專利名稱：竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法
技術領域：
本發明涉及一種種苗繁育方法，特別涉及一種竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方 法。
背景技術：
姜(Zingiber officinale Rose.)為姜科姜屬多年生宿根草本，不僅是一種重要 的調味植物，且具有解表、驅寒濕、抗腫瘤、抗氧化等多種藥用功效，出口量大、經濟效益好， 近年來發展很快。由于開花和結籽障礙，姜以根狀莖為繁殖材料，在長期的無性繁殖過程 中，易受病原物侵染，導致種性退化，產量和品質降低。竹根姜為我國特產地方姜種，具有肉質脆嫩、纖維少、品質優等特點，在四川、重慶 等省市廣泛種植，市場需求量極大。但由于竹根姜不耐旱澇，而西南地區氣溫高、雨量充足， 導致其容易大面積感染青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum )而引發姜瘟病，嚴重影響 了竹根姜的產業化發展。目前，利用莖尖脫毒與組織培養技術獲得脫毒組培種苗是解決上述問題的根本途 徑。近年來，有關姜莖尖脫毒與組織培養的研究已有文獻報道，但大多數報道為脫毒程序及 組培體系建立等理論方面的成果，并未見形成產業化規模。而迄今為止，有關竹根姜的莖尖 脫毒與工廠化繁育的研究尚未見報道。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法。為達到此目的，本發明的竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，包括以下步驟a、莖尖叢生芽誘導取竹根姜嫩芽，經消毒滅菌后，剝取莖尖作為外植體；將莖尖 接種于誘導培養基在光照條件下進行叢生芽誘導培養，獲得叢生芽；所述誘導培養基以MS 培養基作為基本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊脂、濃度為2. Omg/L 的細胞分裂素和濃度為0. lmg/L的生長素，pH為5. 6 6. 2 ；b、叢生芽繼代增殖將步驟a所得叢生芽轉接至增殖培養基在光照條件下進行叢 生芽繼代增殖培養，獲得繼代增殖叢生芽；所述增殖培養基以MS(1/3NH4N03)培養基作為基 本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊脂、濃度為1. 5mg/L的細胞分裂素 和濃度為0. lmg/L的生長素，pH為5. 6 6. 2 ；所述MS (1/3NH4N03)培養基中硝酸銨的濃度 為MS培養基中硝酸銨濃度的1/3，其余組分及其濃度與MS培養基相同；C、生根培養當步驟b所得繼代增殖叢生芽生長至3 4cm高時，將叢生芽切成單 芽，轉接至生根培養基在光照條件下進行生根培養，獲得試管苗；所述生根培養基以1/2MS 培養基作為基本培養基，并添加濃度為20g/L的蔗糖、濃度為6g/L的卡拉膠、濃度為0. 5 1. 0mg/L的細胞分裂素和濃度為0. 2mg/L的生長素，pH為5. 6 6. 2 ；所述1/2MS培養基所 含組分種類與MS培養基相同，但各組分的濃度僅為MS培養基中濃度的1/2 ；d、試管苗移栽將步驟c所得試管苗移栽入體積比為3 7的珍珠巖-泥炭土混合基質中培養，即得脫毒組培種苗。進一步，步驟a c所述培養溫度為25 士 1°C，光照強度為1500 25001ux，光照 時間為每天12 16小時；進一步，步驟a c所述光照強度為15001UX，光照時間為每天12小時；進一步，步驟b是將叢生芽分割至含有2 3個芽叢，再將其莖基部0. 5cm以上部 分切除，形成微型團塊轉接至增殖培養基，接種時先棄去培養基表面的水層，并使芽切口露 出培養基表面。本發明的有益效果在于本發明系統地進行了竹根姜莖尖叢生芽誘導、叢生芽 繼代增殖、生根培養和試管苗移栽等研究工作，建立并優化了竹根姜脫毒組培種苗工廠 化繁育方法莖尖叢生芽誘導率高；叢生芽繼代增殖倍數高且玻璃化率低；芽苗生根率達 100%，根系健壯且有側芽萌發；移栽成活率高，且芽苗健壯，生長快；本發明方法周期短， 成本低，完全能滿足竹根姜大面積規模化栽培的需要，具有良好的應用前景。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖1為種姜萌芽；圖2為莖尖初代培養；圖3為培養四代后增殖芽叢；圖4為生根培養；圖5為試管苗規模化移栽。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。本發明以竹根姜為實驗材料，系統地進行了莖尖叢生芽誘導、叢生芽增殖、生根培 養和試管苗移栽等研究工作，建立并優化了竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法。1、莖尖叢生芽誘導培養基的優化取重慶文理學院花卉研究所溫室大棚中通過催芽獲得的竹根姜嫩芽(圖1)，用水 洗凈，消毒滅菌，無菌條件下剝取直徑不大于Imm的莖尖作為外植體(圖2)，分別接種于6 種不同激素濃度配比的誘導培養基，在光照條件下進行叢生芽誘導培養，獲得初代叢生芽； 誘導培養基以MS培養基作為基本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊 月旨、濃度為1. 5,2. 0或3. Omg/L的6-BA和濃度為0. 1或0. 2mg/L的NAA，pH為5. 8 ；培養溫 度為25士 1°C，光照強度為15001UX，光照時間為每天12小時；觀察不同激素濃度配比的誘 導培養基對竹根姜莖尖叢生芽誘導的影響，統計發芽數和芽生長情況。結果見表1。由表1可知，不同激素濃度配比的誘導培養基對莖尖叢生芽的誘導影 響較大。當NAA濃度為0. 2mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，莖尖叢生芽的誘導率逐漸升高， 但當6-BA.濃度增加至3. Omg/L時，誘導芽葉片偏黃且開始出現玻璃化現象；當NAA濃度為 0. lmg/L時，隨著6-BA濃度的增加，莖尖叢生芽的誘導率先升高再下降，當6-BA濃度增加至 3. Omg/L時，誘導芽弱小且出現較嚴重的玻璃化現象。上述結果表明，莖尖叢生芽的誘導培養基中應添加相對較低濃度的激素，且6-BA和NAA的比例控制在15 20 1較好，綜合 考慮誘導率和芽生長情況，本發明優選在誘導培養基中添加濃度為2. Omg/L的6-BA和濃度 為 0. lmg/L 的 NAA。表1不同激素濃度配比的誘導培養基對竹根姜莖尖叢生芽誘導的影響 2、叢生芽繼代增殖培養基的優化將初代叢生芽轉接至3種不同硝酸銨濃度的增殖培養基，在光照條件下進行繼代 增殖培養，獲得繼代增殖叢生芽；增殖培養基分別以MS培養基、MS(1/2NH4N03)培養基(其 中硝酸銨的濃度僅為MS培養基中硝酸銨濃度的1/2，其余組分及其濃度與MS培養基相 同)、MS(1/3NH4N03)培養基(其中硝酸銨的濃度僅為MS培養基中硝酸銨濃度的1/3，其余組 分及其濃度與MS培養基相同)作為基本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L 的瓊脂、濃度為1. 5mg/L的6-BA和濃度為0. lmg/L的NAA，pH為5. 8 ；培養溫度為25士 1°C， 光照強度為15001UX，光照時間為每天12小時；觀察不同硝酸銨濃度的增殖培養基對竹根 姜叢生芽繼代增殖和玻璃化的影響，每種培養基接種芽數為30，實驗重復3次，40天后統計 增殖芽數和玻璃化苗數。結果見表2。由表2可知，不同硝酸銨濃度的增殖培養基對叢生芽繼代增殖的影響 較小，隨著硝酸銨濃度的逐漸降低，增殖倍數逐漸下降但變化很小；但不同硝酸銨濃度的增 殖培養基對叢生芽玻璃化的影響較大，全量濃度的硝酸銨玻璃化率高達20. 96%, 1/3濃度 的硝酸銨玻璃化率最低為4. 57% ；本發明還曾用含有更低濃度硝酸銨的增殖培養基進行叢 生芽增殖培養，發現隨著硝酸銨濃度的進一步降低，芽苗長勢變弱；因此，綜合考慮增殖倍 數、玻璃化率和芽苗長勢，本發明的增殖培養基優選以MS(1/3NH4N03)培養基作為基本培養 基(圖3)。表2不同硝酸銨濃度的增殖培養基對竹根姜叢生芽繼代增殖和玻璃化的影響 3、生根培養基的優化將繼代增殖叢生芽中生長健壯、株高為3 4cm的芽苗轉接至5種不同激素濃度 配比的生根培養基，在光照條件下進行生根培養，獲得試管苗；生根培養基以1/2MS培養 基(所含組分種類與MS培養基相同，但各組分的濃度僅為MS培養基中濃度的1/2)作為 基本培養基，并添加濃度為20g/L的蔗糖、濃度為6g/L的卡拉膠、濃度為0、0. 5或1. Omg/ L的6-BA和濃度為0、0. 1或0. 2mg/L的NAA，pH為5. 8 ；培養溫度為25 士 1°C，光照強度為 15001UX，光照時間為每天12小時；觀察不同激素濃度配比的生根培養基對竹根姜生根的 影響，每種培養基接種芽苗數為30，20天后統計生根數和芽苗生長情況。結果見表3。由表3可知，竹根姜誘導生根較容易，在生根培養基中單獨添加6-BA 或NAA均能誘導芽苗生根，但效果較差，當培養基中只加入NAA時，芽苗葉片有黃化現象出 現且幾乎不萌發側芽；當培養基中只加入6-BA時，生根率較低且根質量不理想；因此，本發 明優選在生根培養基中添加濃度為0. 5 1. Omg/L的6-BA和濃度為0. 2mg/L的NAA(圖 4)。表3不同激素濃度配比的生根培養基對竹根姜生根的影響 4、試管苗移栽基質的優化將試管苗分別移栽至5種不同基質中培養，獲得脫毒組培種苗；5種基質分別為 ①珍珠巖；②體積比為1 9的珍珠巖-泥炭土混合物；③體積比為3 7的珍珠巖-泥 炭土混合物；④體積比為5 5的珍珠巖-泥炭土混合物；⑤泥炭土；每周施用1次氮磷鉀 總質量百分含量為25%的氮磷鉀三元復混肥(m5P5K5，即氮的質量百分含量為15%，磷和 鉀的質量百分含量各為5% )，施用濃度為0. 1% (g/mL)，基質濕度約為70%，光照強度為 2000 30001UX ；觀察不同移栽基質對竹根姜試管苗成活和生長的影響，每種基質移栽苗 數為50，實驗重復3次，40天后統計成活數和植株長勢。結果見表4。由表4可知，試管苗在5種不同移栽基質中的成活率均超過70%，但不同基質之間試管苗成活率及生長情況差異較大，其中，以基質③的移栽成活率最高達96. 67%，且芽苗健壯，葉色正常，側芽及新葉萌發快。推測其原因在于珍珠巖縫隙較大， 通透性好，有一定保水能力，但營養較差，單獨以其為基質時，試管苗營養吸收較少，導致新 根恢復較慢，植株生長較差；泥炭土有一定通透性，保水性好，營養較豐富，單獨以其為基質 時，試管苗根部易積水，導致爛根現象出現；而將珍珠巖與泥炭土合理配比，可以在保持通 透、濕潤的同時，又提供充足的有機養分，使新根和植株快速恢復，提高成活率。因此，本發 明優選基質③為試管苗移栽基質(圖5)。表4不同移栽基質對竹根姜試管苗成活和生長的影響 5、其它條件的優化實驗中還發現，切割工藝和光照條件對竹根姜叢生芽繼代增殖和玻璃化也有較大 影響。在進行叢生芽繼代增殖時，應將叢生芽分割至含有2 3個芽叢，再將其莖基部0. 5cm 以上部分切除，形成微型團塊轉接至增殖培養基上繁殖，注意芽切口不能浸沒在培養基中， 且接種時要先棄去培養基表面的水層，這樣可以提高增殖倍數，減少玻璃化現象的產生。在 強光照射條件下，竹根姜叢生芽多代培養后葉片邊緣黃化枯萎，這可能與生姜喜弱光，不耐 強光的生長習性有關。實驗發現，將叢生芽置散射光(光照強度為1500 25001UX)下培 養不會出現黃化現象。6、優化的竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法綜合上述實驗結果，優化的竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，包括以下步 驟a、莖尖叢生芽誘導取竹根姜嫩芽，經消毒滅菌后，剝取莖尖作為外植體；將莖 尖接種于誘導培養基，在光照條件下進行叢生芽誘導培養，獲得叢生芽；所述誘導培養基 以MS培養基作為基本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊脂、濃度為 2. Omg/L的6-BA和濃度為0. lmg/L的NAA，pH為5. 8 ；培養溫度為25士 1°C，光照強度為 15001UX，光照時間為每天12小時；b、叢生芽繼代增殖將步驟a所得叢生芽轉接至增殖培養基(將叢生芽分割至含 有2 3個芽叢，再將其莖基部0. 5cm以上部分切除，形成微型團塊轉接至增殖培養基，接 種時先棄去培養基表面的水層，并使芽切口露出培養基表面)，在光照條件下進行叢生芽 繼代增殖培養，獲得繼代增殖叢生芽；所述增殖培養基以MS(1/3NH4N03)培養基作為基本培 養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊脂、濃度為1. 5mg/L的6-BA和濃度為 0. lmg/L的NAA，pH為5. 8 ；培養溫度為25士 1°C，光照強度為15001ux，光照時間為每天12小時；c、生根培養當步驟b所得繼代增殖叢生芽生長至3 4cm高時，將叢生芽切 成單芽，轉接至生根培養基，在光照條件下進行生根培養，獲得試管苗；所述生根培養基 以1/2MS培養基作為基本培養基，并添加濃度為20g/L的蔗糖、濃度為6g/L的卡拉膠、濃 度為0. 5 1. Omg/L的6-BA和濃度為0. 2mg/L的NAA ；培養溫度為25士 1°C，光照強度為 15001UX，光照時間為每天12小時；d、試管苗移栽將步驟c所得試管苗移栽入體積比為3 7的珍珠巖-泥炭土混 合基質中培養，即得脫毒組培種苗。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限 定的本發明 的精神和范圍。
權利要求
竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，其特征在于包括以下步驟a、莖尖叢生芽誘導取竹根姜嫩芽，經消毒滅菌后，剝取莖尖作為外植體；將莖尖接種于誘導培養基在光照條件下進行叢生芽誘導培養，獲得叢生芽；所述誘導培養基以MS培養基作為基本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊脂、濃度為2.0mg/L的細胞分裂素和濃度為0.1mg/L的生長素，pH為5.6～6.2；b、叢生芽繼代增殖將步驟a所得叢生芽轉接至增殖培養基在光照條件下進行叢生芽繼代增殖培養，獲得繼代增殖叢生芽；所述增殖培養基以MS(1/3NH4NO3)培養基作為基本培養基，并添加濃度為30g/L的蔗糖、濃度為6g/L的瓊脂、濃度為1.5mg/L的細胞分裂素和濃度為0.1mg/L的生長素，pH為5.6～6.2；所述MS(1/3NH4NO3)培養基中硝酸銨的濃度為MS培養基中硝酸銨濃度的1/3，其余組分及其濃度與MS培養基相同；c、生根培養當步驟b所得繼代增殖叢生芽生長至3～4cm高時，將叢生芽切成單芽，轉接至生根培養基在光照條件下進行生根培養，獲得試管苗；所述生根培養基以1/2MS培養基作為基本培養基，并添加濃度為20g/L的蔗糖、濃度為6g/L的卡拉膠、濃度為0.5～1.0mg/L的細胞分裂素和濃度為0.2mg/L的生長素，pH為5.6～6.2；所述1/2MS培養基所含組分種類與MS培養基相同，但各組分的濃度僅為MS培養基中濃度的1/2；d、試管苗移栽將步驟c所得試管苗移栽入體積比為3∶7的珍珠巖-泥炭土混合基質中培養，即得脫毒組培種苗。
2.根據權利要求1所述的竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，其特征在于步驟 a c所述培養溫度為25士 1°C，光照強度為1500 25001ux，光照時間為每天12 16小 時。
3.根據權利要求2所述的竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，其特征在于步驟 a c所述光照強度為15001uX，光照時間為每天12小時。
4.根據權利要求1所述的竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，其特征在于步驟b 是將叢生芽分割至含有2 3個芽叢，再將其莖基部0. 5cm以上部分切除，形成微型團塊轉 接至增殖培養基，接種時先棄去培養基表面的水層，并使芽切口露出培養基表面。
全文摘要
本發明公開了竹根姜脫毒組培種苗工廠化繁育方法，包括莖尖叢生芽誘導、叢生芽繼代增殖、生根培養和試管苗移栽共四個步驟，分別對誘導培養基、增殖培養基、生根培養基和移栽基質等進行了優化，所得方法莖尖叢生芽誘導率高；叢生芽繼代增殖倍數高且玻璃化率低；芽苗生根率達100％，根系健壯且有側芽萌發；移栽成活率高，且芽苗健壯，生長快；本發明方法周期短，成本低，完全能滿足竹根姜大面積規模化栽培的需要，具有良好的應用前景。
文檔編號A01H4/00GK101836586SQ201010042068
公開日2010年9月22日 申請日期2010年1月15日 優先權日2010年1月15日
發明者劉奕清, 吳中軍, 唐建民, 廖林正, 陳澤雄, 黃登艷, 黃科 申請人:重慶市澳桉花木種植有限公司