專利名稱：淡水蘆葦非愈傷組織培養方法
淡水蘆葦非愈傷組織培養方法
一、 技術領域 本發明屬于植物組織培養技術領域。
二背景技術：
蘆葦(P/ ragw"ey"MWmfe)自然種群多發生在淺水性濕地，常見于池沼、河流沿岸、灘 涂、河溪邊多水地區。蘆葦作為經濟作物，葦稈可用于造紙和人造絲、編制蘆席、草墊；生 長期的蘆葦含大量的蛋白質和糖分，為優良飼料；蘆葦的葉、花、莖、根、筍均可入藥。同 時，蘆葦具有重要的生態功能，保土固堤，消浪緩流，促淤防蝕等；近年來，蘆葦耐污、去 污，改善富營養化水質的能力備受重視，在湖濱帶、河流坡岸與沼澤濕地恢復與重建中，蘆 葦成為了必選植物，被大面積種植。隨著我國生態環境建設、水環境綜合治理和濕地恢復工 程的大量實施，蘆葦的種苗與種源需求會愈來愈緊迫，而當前的技術將難以滿足日益高漲的 市場需要；因此，發明一種能夠快速提供優質蘆葦種苗的方法是必然的需要。
經中國專利網與相關論文網站檢索，發現目前已有一些關于盧葦組織培養的報道，如吳 國良等在《蘆葦胚性愈傷組織的形成及植株的再生》中用種子通過愈傷培養獲得完整植株， 但愈傷的周期較長，過程較復雜；王希友在《戸蘋胚性愈傷組織生長的研究》中只研究了愈 傷組織的生長，并未長出完整植株；郭睿在《耐鹽蘆葦莖節組織體細胞胚發生及植株再生的 研究》中也是通過愈傷組織培養來獲得植株，同樣存在周期較長的問題；另外，在楊印根等 的專利《耐鹽蘆葦的無性繁殖方法》中，也描述了通過愈傷組織培養獲得完整植株的過程， 同樣存在周期較長的問題。
三
發明內容
本發明需要解決的問題是發明一種快速離體繁殖蘆葦的方法，使得短期內可以獲得大 量優質同規格蘆葦苗，滿足濕地恢復與重建工程中的需要，促進環境的恢復。 本發明的技術方案是
(1) 野外選種，選擇駱馬湖長勢高大的蘆葦；
(2) 消毒，將從野外取回的蘆葦莖剪成小段，每段2-3 cm長，在蒸餾水下洗凈，然后 在超凈臺上用70%乙醇浸泡30 s，用蒸餾水涮洗2-3次，其后用0.1 %HgCl2水溶液消毒5 min， 再用無菌蒸餾水洗滌4-5次；
3(3) 將消毒后的蘆葦的帶芽原基的莖段接種到誘導培養基上誘導不定芽，誘導培養基中 添加了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 6-芐基腺嘌呤(BA)和萘乙酸(NAA);溫度為25土2。C、 光強為20001x、每日光照14h;培養7-23d，多數莖段的芽在兩周左右可長到3 cm;
(4) 將產生的不定芽轉移到繼代培養基上進行繼代培養，繼代培養基中添加了PVP、 BA 和NAA;溫度為25土2。C、光強為20001x、每日光照14 h條件下培養11-24 d;
(5) 當芽長到4-5 cm時移到生根培養基上誘根，誘根培養基中添加了 PVP、 IBA和NAA; 溫度為25 土 2'C 、光強為2000 lx、每日光照14 h;
(6) 當試管苗根長至約2 cm時，打開瓶口并加少量蒸餾水煉苗2-3 d，然后將根部瓊脂 洗凈，移入珍珠巖中過渡，3-5d后移入土壤。
各培養階段的培養基配方(激素配比)如下表
各階段的培養基配方
組培階段培養基組成成分
不定芽誘導MS培養基+3%蔗糖+0.43%瓊脂+ BA 6 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 50 mg/L
不定芽繼代MS培養基+30/。蔗糖+0.43%瓊脂+ BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 50 mg/L
植株生根1/2MS培養基+3%蔗糖+0.43%瓊脂+ IB A 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+PVP 50 mg/L
注由亍培養基滅菌后pH會略有下降，所以培養基的pH配制時調至6.1;所有培養基在高壓滅 菌鍋中12rC滅菌20 min，滅菌后的培養基放在超凈臺上1 d后再用，以晾干水膜。
本發明建立了一個快速離體繁殖蘆葦的完整體系，與現有技術相比其有益效果是(1) 通過非愈傷組織培養方法來獲得完整蘆葦組培苗，其過程簡單、周期短，通過外植體長出 完整試管苗只需約35-65 d; (2)誘導率高達92.3%，生根率也高達95.8%; (3)移栽成活 率高，為90.2%; (4)通過添加50 mg/L PVP消除了褐化現象，阻止了褐化對培養過程的 影響；(5)本發明中所用材料取于駱馬湖，植株高大，平均約6 m，可廣泛用于河道濱岸 與湖濱帶恢復。
具體實施例方式
1.外植體消毒
將從野外取回的戸葦莖剪成小段，每段2-3cm長，在蒸餾水下洗凈，然后在超凈臺上用 70%乙醇浸泡30 s，用蒸餾水涮洗2-3次，其后用0.1 %HgCl2水溶液消毒5 min，再用無菌蒸 餾水洗滌4-5次；2. 不定芽的誘導
在超凈臺上，將消毒后的莖段接種到誘導培養基上，即MS培養基+3%蔗糖+0.43%瓊脂 +BA6 mg/L+NAAO.2 mg/L+PVP 50 mg/L，在溫度為25 土 2°C 、光強為2000 lx、每日光照14 h 的條件下培養。培養7-23 d，多數莖段的芽在兩周左右可長到3 cm; BA為6 mg/1時最好， 誘導率高達92.3%。
3. 繼代培養
將誘導出的芽轉移到繼代培養基上，即MS培養基+3。/。蔗糖+0.43。/。瓊脂+BA5 mg/L+NAAO.2 mg/L+PVP 50 mg/L，在溫度為25 土 2°C 、光強為2000 lx、每日光照14 h的條 件下培養11-24 d。
4. 生根培養
將叢狀不定芽分離成單個芽，移到生根培養基上，即1/2MS培養基+3%蔗糖+0.43%瓊脂 +IBA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+PVP50 mg/L，溫度為25 土 2°C 、光強為2000 lx、每日光照14 h 的條件下，培養出完整的再生植株，試管苗生根率達95.8%。
5. 移栽
當試管苗根長至2 cm左右時，打開瓶口并加少量蒸餾水煉苗2-3 d，然后將根部瓊脂洗 凈，移入珍珠巖中過渡，3-5d后移入土壤，存活率達90.2%。
權利要求
1、一種淡水蘆葦非愈傷組織培養方法，其特征在于用生長高大的蘆葦的莖段進行非愈傷組織培養，快速繁殖出完整蘆葦苗，由以下步驟構成(1)將采自野外的蘆葦莖段剪成小段，每段2-3cm長，在蒸餾水下洗凈，然后在超凈臺上用70％乙醇浸泡30s，用蒸餾水涮洗2-3次后用0.1％HgCl2水溶液消毒5min，再用無菌蒸餾水洗滌4-5次；(2)將消毒后的蘆葦莖段接種到誘導培養基上誘導不定芽；誘導培養基為MS培養基+3％蔗糖+0.43％瓊脂+BA6mg/L+NAA0.2mg/L+PVP 50mg/L；溫度為25土2℃、光強為2000lx、每日光照14h；(3)將產生的不定芽轉移到繼代培養基上進行繼代培養；繼代培養基為MS培養基+3％蔗糖+0.43％瓊脂+BA5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP 50mg/L；溫度為25土2℃、光強為2000lx、每日光照14h；(4)在生根培養基上誘根，產生完整組培苗；生根培養基為1/2MS培養基+3％蔗糖+0.43％瓊脂+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+PVP50mg/L；溫度為25土2℃、光強為2000lx、每日光照14h；(5)當試管苗根長約2cm時，打開瓶口并加少量蒸餾水煉苗2-3d，然后將根部瓊脂洗凈，移入珍珠巖中過渡，3-5d后移入土壤。
2、 根據權利要求1所述淡水蘆葦非愈傷組織培養方法，其特征在于所有培養基的pH配制時 調至6.1;所有培養基在高壓滅菌鍋中12rC滅菌20 min，滅菌后的培養基放在超凈臺上1 d 后再用，以晾干水膜。
全文摘要
本發明屬于植物組織培養技術領域。運用蘆葦的莖段，建立一種通過非愈傷組織培養的快速離體繁殖方法，獲得完整優質蘆葦植株。其過程簡單、繁殖周期短，并且誘導率高達92.3％，移栽成活率也很高，達90.2％。通過此方法能夠快速提供優質蘆葦種苗，滿足日益高漲的市場需要，發揮其在生態環境建設、水環境綜合治理和濕地恢復工程方面的作用。
文檔編號A01H4/00GK101491213SQ20091002566
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月5日 優先權日2009年3月5日
發明者孫一香, 孫利芳, 安樹青, 瑤 莊, 華 清, 陸霞梅 申請人:南京大學