專利名稱：：活的、可儲存的蟲卵懸浮液的制備的制作方法活的、可儲存的蟲卯懸浮液的制備本發明涉及用于制備活的(viable)含有寄生蠕蟲卵的懸浮液時的純化方法，其中該懸浮液可以發育且適于治療應用。寄生物感染對動物宿主的免疫系統的激活的影響是已知的(Review,D.M.McKay,Parasitology2006,132:1-12)。這種激活還會影響免疫系統疾病的發生和發展。流行病學的研究表明，在蟲感染(Wurminfektionen)比率域。患克羅恩氏病(MorbusCrohn)(—種慢性炎癥性腸部疾病)患者的細胞因子曲線(Cytokinprofile)顯示蠕蟲感染會刺激Th2-免疫細胞。克羅恩氏病，一種Thl支配的自身免疫疾病，可以受到蠕蟲感染的抑制或影響(Summers等人，AmJGastroenterol2003,98:2034-2041)。其他Thl-免疫細胞引起的疾病，如螺桿菌屬(Helicobacter)引起的胃炎和自身免疫腦脊髓炎，也會受到影響。早在1973年，Beer(Parasitology1973，67:253-262)就已經報道豬鞭蟲(7Wc/zw^wzX)可能是一種實現人類免疫而不產生線蟲病原體感染的合適線蟲。豬鞭蟲是人鞭蟲(7Wc/m^/mmam;)的近親，生活在人類的胃腸道中，但是其自身不繁殖。對于這種自身限制的感染，不需要采取治療措施。因此，通過辨鞭蟲感染可以產生免疫。R丄S.Beer(Parasitology1972,65:343-350)記載了一種收集和純化蟲卵的方法。在0.2。/。的重鉻酸鉀溶液中在32。C下培養胚胎化階段的蟲卵，并每天換氣。在DE10163115中記載了一種相似的純化方法。借助羥基自由基或氧自由基引起的化學反應從蟲卵中將全部微生物和病毒除去。具體描述了這種所謂的芬頓反應(Fenton-Reaktion)。反應時，FeCl2可以與H202反應生成初生態氧(Sauerstoffinstatunascendi)，其消毒作用得到利用。Boes等人(VeterinaryParasitology(1998)，第181—190頁)描述了從豬蛔蟲(Aca^www)雌蟲中獲取并在硫酸中進行了胚胎化的卵的胚胎化(Embryonierung)和感染性。Summers和其同事(GUT2005,54:87-90)首先在含抗生素(青霉素/鏈霉素/兩性霉素B)的緩沖溶液中胚胎化豬鞭蟲卵5~6周后，使用了在pH為6~7的磷酸鹽緩沖液中的0.2%重鉻酸鹽溶液純化了豬鞭蟲卵。使用這些殺死細菌和病毒的試劑具有下列各種缺點無論是在使用重鉻酸鹽溶液還是使用芬頓溶液的情況下，都必須在短時間后棄去這些溶液，以避免危害蟲卵。此外，研究顯示在純化后的胚胎化過程(3個月，在22。C25。C下)中微生物會大量繁殖，盡管有在先的純化步驟，但在后續的在28。C下儲存胚胎化的卵時，也無法避免孩t生物的繁殖。因此很有可能發生的是，一旦除去了這些殺死微生物和病毒的試劑后，在豬鞭蟲卵懸浮液中微生物又會重新生長。此外，從溶液中徹底除去重鉻酸鹽是絕對必須的。然而這個步驟是非常復雜的。如Summers所述加入抗生素可以避免在卯胚胎化階^:;微生物的大量繁殖，盡管這樣可以抑制在該階段中微生物的大量生長，但是卻不能保證殺死這些微生物。在接著的純化和儲存直到使用的過程中在除去了抗生素之后，出現了微生物的重新大量生長。本發明的目的是制備一種通過純化除去污染性病毒和微生物特別是細菌的胚胎化蟲卵懸浮液，該懸浮液在被儲存的過程中能不發生真菌孢子和酵母菌的生長。本文描述的方法保持了從蟲卵至成蟲的發育能力。該蟲卵懸浮液適于治療應用。在本發明的范圍內，出人意料的發現了一種純化和防腐的組合方法，特別適合于解決上述問題，因為該方法與目前已知的方法相比，不必^使用有毒的物質(如重鉻酸鉀，&20207)和消毒劑。在該純化方法中，用pH值《2的酸溶液、優選H2S04溶液溫育A^蠕蟲、優選從豬鞭蟲分離的卵172小時(參見實施例1)。最佳溫育時間為2~8小時，優選為3小時。該溫育在4。C37。C、優選2535。C的溫度下進行。制備口服藥物制劑的方法(其中所述制劑含有可儲存的活蟲卵的懸浮液，該蟲卵為對人不致病的寄生蠕蟲的蟲卵，在服用該懸浮液后，發育出包含下述步驟第一步，首先用pH值S2的酸處理蠕蟲卵懸浮液。在后續步驟中，提高pH值至24，并添加藥理學上可接受的防腐劑。原則上，先加入防腐劑后再進行酸處理也是可以的。但是優選的是先進行酸處理，再加入防腐劑。優選的是通過加入好u酸進行酸處理。在進行酸處理時，加入足量的酸使pH值下降到約0.52的范圍內。在另一個實施方式中，pH值下降到約O~<1。合適的酸是鹽酸、硝酸，或優選硫酸。只允許在較短的時間范圍內進行酸處理以4更防止不適當的損害蟲卵。其中，在酸濃度和酸處理時間之間也存在聯系。優選將pH值降低到小于2，更優選降低到pH為0.60.8。酸處理的持續時間為數分鐘到若干小時，優選為120分鐘360分鐘。能夠承受的短期時間還包括蟲卯的胚胎化過程(3個月，于2225°C)。在酸處理后，通過加入合適的堿如NaOH使pH值升回到pH值〉4。接著加入一種或多種防腐劑，其中原則上可以使用適用于防腐食品或藥物的全部物質。優選使用患有克羅恩氏病的患者耐受性確定良好的防腐劑。防腐劑優選選自山梨酸、苯曱酸、這些酸的鹽，對苯曱酸酯、對羥基苯曱酸酯、丙二醇，或這些防腐劑的組合。特別優選使用的一種或多種防腐劑選自濃度為0.010.2%、特別為0.1~0.2%的山梨酸，濃度為0.10.3重量％的苯甲酸，濃度為0.02~0.3重量％的對羥基苯曱酸酯，濃度為5~20重量°/。的丙二醇，或者上述給定濃度范圍的上述防腐劑的組合。除了強酸以外，弱酸溶液如山梨酸和其鹽也適于在添加上述防腐劑的情況下使微生物和病毒快速失活。然而，使用這些溶液相比于使用強酸的優點是由于在較弱的酸性pH下，蟲卵可以在唯一的介質中經歷純化、胚胎化(3個月，于22~25°C)、儲存以及將其用于患者。長時間處理對于蟲卵的成活力(Lebens傷higkeit)沒有副作用(參見實施例5)。該溫和方法(schonendesVerfahren)使用pH值>1、優選《2的含防腐劑的介質，并對蟲卵懸浮液的微生物純度無任何限制。所得含防腐劑的、帶有胚胎化蟲卵的懸浮液適合用作患者的飲服溶液。適當的可以向這些蟲卵中加入其他藥理學上可接受的添加劑，如色素、香料或增稠劑。因此，本發明涉及口服藥物制劑，其含有可^f渚存的活蟲卵的懸浮液，該蟲卵為對人不致病的寄生蠕蟲特別是豬鞭蟲的蟲卵，在服用該懸浮液后發育出足夠數量的蠕蟲，從而刺激調節性人T細胞，并且該懸浮液的每毫升懸浮液中含有少于1000個孩史生物的集落形成單4立(cfU=colonyformingunit)。優選該口服藥物制劑的每毫升懸浮液中含有少于100個微生物的集落形成單位。特別優選該口服制劑的每毫升懸浮液含有少于IO個微生物的集落形成單位。用普遍的微生物學方法確定集落形成單位的個數。在本文中，微生物指細菌、病毒、真菌、酵母菌(yeasts)和原生動物，其中不存在對健康有負面作用的那些微生物。本發明的方法還可以提供適于藥物應用形式的、能儲存卵的懸浮液，其中該卵為對人不致病的寄生蠕蟲的卵。通過本發明的處理，首先殺死污染微生物，尤其是細菌，還有真菌、病毒以及可能的原生動物使所述制劑達到適于藥物使用的水平。然而，其次，該處理足夠溫和使蟲卵保持了它們的生長能力，一旦在患者的腸部被吸收后，可以引起所期望的免疫系統剌激。本發明制劑特別適于治療各種炎癥性腸部疾病，主要是慢性炎癥性腸部疾病。所述制劑可以用于治療一種#1稱為克羅恩氏病的炎癥性腸部疾病的特別有利的方法中。實施例l:豬鞭蟲卵懸浮液中微生物的減少才艮據DAB(德國藥典(deutschesArzneibuch),2.6.12節，2006年，最新一次含第24條附錄(Erg紐zungslieferung)的更新)的規定，確定了磷酸鹽緩沖液(pH7)中濃度為2400卵/ml的豬鞭蟲卵懸浮液(TSO)中的微生物個數。結果顯示現有的微生物個數(Keimstatus)為190000cfWml。然后用稀H2S04溶液將這種懸浮液重新緩沖(umpufferen)到pH2。在30。C儲存3小時后，細菌數減少到<20cfti/ml。然后，檢測本方法的性能。對此，根據德國藥典(DAB)的規定使用細菌、酵母菌和真菌的確定測試菌種。在實施例2a、2b和2c中示出了檢測結果。實施例2:微生物數的確定a.用表1中所給的形成孢子和不形成孢子的測試細菌接種到DAB2.6.13規定的營養懸浮液中。接著用H2S04稀溶液重新緩沖到pH2,并于3(TC下儲存6小時。隨后測定的微生物個數的數值如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*通過延長酸處理至約6~10小時可以使集落形成單位減少到小于10。b.用表2中所給的測試酵母菌接種到DAB2.6.13規定的營養懸浮液中。接著用H2S04稀溶液分別重新緩沖到pH2或pH1,并于25"C下分別儲存3小時或48小時。隨后檢測得到的數值如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>釀酒酵母(Sacc/wwOTyceycer.)4700003800002200003900040*白色念珠菌(C朋c^aa版cara)6900003800003200026000<10*通過延長酸處理至72小時可以使cfti減少到5。c.用表3中所給的測試霉菌接種到DAB2.6.13規定的營養懸浮液中。接著用H2S04稀溶液分別重新緩沖到pH2、pH1或pHO,并于25。C下分別儲存3小時或48小時。隨后檢測得到的數值如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>C4,gi腸80000037000070000050000050000050<10如果對于確定的微生物通過酸處理不能使cfii充分減少，則相應地延長酸處理的持續時間至72小時。實施例1和2ac表明，H2S04稀溶液(pH2)在短時間后有效地殺死細菌。對于酵母菌和真菌則需要較長的溫育時間或更強酸性的pH值才能將它們有效地殺死。出人意料地是，上述純化步驟也適合于制備不含病毒的豬鞭蟲卵懸浮液。實施例3:病毒的減少在制備豬鞭蟲卵懸浮液(TSO)時使鼠白血病病毒(MuLV)、假狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)和貓流感病毒(FCV)失活。所使用的病毒為模型病毒(Modellviren)。用終點滴定確定接種樣品中的病毒價(Virustiter)。在這種已知方法中，將稀釋后樣品涂覆于含有易區分的指示細胞的微孔滴定板上。在含病毒的樣品感染指示細胞后，細胞形態因細胞裂解而改變。在顯微鏡下容易測量這種細胞裂解。將高濃度的有包膜或棵露檢測病毒加入到0.01NH2S04溶液(pH2，30。C)中，該溶液還含有TSO。分別在IO分鐘、3小時和72小時后測定病毒的活性。有包膜病毒PRV和MuLV在10分鐘后不再具有感染性；棵露病毒FCV和PPV在3小時后不再具有感染性。利用由1NNaOH中和的平行樣品的結果(parallelsample)表明在溫育3小時后，所有4種病毒仍然是有毒性的。由于0.01N硫酸中0.2%重鉻酸鉀溶液的細胞毒性，因此無法檢測這種^^液作為對比。只有長時間的溫育和將pH值降低到pH值為0、優選<1才能使真菌和酵母菌明顯減少(參見實施例2、表2和3)。在酸性高的介質中的純化方法，這種新方法具有損害蟲卵懸浮液成活力的缺點。出乎意料地發現了本發明的第二個特征，即，通過添加可口服的、用于防腐目的的化學物質，可以得到胚胎化系數(Embryonierungskoeffizient)。胚胎化系數是蟲卵成活力的明確標志。此外，使用防腐劑在pH4時就可以使污染微生物失活。證明為優選的可口服的防腐劑為苯曱酸，山梨酸，它們的鹽，和丙二醇(參見實施例4ae)。僅通過加入防腐劑就能夠實現使用酸性相當小的介質，且蟲卵可以更好的耐受這種介質，以這種方式，蟲卵可以在唯一的介質中經歷純化、胚胎化、儲存和將其用于患者。因此可以提供一種能夠長時間應用的介質。新微生物對TSO懸浮液可能造成的再污染會因稀酸的使用和防腐劑的添加而受到抑制。使用上述TSO懸浮液的失活和防腐的組合方法避免了新細菌的生長。因此，相對于使用強酸的方法，這種極其溫和的方法具有明顯的優勢。實施例4:各種微生物集落數的確定將pH值從pH2升高到pH4，并加入防腐劑實施例4a4e的實驗條件每個測試樣品分別含有在磷酸鹽緩沖溶液(pH4)中的10000TSO/ml(±10%)和0.2%苯曱酸、0.1%山梨酸或15%丙二醇。向測試樣品中加入下列4敫生物—黑曲霉作為單獨的微生物隱銅綠假單胞菌CPwwcfomo"os『wg7-"ora)、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌組合。溫育溫度為25。C。在17天后評估測試板。所得結果如下4a銅綠假單胞菌防腐劑第0天(cfii/ml)第1天(cfo/ml)第7天(cfii/ml)苯曱酸0.2%180000<10<10山梨酸0.1%18000030<10丙二醇15%18000010<104b金黃色葡萄球菌防腐劑第0天(cfti/ml)第1天(cfli/ml)第7天(cfti/ml)苯曱酸0.2%130000<10<10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>出人意料的發現，這種純化方法不危害蟲卵懸浮液的成活力。實施例5:蟲卵的成活力在不同介質中懸浮濃度為40000蟲印/ml未胚胎化的蟲卵并胚胎化(22~25°C)。在60-90天的溫育期后，用顯樣么鏡觀測了該單獨懸浮液，并由蟲卵總個數以及形態完整并胚胎化的蟲卵個數計算胚胎化系數。因此，胚胎化系數(EK)是蟲卵成活力的指標。在胚胎化開始時，只存在未胚胎化的蟲卵，這樣系數就為零。該系數隨著胚胎化的持續而增加，并在所選溫育條件下從第60天開始達到最大值。這些值基本都達到了90%。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>對于所有的介質，在60天的胚胎化后，胚胎化卵的比例均超過90%。含防腐劑的介質中與防腐劑的濃度無關，在繼續培育30天后胚胎化系數均沒有減少，在硫酸pH0.5的情況下觀察到胚胎化蟲卵比例的減少。由此，添加可口服防腐劑、優選山梨酸及其鹽后可以允許使用對蟲卵無害的pH值。因此，該方法可用于制備適合穩定儲存的制劑(溫和方法)。為了制備進一步的產物需要將pH值提高到pH27，優選pH46,以及添加合適的防腐劑。待使用的防腐劑必須適于口服應用。其中，證實了濃度為0.1~0.2%的山梨酸、濃度為0.1~0.3%的苯曱酸或濃度為5~20%的丙二醇水溶液是合適于這樣的目的的。同樣合適的還有上述防腐劑的混合物。權利要求1.一種制備口服藥物制劑的方法，該制劑含有可儲存的活蟲卵的懸浮液，所述蟲卵為對人不致病的寄生蠕蟲即豬鞭蟲的蟲卵，在服用該懸浮液后發育出足夠數量的蠕蟲，從而刺激調節性人T細胞，其中，該蠕蟲卵懸浮液于一個步驟中在pH值≤2經歷酸處理，在后續步驟中將pH值調節至≥4，并添加藥理學上可接受的防腐劑。2.權利要求l所述的方法，其中，通過添加硫酸進行所述酸處理。3.前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述防腐劑選自山梨酸，笨曱酸，這些酸的鹽，對苯曱酸酯，丙二醇，或這些防腐劑的組合。4.權利要求3所述的方法，其中，加入一種或多種選自下列的防腐劑濃度為0.01~0.2重量％的山梨酸、濃度為0.1-0.3重量％的苯曱酸、濃度為0.02~0.3重量％的對羥基苯曱酸酯、濃度為5~20重量％的丙二醇，或者上述給定濃度范圍的上述防腐劑的組合。5.前述權利要求中任一項所述的方法，其中，適當時，向所述懸浮液中進一步加入藥理學上可接受的添加物。6.口服藥物制劑，其含有可儲存的活蟲卵的懸浮液，所述蟲卵為對人不致病的寄生蠕蟲的蟲卵，在服用該懸浮液后發育出足夠數量的蠕蟲，從而刺激調節性人T細胞，其中，所述懸浮液的每毫升懸浮液中含有少于1000個微生物的集落形成單位。7.權利要求6所述的口服藥物制劑，其中，所述懸浮液的每毫升懸浮液中含有少于100個微生物的集落形成單位。8.權利要求7所述的口服藥物制劑，其中，所述懸浮液的每毫升懸浮液中含有少于IO個微生物集落形成單位。9.權利要求68中任一項所述的口服藥物制劑，其中，所述樣i生物選自細菌、病毒、真菌、酵母菌和原生動物。10.權利要求69中任一項所述的藥物制劑，其中，所述制劑由權利要求1~5中任一項所述的方法制備。11.權利要求1~5中任一項所述的方法所制備的蠕蟲、即豬鞭蟲的可儲存的蟲卵的懸浮液的用途，是用于制備治療炎癥性腸部疾病、特別是慢性炎癥性腸部疾病的藥物制劑。12.權利要求11所述的用途，其中，所述炎癥性腸部疾病為克羅恩氏病。全文摘要本發明涉及一種新的有利的純化方法，其保證了蟲卵懸浮液的胚胎化能力和成活力。首先在非胚胎化條件下于pH值約為≤2的硫酸溶液中處理豬鞭蟲卵。由此成功地殺死細菌和病毒。酵母菌和真菌的萌芽數減少。在第二步中，增加pH值并加入可以口服的防腐劑。由此成功地殺死了酵母菌和真菌。然后，在第二步純化步驟中使用的懸浮介質可被用作附加的生產(胚胎化)和儲存的培養介質。文檔編號A01N1/02GK101646340SQ200880010402公開日2010年2月10日申請日期2008年3月31日優先權日2007年4月2日發明者克里斯琴·M·O·卡佩爾,阿蘭·K·羅普斯托夫,魯道夫·威廉申請人:福爾克博士藥物有限責任公司