗莖，又能脫除鱗莖所帶病毒并經特異檢測，以確保無毒的浙貝母鱗莖脫毒、組培與檢測的配套方法。本發明目的通過以下技術方案來實現一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法，按如下步驟進行(1)培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為1)基本培養基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養基用MS培養基;鱗莖生根培養基用1/2MS培養基；其中，蔗糖或白糖2040g/L，瓊脂79g/L，pH5.65.8;2)子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D0.51.5mg/L+ZTl3mg/L;3)子鱗莖增殖培養基MS+BAl3mg/L+NAA13mg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;4)壯苗培養基MS+BA0.51.5mg/L+NAA0.51.5mg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;5)鱗莖生長培養基MS+BA0.llmg/L+NAA0.1lmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;6)鱗莖生根培養基1/2MS+NAA0.1lmg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;(2)浙貝母脫毒組培鱗莖的培養1)外植體的選取、培育與處理①取浙貝母新生長的鱗莖、嫩莖或花梗，經滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；②子鱗莖誘導培養將外植體材料在無菌條件下，切成0.30.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，在培養條件下培養12個月后，誘導形成子鱗莖；③子鱗莖增殖培養將誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，在培養條件下培養3045天增殖出子鱗莖；④壯苗培養將增殖的子鱗莖在4。C低溫、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理l周，然后在培養條件下培養3045天長成苗高57cm的壯苗；⑤熱處理將壯苗在35'C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理24周后，供莖尖培養用；⑥莖尖培養:將熱處理后的組培壯苗在40倍雙筒解剖鏡下，摘出0.20.5mm長帶12個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體；2)子鱗莖誘導培養將外植體莖尖接種在子鱗莖誘導培養基上，在培養條件下培養12個月后，誘導形成子鱗莖；3)子鱗莖增殖培養將子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，在培養條件下培養3045天增殖出子鱗莖；根據對子鱗莖數量的需求，每隔3045天按同樣方法進行子鱗莖再增殖；4)子鱗莖生長培養將子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，在培養條件下培養3045天，使鱗莖長大到O.5lcm;5)生根培養:將長大的子鱗莖接種在生根培養基上，在培養條件下培養2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出35根根系；6)移栽待生根子鱗莖苗高生長至57cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養12個月至成苗。(3)、病毒ELISA檢測將田間病株所攜帶的浙貝母花葉病毒(/riz^7h/ymosaicVirus,TFMV)和貝母Y病毒(尸r"j7Zg2yvirusY，FVY)，經擴增、克隆和原核表達后，所獲得的大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備成病毒特異性抗血清后，對浙貝母脫毒組培鱗莖進行病毒ELISA檢測。所述的培養基配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養基用MS培養基；鱗莖生根培養基用1/2MS培養基；其中，瓊脂7g/L，pH5.8;(2)子鱗莖誘導培養基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;(3)子鱗莖增殖培養基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;(4)壯苗培養基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;(5)鱗莖生長培養基白糖40g/L的MS十BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;(6)生根培養基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VB:)4mg/L。所述的滅菌處理是將外植體的材料經75%酒精浸泡0.51.Omin，再用0.升汞水溶液浸泡1015min，最后用無菌水沖洗35次。所述的各脫毒組培階段的培養條件是，培養溫度為23±2°C，光照光強為20003000Lx，光照時間為12h/d。所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:1配制而成。本發明的有益效果是1)本發明在探明造成浙貝母種球退化的原因，系由浙貝母花葉病毒(f力〃/z6er^/rj'"7Jar7mosaicVirus,TFMV)禾口貝母Y病毒(Frj'fJZsiyvirusY，FVY)混合感染致使發病的基礎上，建立的浙貝母病毒(TFMV和FVY)外殼蛋白基因RT-PCR擴增、克隆、原核表達及高靈敏度ELISA檢測體系，通過該檢測技術應用，可保證脫毒子鱗莖中無病毒存在，為進一歩控制病毒病發生傳播，浙貝母品種提純復壯奠定了基礎；2)建立的浙貝母脫毒組培快繁技術體系，脫毒效果好，鱗莖增殖快，其月增殖率可達4.5倍，其生根率達100%,移栽成活率達95%以上，適合工廠化育苗，可商品化生產，從而大大節省了傳統方法的繁種用地，顯著降低了浙貝母的生產成本；3)脫毒鱗莖可比常規未脫毒鱗莖增產1020%，按畝產量1000Kg計算，每畝可增產100200Kg，并顯著提高了浙貝母的產品質量。具體實施方式通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容并不局限于此。2，4-D:2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid)，美國進口國內分裝，分析純，純度99.5%。ZT:玉米素(Zeatin)，美國進口國內分裝，分析純，純度99%。BA:6-節氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，美國進口國內分裝，分析純，純度99.9%。NAA:a-萘乙酸(l-Naphthylaceticacid)，美國進口國內分裝，分析純，純度99.5%。鹽酸硫胺素(VBt):美國進口國內分裝，分析純，純度99%。水解酪蛋白(CH):sigma公司進口，分析純。實施例1:一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法，按如下步驟進行(1)培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為1)基本培養基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養基用MS培養基;鱗莖生根培養基用1/2MS培養基；其中，瓊脂7g/L，pH5.8;2)子鱗莖誘導培養基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;3)子鱗莖增殖培養基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;4)壯苗培養基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素眞)4mg/L;5)鱗莖生長培養基白糖40g/L的MS+BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;6)生根培養基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(跳)4mg/U(2)浙貝母脫毒組培鱗莖的培養1)外植體的選取、培育與處理①取浙貝母新生長的鱗莖，經75%酒精浸泡0.8min，再用0.1%升汞水溶液浸泡13min，最后用無菌水沖洗35次進行滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；②子鱗莖誘導培養將外植體材料在無菌條件下，切成0.30.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，在溫度23士2。C，光強2500Lx，光照時間12h/d的培養條件下培養12個月后，誘導形成子鱗莖；③子鱗莖增殖培養將誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養條件下培養3045天增殖出子鱗莖；④壯苗培養將增殖的子鱗莖在4。C低溫、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理1周后，在與步驟(2)-1)-②相同培養條件下培養3045天長成苗高57cm的壯苗；⑤熱處理將壯苗在35'C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下處理3周后，供莖尖培養用；⑥莖尖培養:將熱處理后的組培壯苗在40倍雙筒解剖鏡下，摘出0.20.5mm長帶12個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體；2)子鱗莖誘導培養將莖尖外植體接種在子鱗莖誘導培養基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養條件下培養12個月后，誘導形成子鱗莖；3)子鱗莖增殖培養將子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，在與步驟(2)-l)-②相同培養條件下培養3045天增殖出子鱗莖；根據對子鱗莖數量的需求，每隔3045天按同樣方法進行子鱗莖的再增殖；4)子鱗莖生長培養將增殖出的子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養條件下培養3045天，使鱗莖長大到0.5lcm;5)生根培養將長大的子鱗莖接種在生根培養基上，在與步驟(2)-1)-②相同培養條件下培養2030天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出數根根系；6)移栽待生根子鱗莖苗高生長至35cm、根長出5根以上時，移栽到由泥炭珍珠巖蛭石按體積l:2:l配制而成的基質中，培養12個月至成苗。(3)病毒ELISA檢測1)、浙貝母病毒病原種類的鑒定①取病樣取浙貝母花葉病害病樣，-8(TC儲存備用；②電鏡觀察取病汁液經負染后，用電鏡觀察病毒粒子的形態；③病毒種類RT-PCR檢測和鑒定對侵染浙貝母2種病毒的序列分別合成擴增各種病毒外殼蛋白基因的引物；以植物總RNA為模板，逆向引物(_)合成病毒第一鏈cDNA，進而以此cDNA為模板，采用TaKaRa公司LATaqTMPCR體系或￡T7agDNA聚合酶體系，對各種病毒逐一進行RT-PCR檢測；2)病毒ELISA檢測由于浙貝母通常含有本發明人鑒定明確的浙貝母花葉病毒(r力^2^T^/rWWafymosaicVirus,TFMV)禾口貝母Y病毒OW"War"irusY,FVY)2種病毒，而這2種病毒又難以分離純化，從而將上述2種病毒外殼蛋白基因，經擴增、克隆和原核表達后，所獲得的大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備成病毒特異性抗血清，作為浙貝母脫毒組培鱗莖的病毒ELISA檢測之用。實施例2:本例中，其基本培養基的瓊脂為9g/L，pH為5.6;子鱗莖誘導培養基為蔗糖20g/L的MS+2，4-DO.5mg/L+ZTlmg/L;子鱗莖增殖培養基為白糖30g/L的MS十BAlmg/L+NAA3mg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;壯苗培養基為白糖20g/L的MS+BA1.5mg/L和NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素(VB丄)4mg/L;鱗莖生長培養基為白糖20g/L的MS+BA0.lmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBt)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;生根培養基為白糖30g/L的1/2MS+NAA0.lmg/L+鹽酸硫胺素(VB!)4mg/L;取浙貝母新生長的嫩莖，經75%酒精浸泡0.5min，再用0.1%升汞水溶液浸泡10min，最后用無菌水沖洗35次進行滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料;將壯苗在35°C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下進行處理熱2周后，供莖尖培養用；以溫度23土2°C，光強2000Lx，光照時間12h/d為培養條件；其余步驟，條件均同于實施例1。實施例3:本例中，其基本培養基的瓊脂為8g/L，pH為5.7;子鱗莖誘導培養基為蔗糖40g/L的MS+2，4-D1.5mg/L+ZT3mg/L;子鱗莖增殖培養基為白糖20g/L的MS十BA3mg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;壯苗培養基為白糖30g/L的MS+BA0.5mg/L和NAAL5mg/L+鹽酸硫胺素(VB丄)4mg/L;鱗莖生長培養基為白糖30g/L的MS+BAlmg/L+NAA0.lmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L;生根培養基為白糖40g/L的1/2MS+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素(VBi)4mg/L;取浙貝母新生長的花梗，經75%酒精浸泡1.0min，再用0.1%升汞水溶液浸泡15min，最后用無菌水沖洗35次進行滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；將壯苗在35。C、光強20003000Lx，光照時間12h/d下進行熱處理4周后，供莖尖培養用；以溫度23士2°C，光強3000Lx，光照時間12h/d為培養條件；其余步驟，工藝、條件均同于實施例1。試驗例(病毒檢測)1、對照材料從田間采集的浙貝母病葉鱗莖為材料。2、處理材料以實施例l、2或3獲得的脫毒組培鱗莖為材料。3、病毒ELISA檢測由于浙貝母常含有2種病毒復合侵染，通常病毒難以分離純化，從而應用病毒外殼蛋白基因擴增、克隆和原核表達，以獲得大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備病毒特異性抗血清，供病毒ELISA檢測之用。4、檢測結果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求1、一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法，其特征在于按如下步驟進行(1)培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為1)基本培養基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養基用MS培養基；鱗莖生根培養基用1/2MS培養基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；2)子鱗莖誘導培養基MS+2，4-D0.5～1.5mg/L+ZT1～3mg/L；3)子鱗莖增殖培養基MS+BA1～3mg/L+NAA1～3mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L；4)壯苗培養基MS+BA0.5～1.5mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L；5)鱗莖生長培養基MS+BA0.1～1mg/L+NAA0.1～1mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L；6)鱗莖生根培養基1/2MS+NAA0.1～1mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L；(2)浙貝母脫毒組培鱗莖的培養1)外植體的選取、培育與處理①取浙貝母新生長的鱗莖、嫩莖或花梗，經滅菌處理，作為摘取脫毒組培用外植體的材料；②子鱗莖誘導培養將外植體材料在無菌條件下，切成0.3～0.6cm的切段，接種在子鱗莖誘導培養基上，在培養條件下培養1～2個月后，誘導形成子鱗莖；③子鱗莖增殖培養將誘導形成的子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，在培養條件下培養30～45天增殖出子鱗莖；④壯苗培養將增殖的子鱗莖在4℃低溫、光強2000～3000Lx，光照時間12h/d下處理1周，然后在培養條件下培養30～45天長成苗高5～7cm的壯苗；⑤熱處理將壯苗在35℃、光強2000～3000Lx，光照時間12h/d下處理2～4周后，供莖尖培養用；⑥莖尖培養將熱處理后的組培壯苗在解剖鏡下，摘出0.2～0.5mm長帶1～2個葉原基的莖尖作為脫毒培養的外植體；2)子鱗莖誘導培養將外植體莖尖接種在子鱗莖誘導培養基上，在培養條件下培養1～2個月后，誘導形成子鱗莖；3)子鱗莖增殖培養將子鱗莖轉接到子鱗莖增殖培養基上，在培養條件下培養30～45天增殖出子鱗莖；根據對子鱗莖數量的需求，每隔30～45天按同樣方法進行子鱗莖再增殖；4)子鱗莖生長培養將子鱗莖轉接到子鱗莖生長培養基上，在培養條件下培養30～45天，使鱗莖長大到0.5～1cm；5)生根培養將長大的子鱗莖接種在生根培養基上，在培養條件下培養20～30天后，子鱗莖上部長出葉片，子鱗莖基部長出3～5根根系；6)移栽待生根子鱗莖苗高生長至5～7cm以上、根長出5根以上時，移栽基質培養1～2個月至成苗。(3)、病毒ELISA檢測將田間病株所攜帶的浙貝母花葉病毒(ThunbergfritillarymosaicVirus，TFMV)和貝母Y病毒(FritillaryvirusY，FVY)，經擴增、克隆和原核表達后，所獲得的大量相關病毒外殼蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制備成病毒特異性抗血清后，對浙貝母脫毒組培鱗莖進行病毒ELISA檢測。2、按權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述培養基的配制，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養基子鱗莖誘導、增殖、壯苗及鱗莖生長培養基用MS培養基；鱗莖生根培養基用1/2MS培養基；其中，瓊脂7g/L，pH5.8;(2)子鱗莖誘導培養基蔗糖30g/L的MS+2，4-Dlmg/L+ZT2mg/L;(3)子鱗莖增殖培養基白糖40g/L的MS+BA2mg/L+NAA2mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L;(4)壯苗培養基白糖40g/L的MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+鹽酸硫胺素4mg/L;(5)鱗莖生長培養基白糖40g/L的MS+BA0.5mg/L禾口NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L;(6)生根培養基白糖20g/L的1/2MS+NAA0.5mg/L+鹽酸硫胺素4mg/L。3、按權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述的滅菌處理是將外植體材料經75%酒精浸泡0.51.Omin，再用0.1%升汞水溶液浸泡1015min，最后用無菌水沖洗35次。4、按權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述的各脫毒組培階段的培養條件是，培養溫度為23士2。C，光照光強為20003000Lx，光照時間為12h/d。5、按權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l:2:1配制而成。全文摘要本發明涉及一種浙貝母脫毒組培鱗莖的培養方法，屬植物種苗繁殖
技術領域：
，專用于浙貝母脫毒苗的繁殖與病毒的檢測。該方法包括培養基的配制；脫毒組培鱗莖的培養；病毒ELISA檢測等步驟。具有脫毒效果好，病毒檢測靈敏度高，可保證脫毒子鱗莖中無病毒存在，有效控制了病毒病的發生與傳播；鱗莖增殖快，月增殖率可達4.5倍，適合工廠化育苗，大大節省了傳統方法的繁種用地，顯著降低了浙貝母的生產成本；可在浙貝母品種提純復壯與開發中推廣應用。文檔編號A01H4/00GK101213937SQ200710306829公開日2008年7月9日申請日期2007年12月28日優先權日2007年12月28日發明者呂永平,剛徐,林林,汪一婷,牟豪杰,曄程,鄭紅英,陳劍平申請人:浙江省農業科學院