專利名稱：一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快繁方法
技術領域：
本發明涉及一種通過組織培養技術的植物再生方法，特別是涉及一種 以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快繁方法。
背景技術：
川芎為我國最常見的中藥材之一，同時也是近幾年國際市場的暢銷植 物藥，是許多保健品和藥品的重要原料。由于該藥材受地理條件的限制， 所以其栽種面積有限，主要分布在我國四川省都江堰。川芎為兩年生植物， 由于川芎植物結實困難，歷來川芎的育種方法都是采用傳統的莖節營養繁 殖栽培，這種方法由于育種期間需要進行山區育苓、壩區栽種等環節，因 此育種周期較長；另外，所采用的種芎種質資源"苓種"自身存在易衰老 和易受病毒侵染等缺陷，因而造成川芎種性退化和品質下降，并易使川芎 在生產和儲藏中大量產生各種嚴重的病蟲害。因此川芎的種質資源質量問 題及育種時間長一直是困擾川芎大規模生產和提高產品質量的難題。發明內容本發明的目的是針對現有技術中存在的育種時間長、種質資源不穩定、 "苓種"自身易衰老和帶菌等問題而提供一種以幼嫩葉片為外植體的川芎 組織培養快繁方法，該方法可以大量快速地繁殖出生長速度快、品質優和 染菌率低的川芎組培苗。為達到上述目的，本發明采用的解決方案是先將作為外植體的川芎 幼嫩葉片進行消毒處理，然后將葉片剪成適當大小，接種到愈傷組織培養 基上；45天后將愈傷組織分割成適當大小，再轉接到不定芽的分化培養基上，當芽長至2 3cm以上時，將其切下轉接到生根培養基上進行生根培養， 并將基部愈傷組織再切成小塊，轉接到不定芽分化培養基上，以便形成更 多的不定芽；當組培苗不定根長至2cm以上時，打開瓶蓋，在室內煉苗3 4天后，將組培苗從培養瓶中取出，洗去培養基，將其移栽至松軟的蛭石介 質中；上述愈傷組織培養基為MS+6-BA 0 0.5mg/L+2.4-D 1 3mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂7.0g/L， PH值5.8 6.5;上述分化培養基為MS+6-BA 0.1 0.5mg/L+IAA 0.1 0.8mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂7.0g/L， PH值5.8 6.5;上述生根培養基為1/2MS+NAA 0.1 0.5mg/L+IBA 0.1 0.5mg/L+蔗 糖15g/L+瓊脂7.0g/L， PH值5.8 6.5;上述培養條件為溫度18 22°C、每天光照11 13小時、光照強度 1500 2000Lx。上述解決方案中可采用的外植體消毒方法可以有很多，常用的消毒劑 有70 75%乙醇、次氯酸鈉溶液、二氯化汞溶液等，本發明優選的方法是 先用洗衣粉浸泡外植體2 5分鐘，再用流水沖洗2 3小時，然后在無菌 條件下分別采用濃度為70 75%的乙醇消毒10 20秒、濃度為0.1%的升 汞處理3 6分鐘，最后用無菌水沖洗3 4次。上述解決方案中將組培苗移栽至松軟的蛭石介質后，應適當遮光，并 保持溫度在1S 22。C，相對濕度為75 85%，這樣組培苗的生長更快、更健祐。上述解決方案中的最佳愈傷組織培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+2， 4-D2mg./L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。經試驗發現， 一定范圍內的2， 4-D有 利于愈傷組織生長，但過高的2.4-D濃度則有抑制愈傷組織生長的作用，并 發現單獨使用2， 4-D的培養基產生的愈傷組織生長速度較快，且十分有利于川芎進行細胞懸浮培養，但不利于后期的不定芽分化；而同時加入了 2.4-D和6-BA兩種激素的培養基產生的愈傷組織雖生長速度稍慢，但有利 于后期的不定芽分化，所以本發明優選的愈傷組織培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+2， 4隱D2mg/L。上述解決方案中的最佳分化培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。采用這種濃度配比的分化培養基進行分 化培養巧，不定芽的誘導率最高，且苗生長速度快、健壯。上述解決方案中的最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L。采用這種濃度配比的生根培養基進行生 根培養時，生根率最高，且根分化速度快、根系發達及根粗壯。本發明采用組織培養方法培養組培苗所花的時間與傳統育種所花的時 間相比大大縮短，而且培養的組培苗自身生長健壯、不易感染病毒，因此 本發明具有的優點是能在短時間內大量繁殖出優質的川芎組培苗，從而 滿足川芎大規模生產的需求。另外實施本發明方法，只需有簡單的植物組 織培養設備即可進行，因此實用性強，可行性高，且不受季節限制。下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
具體實施方式
實施例1(1) 外植體的消毒先將作為外植體的川芎幼嫩葉片放入洗衣粉液中浸泡2分鐘，再用流 水沖洗2.5小時，然后在無菌條件下分別采用濃度為70%的乙醇消毒10秒， 濃度為0.1%的升汞處理3分鐘，最后用無菌水清洗4次；(2) 愈傷組織的培養將消毒后的葉片剪成適當大小，接種到愈傷組織培養基 MS+6-BA0.5mg/L+2， 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L上，并在24 26°C 、每天光照12小時、光照強度為1500 2000Lx進行培養，45天后統計誘導 率為65%;(3) 分化培養45天后將愈傷組織分割成適當大小，轉接到分化培養基 MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L上，并在24 26°C、每天光照12小時、光照強度為1500 2000Lx進行分化培養，培養 25天后，陸續開始在愈傷組織上有綠色芽點出現，經3 4周后長出不定芽， 培養50天后統計不定芽的誘導率為45%;(4) 生根培養將長到2cm以上的不定芽從愈傷組織上切割下來，接種到生根培養基 1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L上進行生根培 養，并把剩下的基部愈傷組織切成小塊，再轉接到上述不定芽分化培養基 上，繼續進行不定芽的誘導，以便形成更多的不定芽。不定芽在轉接到生 根培養基上35天左右陸續在莖基部四周長出較粗壯的不定根，培養50天 后統計生根率為64%; (5)煉苗和移栽當組培苗長至2cm以上時，選擇生長較健壯、根系較發達的壯苗逐漸 打開瓶蓋，讓幼苗慢慢地適應周圍環境，在室內煉苗3天后，移栽至松軟 的蛭石介質中，適當遮光，溫度保持在2(TC左右，相對濕度在75 85%， 組培苗生長健壯。實施例2愈傷組織培養基采用MS+2， 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，其它步驟同實施例1。采用該愈傷組織培養基誘導愈傷組織，45天后統計其誘 導率為67.5%，略高于實施例l。所產生的愈傷組織生長速度較快，且十分 有利于川芎進行細胞懸浮培養，但不利于后期的不定芽分化。而采用實施例1的愈傷組織培養基雖然誘導率稍低，愈傷組織生長速度稍慢，但有利 于后期不定芽的分化。 實施例3愈傷組織培養基采用MS+6-BA0.5mg /L+2， 4-D3mg/L+蔗糖30g/L+瓊 脂7.0g/L，其它步驟同實施例l。采用該愈傷組織培養基誘導愈傷組織，45 天后統計其誘導率為55%，低于實施例l、實施例2，但不明顯。而當2， 4-D的濃度為4mg/L時，45天后統計其誘導率僅為25%，出現了明顯下降。實施例4分化培養基采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它歩驟同實施例l。 50天后統計其不定芽誘導率為27.5%，低于 實施例1 。實施例5分化培養基采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L上，其它步驟同實施例l。 50天后統計其不定芽誘導率為17.5%。 實施例6分化培養基采用MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實施例l， 50天后統計其不定芽誘導率為42%。 實施例7生根培養采用1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實施例l。 50天后統計生根率為53%。 實施例8生根培養基采用1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊月旨 7.0g/L，其它步驟同實施例l。 50天后統計生根率為40.2%。 實施例9生根培養基采用1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L，其它步驟同實施例l。 50天后統計生根率為51%。 實施例10生根培養基采用1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂 7.0g/l，其它步驟同實施例l。 50天后統計生根率為36.2%。
權利要求
1.一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快繁方法，其特征在于先將作為外植體的川芎幼嫩葉片進行消毒處理，然后將葉片剪成適當大小，接種到愈傷組織培養基上；45天后將愈傷組織分割成適當大小，再轉接到不定芽的分化培養基上；當芽長至2～3.0cm以上時，將其切下轉接到生根培養基上進行生根培養，并將基部愈傷組織再切成小塊，轉接到不定芽分化培養基上，以便形成更多的不定芽；當組培苗不定根長至2cm以上時，打開瓶蓋，在室內煉苗3～7天后，將組培苗從培養瓶中取出，洗去培養基，將其移栽至松軟的蛭石介質中；上述愈傷組織培養基為MS+6-BA 0～0.5mg/L+2，4-D 1～3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；上述分化培養基為MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IAA 0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；上述生根培養基為1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；上述培養條件為溫度18～22℃、每天光照11～13小時、光照強度1500～2000Lx。
2. 根據權利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快 繁方法，其特征在于所采用的消毒方法是先用洗衣粉浸泡外植體2 5分 鐘，再用流水沖洗2 3小時，然后在無菌條件下分別采用70 75%的乙醇 消毒10 20秒、0.1%升汞處理3 6分鐘，最后用無菌水沖洗3 4次。
3. 根據權利要求1或2所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培 養快繁方法，其特征在于將組培苗移栽至松軟的蛭石介質后，應適當遮 光，并保持溫度在20 25'C，相對濕度為75 85%。
4. 根據權利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快繁方法，其特征在于愈傷組織培養基為MS+6-BA0.5mg/L+2， 4-D 2mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。
5. 根據權利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快 繁方法，其特征在于分化培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。
6. 根據權利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快 繁方法，其特征在于生根培養基為1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+ 蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L。
全文摘要
本發明公開了一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養快繁方法，該方法包括外植體的消毒、愈傷組織的培養、分化培養、生根培養、煉苗和移栽步驟，所采用的愈傷組織培養基為MS+6-BA 0～0.5mg/L+2，4-D1～3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5～7.0g/L；分化培養基為MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5～7.0g/L；生根培養基為1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂6.5～7.0g/L。本發明方法可以大量快速繁殖出生長速度快、品質優、染菌率低的川芎組培苗，從而滿足大規模生產川芎的需求。
文檔編號A01G31/00GK101243774SQ20081004498
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月14日 優先權日2008年3月14日
發明者暢 劉, 潔 吳, 孫雁霞, 張海強, 徐文俊, 王躍華, 鄔曉勇, 馬丹煒 申請人:成都大學