具有改變的木質素組分的轉基因甜高粱及其制備方法

專利名稱：：具有改變的木質素組分的轉基因甜高粱及其制備方法具有改變的木質素組分的轉基因甜高粱及其制備方法
背景技術：
：甜高粱(Sweetsorghum)，甜高粱種(Sorghumbicolor(L.)Moench)，是提供可用于制造酒精、糖、糖漿、燃料等的穗粒和莖稈的唯一的農作物。這種植物的主要問題是細胞壁中存在木質素，其不利地影響了有益物質的提取工藝。木質素含量的改變有可能改善植物的質量。所有用于栽培具有減少的木質素含量的變種所采取的傳統育種方法，成功率有限。因此，通過基因工程開發具有改變的木質素含量的栽培變種的可能性被認為是完全可能的。木質素被認為是由對_香豆醇(p-coumarylalcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和芥子醇(sinapylalcohol)單體脫氫聚合而成的。這些單體通過苯基丙酸類合成路徑(phenylpropanoidpathway)合成。這些單體在結構上僅在芳環(aromaticring)的3C和5C位置的甲氧基不同。改變單體的比例決定著木質素的類型。木質素分子的變化/異質性取決于特定組分的總量當對_香豆醇的總量高于其它組分時，其被稱為羥苯基木質素(hydroxyphenylODlignin，H木質素)；當松柏醇的總量高于其它組分時，其被稱為愈創木基木質素(guaiacyllignin(G)，G木質素)。類似地，如果芥子醇的含量超過其它組分時，則被稱為紫丁香基木質素(Syringyllignin(S),S木質素)。在酶降解過程中，G木質素比S木質素具有更高的抗性。因為在G木質素中存在更多數量的分子間連接而使其更加致密，從而呈現更高的抗性。據觀察，木質素的水平隨著飼料作物，包括如紫花苜蓿(alfalfaCJungetal.,1997))的豆類植物和高羊茅(fescue(BuxtonandRedfearn,1997)的草本植物的莖干的漸進成熟而增加。另外，木質素組分隨著進一步成熟，其中的S/G比漸進地升高(BuxtonandRussell，1988)。已采取多種方法降低木質素的含量和提高S/G比。但是，結果發現是矛盾的，這可能由于缺少對木質素生物合成途徑的了解，及由于采用不合適的用于木質素生物合成酶活性的下調方法，這包括轉基因、應用的啟動子、反義盒的構建的選擇，最重要的是轉化子的篩選。調控如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate4_hydroxylase)、4_香豆酸輔酶A連接酶(4-hydroxycinnamateCoAligase)的酶的初始反應步驟減少了木質素的含量。但是，這會導致多效性的效果，其包括改變的葉子形狀，局部的熒光病變、植株矮小、降低的授粉活性、改變的花的形態和色素沉著，降低了水平的可溶苯丙氨酸，降低了的S/G比等。由其它工作者進行的改變或改良的S/G比而得到的相似效果是導致表型缺陷植物。結果表明，咖啡酸0-甲基轉移酶(caffeicacidO-methyltransferase)的活性下調會導致紫丁香基木質素生物合成的劇烈下降，而對愈創木基木質素的影響不大，這個結果是不理想的，因為后者對化學降解具有更高的抗性。在這樣的背景下，本發明應用一種不同的方法構建反義基因盒從而提供了一種新的在細胞壁中具有改良的木質素含量的轉基因甜高粱植物。圖1用于植物轉化的CCoAOMT基因的反義盒的限制性分析H=HindIII，S:SacI，B=BamHI,E=EcoRI,M用Hindlll/EcoRI消化的LambdaDNA；圖2用于植物轉化的COMT基因的反義盒的限制性分析H=HindIII，S=SacI,B=BamHI,E=EcoRI,M用Hindlll/EcoRI消化的LambdaDNA；圖3轉基因植物的照片；圖4通過PCR從基因組中擴增的反義-C0MT。泳道1-7表示假定的轉化子；_ve表示對照植物；+ve表示細菌中的反義構建體，M表示標準(marker)；圖5通過PCR從基因組中擴增的反義-CCoAOMT。泳道1_7表示假定的轉化子；_ve表示對照植物；+ve表示細菌中的反義構建體，M表示標準(marker)；圖6雙鏈介導的反義-COMT構建體；圖7雙鏈介導的反義-CCoAOMT構建體；圖8雙鏈介導的反義-COMT和反義-CCoAOMT構建體。發明詳述通過大量的試驗，申請人發現木質素組分受CCoAOMT特別影響，受COMT—般影響，當調控時，CCoAOMT對甜高粱植物中的木質素組分具有直接的影響。因此，本發明提供一種與野生植物相比具有改變的木質素含量和/或改變的木質素組分的甜高粱，這是通過包含如SEQIDNO2所示的用于編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)的分離的DNA序列的構建體的整合，操作甜高粱中的咖啡酸0-甲基轉移酶(COMT)和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)的表達而實現的。在本發明的一個優選方面，甜高粱顯示了改變的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶活性。可選擇地，植物還顯示了與野生植物的咖啡酸0-甲基轉移酶活性相比改變的咖啡酸0-甲基轉移酶活性。因此，本發明的優選植物包含至少一個外源核苷酸，該外源核苷酸包含與至少一部分咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶基因“反義”的核苷酸序列，使得轉錄外源核苷酸時，內源咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶的活性被抑制。本發明的植物包含至少兩個外源核苷酸，第一外源核苷酸包含與至少一部分咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶基因反義的核苷酸序列，第二外源核苷酸包含與至少一部分咖啡酸0-甲基轉移酶基因反義的核苷酸序列。當呈現調控內源咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶和內源咖啡酸0-甲基轉移酶兩者的活性時，上述的構建體包含第一和第二外源核苷酸。外源核苷酸可以呈現于植物中作為相同核苷酸分子的一部分(例如，當它們呈現于相同載體時)；或者它們可以作為單獨的分子存在(例如，當它們呈現于不同的載體時)。本發明在此還提供制備具有改變的木質素含量的轉基因植物的方法。植物被遺傳性地改造，以降低木質素合成所涉及的一種或多種酶的活性。在一實施例中，本發明公開了制備基因工程植物的方法，其包括用至少一個外源核苷酸轉染植物細胞，該外源核苷酸與植物中木質素生物合成所涉及的至少一個生物合成酶的降低的活性相關聯，然后使轉染的植物細胞生長為與可比較的野生植物的木質素含量相比具有降低的木質素含量的基因工程植物。在本發明中，所需要的酶是CCoAOMT，外源核苷酸包括與至少一部分CCoAOMT基因“反義”的核苷酸序列。可選擇地，植物細胞還可以用例如與至少一部分COMT基因“反義”的第二外源核苷酸轉染。轉染的植物細胞然后生長為與野生植物相比具有改變的木質素含量和/或改變的木質素組分的轉基因植物。轉染的植物細胞然后生長為具有改變的木質素組分的基因工程植物。通過公知方法，例如通過表達載體，將外源核苷酸整合入植物細胞中。通過用編碼所有需要的反義分子的單一載體或通過每個都編碼一個或多個反義核苷酸的多個載體轉染植物細胞，可以制得包含兩個或更多個不同的反義核苷酸的植物細胞。單個反義核苷酸的多個拷貝可以，但非必要包含在單一載體中。最好，反義核苷酸的每個拷貝可操作地連接到其各自的啟動子和終止子上。CCoAOMT基因(或基因單元)以與可借助于反轉錄酶/聚合酶通過mRNA獲得的cDNA("拷貝〃DNA)互補的方式存在。CCoAOMT基因還可以以部分或全部合成的形式存在。通過合成的基因，也可以理解為其是通過新加入部分天然基因形成的。表汰盒表達盒將包含用于篩選轉化細胞的選擇標記基因。選擇標記基因用于篩選轉化細胞或組織。選擇標記基因包括編碼抗生素抗性潮霉素磷酸轉移酶(hptll)的基因。表達盒可以包含一個或多于一個的被轉移到轉化植物并在其中表達的基因或核苷酸序列。因此，每個核苷酸序列將被可操作性地連接到5'和3'的調控序列。可選擇地，可以提供多個表達盒。本發明提供用于減少甜高粱(Sorghumbicolor,高粱)中木質素的高粱的有效轉化的組合物和方法。轉化的高粱植物的特征在于包含轉移的核苷酸，例如是轉移的基因或側翼連接有至少一個T-DNA接頭并插入到高粱植物基因組內的目的基因。由此生成的植物在形態和生殖上是正常的。咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶，下稱CCoAOMT，在生物合成途徑中催化咖啡酰輔酶A的甲基化，使其從反式-4-香豆酰-CoA轉化為反式-阿魏酰-CoA。此處所說的CCoAOMT基因，應理解為其轉錄成RNA后并翻譯為蛋白質的任意核苷酸(DNA)，形成了具有CCoAOMT的性質的酶，該核苷酸從其天然環境中分離而來，或被整合到載體上或在原核或真核DNA中被包裹為“外源”DNA或“附加”DNA。此處所說的CCoAOMT基因，還應理解為是在其起始和/或末端包含不會或實質上不會妨礙基因的功能的附加DNA序列的CCoAOMT基因。這些DNA序列，還可以稱為“基因單元”("geneunits")，例如可以通過限制性酶切切割形成，因為在基因的起始和末端沒有有慣常的限制性酶的切點可以利用。CCoAOMT基因或基因單元在其末端還可以攜帶適于它們操作的DNA序列(例如“連接子”)。本發明的方法有益于轉化高粱植物細胞。這些細胞可以來源于具有愈傷組織形成潛能的未成熟的胚組織和枝條頂端分生組織。可選擇地，愈傷組織可以來源于花粉囊、小孢子、成熟的胚，其原則上來源于能夠形成愈傷組織和/或第二胚的高粱植物的任何其它組織。生成再生愈傷組織的有用的組織是從已發育的種子中切下的枝條頂端分生組織。用滅菌蒸餾水洗滌用吐溫20(5分鐘)和0.2%氯化汞(7分鐘)滅過菌的種子表面。然后將種子在培養皿中的浸有滅菌蒸餾水的滅菌過濾紙上孵育，在黑暗中保持3天，以在農桿菌(Agrobacterium)孵育前使枝條頂端生長。反義盒的生成和其在農桿菌中的轉化本發明包含的用于生成咖啡酸0-甲基轉移酶(COMT)和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)的cDNA的反義盒及將其導入植物細胞的步驟包括(1)從高粱植物的莖稈組織中分離mRNA；(2)由mRNA制備cDNA；(3)分離所需要的cDNA;(4)通過測序測定cDNA的性質；(5)通過應用用于生成雙鏈RNA的連接子加入正向和反向的基因片段構建基因.品.(6)通過在表達各個轉錄本的啟動子的下面放置正向_反向基因盒構建表達盒；(7)在根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中轉化盒；(8)將攜帶各個基因盒的根瘤農桿菌轉化到合適的高粱移植體中；及(9)篩選假定的轉化子。此處使用的重組技術包含所屬
技術領域：
公知的及在例如Sambrooketal(1989)的標準參考資料中描述的標準的分子生物學技術。一般地，根據制造商的使用說明書，需要進行包含DNA連接、DNA聚合酶、限制性核酸內切酶等的酶反應。本發明包含雙鏈RNA-介導的基因干涉或融合發卡(CVhairpin)RNA方法。雙鏈RNA(dsRNA)-介導的基因干涉的使用已經在多種生物體包括植物中證明。雙鏈RNA分子與單鏈RNA相比具有的優勢是a)雙鏈RNA能啟動依賴同源的mRNA降解的天然的核糖核酸酶H(RNaseH)；b)合成的雙鏈SiRNA分子形成了特異地抑制基因表達的3'突出粘性末端(3，-overhang)；c)雙鏈siRNA具有意想不到的高效率和穩定性。已經證明極少數目的dsRNA分子可以對大量轉錄的靶目標產生在ssRNA情況下不可能實現的特異的抑制(MontogomeryandFire,1998)。cDNA的制備cDNA通過反轉錄從甜高粱莖稈的mRNA制備。引物對提供可以用于被反轉錄酶延長的自由3’端的mRNA退火。酶使其按通常的5’到3’延長，由與mRNA模板配對的互補堿基引導形成雜交分子，該雜交分子由與互補的cDNA鏈配對的模板RNA鏈堿基組成。最初的mRNA降解后，使用DNA聚合酶合成互補的DNA鏈，將單鏈cDNA轉變為雙螺旋cDNA。應用從來自異源植物系統的基因的保守氨基酸序列設計的兼并引物，通過5’和3’RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds，快速擴增cDNA末端)，應用PCR(聚合酶鏈式反應)分離所需的完全的cDNA。DNA擴增后，將雙鏈DNA插入到pUC18載體中在Ε.coli中增殖。通過藍_白斑篩選假定的重組克隆。通過測序并結合計算機分析鑒定和測定包含所需cDNA的克隆的特征。通過連接子在正和反方向加入所需cDNA片段的適當區域生成正義_反義構建體。將該構建體導入到用于高粱植物轉化的表達載體中，以抑制內源COMT/CCoAOMT基因。載體最好包含具有廣泛宿主范圍的原核復制起點。還應該包含選擇標記，使其能夠篩選具有所需構建體的細菌細胞。合適的原核選擇標記包含對如卡那霉素的抗生素的抗性。眾所周知，在載體中還可以呈現其它編碼附加功能的DNA序列。例如，在農桿菌轉化的情況下，還可以包含用于后續轉移到植物染色體的T-DNA序列。為了在植物中表達，采用在其中可以導入目的基因的雙載體。重組表達盒除了包含所需要的序列外，還將包含植物啟動子區域、轉錄起始點和轉錄終止子序列。典型地包括盒的5’和3’端的特異限制性酶位點，以使得能夠易于插入到先前存在的載體中。本領域技術人員也知曉控制真核基因表達的序列。本發明的啟動子的制備DNA轉錄成mRNA是由被稱為啟動子的DNA區域調控的。啟動子區域包含傳遞信號給RNA聚合酶使其結合DNA、并將其中一條DNA鏈作為模板啟動mRNA的轉錄、形成相應的互補RNA鏈的堿基序列。由于RNA鏈的5’區域與3’區域互補，因此將生成雙鏈RNA，該雙鏈RNA隨后應用產生短的干涉RNA(RNAi)的機制降解。啟動子序列包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常為位于轉錄起始位點上游的20-30個堿基對(bp)(按照慣例，為從相對于轉錄起始點的-30到-20bp)。TATA盒是相對于起始點具有相對固定位置的唯一的上游啟動子元件。CAAT盒共有序列以-75為中心，但在從起始點的相當不固定的距離處從任一方向起作用。另一通常的啟動子元件是位于-90的GC盒，其包含共有序列GGGCGG。其可以以多個拷貝且在任一方向出現。在啟動子區域還可以發現其它賦予最大效率的序列。在啟動子和結構基因組合中，啟動子最好大約位于其與異源轉錄起始點的距離與在其天然背景中的轉錄起始點的距離相同的位置。表達盒中應用的具體的啟動子對本發明來說不是關鍵。在植物細胞中指導轉錄的任意啟動子都是適合的。啟動子可以是組成型或誘導型的。在本發明的研究中應用的玉米泛素啟動子(ubiquitinpromoter)已經顯示在大部分組織中被高度激活和結構性地表達。該玉米泛素啟動子包含在植物中選擇性表達玉米泛素基因的第一內含子。啟動子在Hindlll/BamHI位點克隆到載體中，該位點下放置了C0MT/CC0A0MT反義構建體。在2x35S啟動子下包含選擇標記基因潮霉素磷酸轉移酶，以能夠篩選具有所需構建體的植物細胞。基因構建體的分析A)用于植物轉化的COMT基因的反義盒的限制性分析為了進行限制性分析，從農桿菌克隆中分離重組的DNA。重組DNA的分離方法如下將包含重組質粒的農桿菌克隆接種至5ml的YEP培養基(酵母提取物10g/l，蛋白胨10g/l和氯化鈉5g/l)中，在28°C下孵育36小時。用溶液I(葡萄糖9g/l，Tris3g/l和EDTA3.72g/l)懸浮收集的細胞，并在37°C下用溶菌酶(4mg/ml)處理30分鐘。然后添加溶液II(1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.2NNaOH)。在室溫下孵育30分鐘，添加溶液III(醋酸鉀294.4g/l)，冰浴15分鐘。離心混合物。先用苯酚-氯仿隨后用氯仿-異戊醇處理收集的上清液。通過加入十分之一體積的醋酸鈉和兩倍體積的冷卻乙醇沉淀質粒DNA，在-20°C下保持30分鐘，以IOOOOrpm離心10分鐘。干燥沉淀塊并用TE溶解(1MTRIS和0.5MEDTA)。通過用于產生重組盒的酶的限制性消化分析DNA，消化的片段用分子大小標準參照物檢測(圖1)。B)用于植物轉化的CCoAOMT基因的反義盒的限制性分析方法同上(圖2)。通過PCR鑒定基因組中的反義-COMT應用整個基因組DNA來鑒定基因組中反義-COMT基因的存在。對于PCR，正向引物從啟動子的1393bp處設計，反向引物從基因的5’區域制得。整個擴增區域為1.2kb(0.4kb的啟動子區域和0.Skb的用于反義構建體的基因片段)(圖5)。在轉化子中用于反義COMT基因的PCR篩選的引物序列正向弓丨物5，gaattctgtttcaaactacctggtgg3，J^向弓L5'gaattcatggggtcgacggcggaggacgtg3，。通過PCR鑒定基因組中的反義-CCoAOMT應用整個基因組的DNA鑒定基因組中的反義-CCoAOMT基因的存在。對于PCR，正向引物從啟動子的1393bp處設計，反向引物從基因的5’區域制得。整個擴增區域為0.89kb(大約0.4kb的啟動子區域和大約0.49kb的用于反義構建體的基因片段)(圖6)。在轉化子中用于反義CCoAOMT基因的PCR篩選的引物序列正向弓丨物5，gaattctgtttcaaactacctggtgg3，反向弓丨物5，gaattcatggggtcgacggcggaggacgtg3，從苯4外棺體轉化甜高粱(Sorghumbicolor,)用滅菌蒸餾水洗滌用吐溫20(5分鐘)和0.2%的氯化汞(7分鐘)滅過菌的種子表面。然后將種子在培養皿中的浸有滅菌蒸餾水的滅菌過濾紙上孵育。黑暗中孵育3天后，切離生成的莖尖并用其中具有農桿菌懸浮液的感染培養基感染20分鐘。在共培養基上孵育外植體，并于25°C在黑暗中保持3天。間或用頭孢噻肟酸(cefotaxime)和蒸餾水洗滌外植體，以防止細菌污染，并將其轉移到具有2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、30gm/l的蔗糖和250mg/l的頭孢噻肟酸的MS上，黑暗中保持12天，以生成愈傷組織。切離在莖尖的切口末端的愈傷組織部分，并將其轉移到具有潮霉素篩選的再生培養基(具有30g/l的蔗糖，2mg/l的BAP和2mg/l的潮霉素的MS)上，保持在28°C的21的光照/黑暗周期條件下。2周后，將綠色的愈傷組織轉移到含有更高濃度的選擇標記(4mg/l的潮霉素)的相同培養基上。將獲得的芽轉移到具有更高濃度的潮霉素(5mg/l)的相同培養基上2個月，每2周定期傳代培養。使伸長的芽生長于生根培養基上以生成根。最后在1/2MS液體培養基上用6mg/l的潮霉素篩選成苗。由單一愈傷組織生成的苗被稱為單系。農桿菌介導的轉化本發明的農桿菌介導的轉化方法可以分為若干個步驟。基本的步驟包括感染步驟；共培養步驟；可選擇的休眠步驟(restingstep)；篩選步驟；及再生步驟。在感染步驟中，分離待轉化的細胞，并使其接觸農桿菌。如果靶細胞是未成熟的胚，分離胚，并使其接觸農桿菌的懸浮液。如上所述，農桿菌已被改造為包含目的基因或目的核苷酸。該核苷酸插入到載體的T-DNA區域內。本發明中應用的一般的分子技術由例如Sambrook等(eds.)的分子克隆實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室雜志，冷泉港(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)提供。在感染步驟和共培養步驟中使用的農桿菌的濃度可以影響轉化頻率。同樣地，非常高濃度的農桿菌會損傷待轉化的組織，例如未成熟的胚，并導致愈傷組織的反應降低。因此，本發明的方法中使用的農桿菌的濃度可以隨著應用的農桿菌的菌株、轉化的組織、轉化的高粱的基因型等而變化。為了優化特定的高粱系或組織的轉化程序，待轉化的組織(例如未成熟的胚)可以用各種濃度的農桿菌孵育。同樣地，可以用標記基因表達和轉化的程度評測各種農桿菌的濃度。盡管農桿菌的濃度可以變化，本發明中應用的農桿菌，一般地0D600nm為0.7到1.O。為了優化轉化效率，一般將待轉化的組織加入到包含某一濃度的農桿菌且為液態接觸相的農桿菌懸浮液中。接觸相有利于待轉化的細胞/組織與農桿菌懸浮液的最大接觸。細胞與農桿菌懸浮液接觸的時間為至少約3分鐘到約15分鐘，較佳地為約4分鐘到約10分鐘，最好為約5分鐘到約8分鐘。感染步驟的液體接觸相是在液體溶液MS培養基中加入68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，ΙΟΟμΜ乙酰丁香酮(aCet0Syring0ne)，pH調整為5.2形成的。本發明應用的其它培養基為共培養培養基(MS中加入20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，2mg/l2，4-D，100μM乙酰丁香酮和8.5g/l瓊脂，ρΗ5.8)、細菌培養培養基(YEP培養基-酵母提取物-10g/l，蛋白胨-IOg/1和氯化鈉_5g/l)、感染培養基(MS中加入68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖和100μM乙酰丁香酮，ρΗ5.2)、再生培養基(MS中加入30g/l蔗糖，2mg/lBAPand8.5g/l瓊脂)和生根培養基(1/2MS中加入20g/l蔗糖，0.5mg/lIAA和0.5mg/lNAA)。感染期間農桿菌的濃度農桿菌的O.D.-在0.7-1.0之間后續的共培養步驟，或休眠步驟中(如果應用的話)，將已轉化的細胞接受選擇壓力以篩選那些已經接收到并正表達由農桿菌導入的來自異源核苷酸的多肽的細胞。細胞為胚的情況下，將胚轉移到具有固態培養基的平板上，該固態培養基包括抑制農桿菌生長的抗生素及篩選劑。用于篩選轉化子的篩選劑將選擇用于包含至少一個位于超級雙元載體(superbinaryvector)內并通過農桿菌導入的可選擇的標記插入的外植體的擇優生長。一般地，所屬
技術領域：
公知的任何一種適于培養高粱的培養基都可應用于篩選步驟，例如包含懸浮有30g/l蔗糖，2mg/l2，4-D的N6鹽或MS鹽的培養基，黑暗中保持15天。篩選期間，培養胚，直到觀察到愈傷組織形成。典型地，在選擇培養基上生長的愈傷組織能夠生長到直徑約為1.5到2cm大小。愈傷組織達到合適大小后，在再生培養基上在黑暗中培養愈傷組織數周，一般地為約1到3周，以使體細胞胚成熟。優選的再生培養基包括包含懸浮有30g/l蔗糖，2mg/lBAP和8.5g/l瓊脂的MS培養基。然后在生根培養基上培養愈傷組織，在光照/黑暗循環中培養，直到芽和根生長。然后將小苗轉移到包含生根培養基的管子中大約又一周，使其生長和發育更多根。然后將植物移植到溫室中的罐中的土壤混合物中。應用的外植體切自發芽的種子的頂端分生組織的切塊來自苯尖外棺體的高粱的轉化稈序用滅菌蒸餾水洗滌用吐溫20(5分鐘)和0.2%的氯化汞(7分鐘)滅過菌的種子表面。然后將種子在培養皿中的浸有滅菌蒸餾水的滅菌過濾紙上孵育。在黑暗中孵育3天后，切離生成的莖尖并用其中具有農桿菌懸浮液的感染培養基感染20分鐘。在共培養基上孵育外植體并于25°C在黑暗中保持3天。間或用頭孢噻肟酸(cefotaxime)和蒸餾水洗滌外植體，以防止細菌污染，并將其轉移到具有2mg/l的2，4-D、30gm/l的蔗糖和250mg/l的頭孢噻肟酸的MS上，在黑暗中保持12天，以形成愈傷組織。切離在莖尖的切口末端的愈傷組織部分，并將其轉移到具有潮霉素篩選的再生培養基(具有30g/l的蔗糖、2mg/l的BAP和2mg/l的潮霉素的MS)上，保持在28°C的21的光照/黑暗周期條件下。2周后，將綠色的愈傷組織轉移到含有更高濃度的選擇標記(4mg/l的潮霉素)的相同培養基上。將獲得的芽轉移到具有更高濃度的潮霉素(5mg/l)的相同培養基上2個月，每2周定期傳代培養。使伸長的芽生長于生根培養基上以生成根。最后在1/2MS液體培養基上用6mg/l的潮霉素篩選成苗。由單一愈傷組織生成的苗稱為單系。MiSA-O-甲某轉(CCoAoMT)的_法測丨定方法收集對照的愈傷組織和轉化的愈傷組織，并在液氮中混勻。在4°C在提取緩沖液(IOOmMTris-HCl,pH7.5，10%甘油，2mMDTT，0.2mMMgCl2，ImM苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride))中提取粉狀的組織1小時，在G-50柱上脫鹽。應用以BSA為標準品的Bradford法測定蛋白質的濃度。將包含5μ1的[14CH3]-S-adenosyl-L-Met，5μ1的咖啡酸(ImM)或咖啡酰CoA(ImM)，30μ1的測定緩沖液(IOOmMTris-HCl,pH7.5，10%甘油，2mMDTT，0.2mMMgCl2)的測定混合物和蛋白提取物在30°C孵育30分鐘。在COMT和CCoAOMT的情況下，通過分別加入50μ1的0.2ΜHCl和10μ1的3MNaOH終止反應。混合物在37°C保持10分鐘后，用40μ1的IMHCl酸化CCoAOMT混合物。用200μ1的正己烷(hexane)乙酸乙酯(ethylacetate)(11，ν/ν)提取標注的阿魏酸(Labeledferulicacid)。將分離的有機相轉移到閃爍計數瓶并測定放射性。結果測定每個轉化系的五個轉化的愈傷組織的酶活性，以驗證反義策略作為初步研究的作用。結果顯示，盡管發現在多數情況下活性的改變不明顯，但某些愈傷組織響應明顯(通過星號指示)。但是，結果已經證實采用的用于下調表達水平的策略是有效的。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>G和S木質素的估算方法在Lapierreetal.(1986)的硫代酸解法(thioacidolysis)和蘭尼鎳脫硫(Raneynickeldesulfurization)法條件下測定已轉化和未轉化植物的木質素組分。利用約20mg的細胞壁殘漁與15ml的0.2M三氯化鵬(borontrifluoride)和乙醚(etherate)在8.751的二氧雜環乙烷/乙硫醇混合物(dioxane/ethanethiolmixture)反應進行硫代酸解。將二氯甲烷中等份的硫代酸解溶液與Iml蘭尼鎳水漿混合以脫硫。通過氣相色譜-質譜測定如木質素的三甲基硅基衍生物(trimethylsilylderivatives)的木質素衍生的單體的組分。結果樣品GS(μπιο/g干重)(μπιο/g干重)A.對照(非轉化系)1.對照14403752.對照23954003.對照3410396B.pfiX_e°mt轉化系1.COMTl4403602.COMT23904153.COMT33812624.COMT6460400C.pSX—e°mt轉化系1.ccoaomt13153652.CCoAOMT24214053.CCoAOMT5375452D.ρsk。mt_ee。a()mt轉化系1.COMT-CCoAOMT13073122.COMT-CCoAOMT3375397甜高粱中的G和S木質素組分的含量發現20天的老野生甜高粱植物的莖稈中的G和S木質素的平均含量分別為415μmol/g干燥樣品和390μmol/g干燥樣品。平均的紫丁香基木質素/愈創木基木質素比(S/G比)約為0.94。在轉化系COMT中觀察到總木質素減少。盡管在轉化系為COMT的情況下觀察到S/G比降到0.7，但是，在轉化系為CCoAOMT的情況下觀察到S/G比增加到1.2。結果顯示，雙鏈反義介導的CCoAOMT下調適于具有改變的木質素含量和組分的甜高粱植物的繁殖。本發明中包含的培養基組分共培養培養基MS+20g/l蔗糖+10g/l葡萄糖+2mg/l2，4-D+100μM乙酰丁香酮+8.5g/l瓊脂，pH5.8細菌培養培養基YEP培養基-gm/公升酵母提取物-IOg蛋白胨-IOg[oho]氯化鈉-Sg感染培養基具有68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖和10(^11乙酰丁香酮的1^，？!15.2再生培養基具有30g/l蔗糖，2mg/lBAP和8.5g/l瓊脂的MS牛根培養基具有20g/l蔗糖，0.5mg/lIAA和0.5mg/lNAA的1/2MS在感染期間的農桿菌的濃度農桿菌的O.D.-在0.7-1.0之間愈傷纟目織感染的條件愈傷組織在具有30g/l蔗糖，2mg/l2，4_D的MS中生長，在黑暗中保持15天。權利要求由SEQIDNO2所示的分離的編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAoMT)的DNA序列。2.根據權利要求1所述的分離的DNA，其特征在于所述DNA是cDNA。3.根據權利要求1所述的分離的DNA，其特征在于所述DNA是從甜高粱(高粱)中分離的。4.包含由SEQIDNO2所示的第一外源核苷酸的構建體，所述核苷酸可操作地連接到啟動子，其中第一核苷酸在反義方向上，并與至少一部分CCoAOMT基因反義，所述構建體可選擇地包含由SEQIDNO1所示的與編碼咖啡酸0-甲基轉移酶(COMT)的核苷酸序列反義的第二核苷酸。5.包含權利要求4所述的反義構建體的宿主細胞。6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞是根癌農桿菌。7.根據權利要求4所述的構建體，其特征在于，所述構建體在植物細胞中的表達導致植物中木質素含量和組分的改變。8.根據權利要求7所述的構建體，其特征在于，改變的木質素組分的特征是，與野生型植物的紫丁香基木質素/愈創木基木質素比(S/G比)相比，具有改變的紫丁香基木質素/愈創木基木質素比。9.根據權利要求8所述的構建體，其特征在于在轉化的植物中S/G比是1.2。10.根據權利要求4所述的構建體，其特征在于第一外源核苷酸包含“反義”于至少一部分CCoAOMT基因的“反義”核苷酸序列。11.根據權利要求10所述的構建體，其特征在于第一外源核苷酸包含與至少一部分內源CCoAOMTRNA的核苷酸序列互補的核苷酸序列。12.根據權利要求11所述的構建體，其特征在于所述內源RNA是前體RNA或mRNA。13.根據權利要求4所述構建體，其特征在于第二外源核苷酸包含與至少一部分內源COMTRNA的核苷酸序列互補的核苷酸序列。14.根據權利要求11和13所述的反義構建體，其特征在于內源RNA是前體RNA或mRNA。15.一種制備具有改變的木質素含量和組分的轉基因植物的方法，所述方法包含a.用第一和可選擇地用第二外源核苷酸轉染植物細胞，以生成基因工程細胞，所述核苷酸與基因工程植物中的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAoMT)和咖啡酸0-甲基轉移酶(COMT)的活性與在野生植物中的CCoAoMT和COMT的活性相比發生改變相關；及b.使植物細胞在與野生型植物相比具有改變的木質素含量的轉基因植物中生長。16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于用包含第一外源核苷酸的載體轉染植物細胞，以生成基因工程植物細胞，該第一外源核苷酸包含與CCoAOMT基因“反義”的第一核苷酸序列，并可選擇地包含與COMT反義的第二外源核苷酸序列。17.根據權利要求15所述的方法，其特征在于第一外源核苷酸的表達引起轉基因植物細胞產生第一“反義”RNA轉錄，該第一外源核苷酸具有與至少一部分內源CCoAOMTRNA互補的核苷酸序列。18.根據權利要求15所述的方法，其特征在于第二外源核苷酸與COMT活性的降低相關。19.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，與野生植物的紫丁香基木質素/愈創木基木質素比相比，基因工程植物的改變的木質素含量和組分具有增加的紫丁香基木質素/愈創木基木質素比。20.根據權利要求15所述的方法，其特征在于紫丁香基木質素/愈創木基木質素比為1.2。21.分別由SEQIDNO3和4所示的用于擴增CCoAOMT的正向和反向引物。22.包含權利要求4所述的構建體的載體。23.根據權利要求22所述的載體，其特征在于應用的載體是PUC18載體。全文摘要本發明提供了一種與野生植物相比具有改變的木質素含量和/或改變的木質素組分的甜高粱，其通過包含SEQIDNO2所示的和可選擇地包含SEQIDNO1所示的分離的DNA序列的構建體的整合，通過在甜高粱中具體操縱咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAoMT)的表達和可選擇地操縱咖啡酸O-甲基轉移酶(COMT)的表達獲得。文檔編號A01H5/00GK101802181SQ200880012082公開日2010年8月11日申請日期2008年2月20日優先權日2007年2月21日發明者埃斯蒂塔瓦·巴素,巴尼布瑞塔·班迪,蘇米特拉·庫瑪爾·孫,莫利奈·庫瑪爾·麥提,薩塔若帕·卡爾申請人:納佳遒納能源私人有限公司