來自海洋的鏈霉菌的分離培養方法及其用途的制作方法

專利名稱：：來自海洋的鏈霉菌的分離培養方法及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種菌種的培養方法，特別是一種來自海洋的鏈霉菌BM-2的分離培養方法；本發明還涉及鏈霉菌BM-2的用途。
背景技術：
：許多放線菌的次生代謝產物具有醫藥和植物保護方面的用途，已廣泛用作抗細菌、抗真菌和抗腫瘤藥物，現在已發現的數萬種微生物來源的生物活性物質中，約有70%是由放線菌所合成的。目前分離得到的絕大多數放線菌都來源于土壤，陸生放線菌產生的抗生素占天然來源抗生素的三分之二以上，然而隨著病原微生物對抗生素抗性的日益提高，尋找具有新型作用機制的抗生素已迫在眉睫。近20年來，從陸生放線菌中分離得到的先導化合物的數量銳減，于是人們把目光投向了更為廣闊的生境-海洋。海洋放線菌的生活環境十分特殊，如高鹽度，高壓，低營養，低溫及與不同生物之間的關系等。在這些所謂生命的極限環境中，海洋放線菌已發展出獨特的代謝方式，這不僅確保其在極端環境中生存，也提供了產生新穎抗生素的潛力。因此，海洋環境將成為放線菌和放線菌代謝產物的重要新來源。雖然海洋放線菌不是海洋微生物生態系統中的主要組成部分，但越來越多的研究結果顯示，其代謝產物具有獨特性。來自國際著名的海洋天然產物研究機構加州大學的W.Fenical教授于2001年6月在日本舉行的第10次國際海洋天4然產物研討會上報道了他們的最新發現:他們首次發現并成功培養了一屬海洋放線菌，命名為Mw/mw/om.，這種菌只能在有鹽的條件下生長，具有獨特的16SrRNA序列。對100株這種菌進行了抗菌及抗腫瘤活性篩選試驗，結果有80%的發酵液抽提物顯示出明顯的抗菌和抗腫瘤活性。對其中一株菌發酵液進行化學研究，從中分離純化出一系列結構新穎的化合物，命名為Salinosporamides，這些化合物具有很強的抗癌活性。許多放線菌的次生代謝產物具有醫藥和植物保護方面的用途，己廣泛用作抗細菌、抗真菌和抗腫瘤藥物。據不完全統計，目前關于海洋放線菌活性物質的研究已經引起人們的重視，從海洋環境中分離得到了多種產生新活性物質的海洋放線菌，并對得到的菌株的發酵條件、生物活性以及活性物質的.分離鑒定進行了研究，取得了可喜的成果，但己有的研究主要集中在醫藥的開發上，而海洋放線菌對植物病原真菌的抗菌物質研究還剛剛起步，從海洋環境中尋找具有新的抗菌機制的海洋放線菌應用于植物病害的生物防治對于開發高效環保新型農藥具有重要意義。
發明內容本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種對多種植物病原真菌有強抗菌作用的鏈霉菌BM-2(&印tomK"sp.BM-2)的分離培養方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種來自海洋的鏈霉菌BM-2(&reptomyc"sp.BM-2)的分離培養方法，其特點是，其步驟如下(1)富集培養從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養液中，190r/min，25。C條件下搖床培養5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養5天的培養液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10—i的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續稀釋，分別制備成10—2、10-3、10-4、10-5、l(T、10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、10—6和10—7的樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏l號培養基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25'C的培養箱中培養，長出菌落；再分別挑取海水高氏l號培養基平板上的菌落，用三區劃線的方法接種到海水高氏l號培養基平板上，置于25i:培養箱中培養，反復劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個純化的菌株分別轉接到海水高氏l號培養基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對峙培養法，以供試的植物病原真菌小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌為受試菌，分別測定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時在PDA培養基平板中央接種培養5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養皿壁15mm處對稱劃線接種分離純化得到的不同菌株，25"C倒置恒溫培養，觀察植物病原真菌菌落生長狀況，培養5d后測量抑菌帶寬度；每個菌株為一處理，每處理重復3次；選取一株對前述2種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株；(4)菌株的鑒定將BM-2菌株于25"C下培養5天，觀察記錄菌落和細胞形態，同時進行生理生化試驗，并進行16SrDNA測序分析；根據形態學和生理生化試驗結果初步認為菌株BM-2屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5^e/tom_yc"sp.，二者的16SrDNA序列相似性為99%，BM-2菌株為鏈霉菌(5^印tomyce!rsp.)。以上所述的來自海洋的鏈霉菌BM-2sp.BM-2)的分離培養方法技術方案中，所述的鏈霉菌BM-2菌株的優化發酵條件為最適培養基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發酵條件為接種量7%，裝瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，搖床轉速190r/min，最適溫度28""C，培養時間5d。本發明中所涉及的生物材料"鏈霉菌BM-2(6^印to附yc"sp.BM-2)"菌株己于2009年2月4日在Genebank公開(登錄號為FJ595715，網址為(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db二nuccore&id=222145980)。該菌株為公知公用材料，在該專利申請日期起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外提供。本發明所述的鏈霉菌BM-2(5Vreptom_yc"sp.BM-2)具備抑制多種植物病原真菌的用途。以下是發明人所做的鏈霉菌BM-2(&reptom少c"sp.BM-2)菌株(以下簡稱BM-2菌株)的相關試驗。1、分離篩選試驗。1.1培養基(1)富集培養基酵母膏5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaC15g、陳海水1000mL，pH7.5-8.0。(2)海水高氏l號培養基可溶性淀粉20g，KN03lg，氯化鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，MgS04*7H200.5g，FeS04'H20O.Olg，瓊脂20g，海水1000mL，pH7.27,4。(3)PDA培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g,水1000mL，pH自然。1.2供試病原菌玉米小斑病菌(丑—/鎖.a附ay血)、玉米圓斑病菌(//e/脂'w^7aspor/wmcar6owM附)、小麥赤霉病菌(F"S(3r/wmgra附/"earww)、棉花豐古萎病菌(Fwjan.wwo平/or簡f.sp.vasinfectum)、小麥雪腐鐮刀病菌(Fwsa"'簡m.va/e)、斑點落葉病菌(茲m7fl〃'aa/femato)、小麥根腐病菌(5—/腦i5WY^:/m'""a)、細鏈格孢病菌"/ter""n'flfe"w&)、番茄早疫病菌(J/ter"an'aso/a"/)共9禾中，由中國農科院所植保所提供，淮海工學院海洋微生物實驗室保存。1.3分離方法(1)富集培養從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養液中，190r/min，25"C條件下搖床培養5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養5天的培養液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10—'的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續稀釋，分別制備成10—2、10—3、10"、10,10,10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、1(T和l(T7的樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏l號培養基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25。C的培養箱中培養，長出菌落；再分別挑取海水高氏l號培養基平板上的菌落，用三區劃線的方法接種到海水高氏l號培養基平板上，置于25'C培養箱中培養，反復劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個純化的菌株分別轉接到海水高氏l號培養基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對峙培養法，以供試的上述9種植物病原真菌(包括小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌)為受試菌，分別測定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時在PDA培養基平板中央接種培養5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養皿壁15mm處對稱劃線接種分離純化得到的不同菌株，25。C倒置恒溫培養，觀察植物病原真菌菌落生長狀況，培養5d后測量抑菌帶寬度；每個菌株為一處理，每處理重復3次；選取一株對前述小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株。篩選試驗的具體結果如下上述步驟(2)分離純化得到的若干個菌株中有7株對上述9種植物病原真菌有較強的抑制作用，見表l。其中BM-2菌株的抑菌作用最強，其對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，對棉花枯萎病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用最強，抑菌帶寬度分別達到了18.0mm和16.5mm，對番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、玉米圓斑病菌的抑菌帶寬度都達到了10mm以上。表17菌林對9種病原真菌的抑制作用(ran)供試病原菌BM-2T-6XS-X5-3菌抹號D-3T-l-lMH-7XL-7小麥赤霉病菌16.50.08.07.00.00.07.5小麥根腐病菌5.53.03.54.02.03.02.0玉米圓斑病菌10.03.05.07.00.00.01.0番茄早疫病菌11.53.07.04.51.53.04.0棉花枯萎病菌18.00.00.011.50.05.06.0斑點落葉病菌9.54.54.04.00.02.03.5小麥雪腐鐮刀病菌9.00.00.06.00.04.00.0玉米小斑病菌10.59.01.55.50.03.56.092、BM-2菌株的鑒定試驗。2.1培養基鑒定試驗中所涉及的高氏1號培養基、PDA培養基、察氏瓊脂培養基、無機鹽淀粉培養基、燕麥片瓊脂培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基、瓦氏肉汁瓊脂培養基、明膠培養基、淀粉培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基、蛋白胨水培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基、醋酸鉛培養基、尿素培養基、油脂培養基、糖醇發酵培養基、石蕊牛奶培養基和苯丙氨酸培養基均為常規培養基，但在配制時用相應量的海水替換水。2.2形態特征及培養特征觀察2.2.1形態特征觀察采用扦片法。在高氏I號瓊脂培養基平板上劃線接種BM-2菌株，將滅菌的蓋玻片以大約45。角扦入瓊脂內(扦在接種線上)，將扦片平板28"C下倒置培養，根據觀察的目的，分別在培養3d、5d、7d時，用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養物，將有菌的一面朝上放在載玻片上，直接鏡檢蓋玻片上BM-2菌株的形態特征。取扦片及印片經光學顯微鏡觀察，結果顯示該菌的基內菌絲和氣生菌絲均生長旺盛，分枝多；孢子絲為直線形和波曲形，無輪生。孢子絲成熟后形成的孢子鏈成串珠狀。2.2.2培養特征觀察主要觀察孢子、氣生菌絲體、基內菌絲體的顏色和可溶性色素的有無。將BM-2菌株分別接種在高氏I號瓊脂培養基、馬鈴薯培養基、察氏瓊脂培養基、無機鹽淀粉培養基、燕麥片瓊脂培養基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養基、瓦氏10肉汁瓊脂培養基上，28。C培養715d，觀察記錄菌株在各種培養基上孢子、氣生菌絲、基內菌絲體的顏色以及可溶性色素是否產生等特征。結果菌株BM-2在高氏I號、瓦氏肉汁、葡萄糖天門冬素、無機鹽淀粉等瓊脂培養基上生長良好，在馬鈴薯培養基上長勢較差。在不同的培養基上氣生菌絲的顏色變化不大，基內菌絲顏色變化較大，無可溶性色素產生。結果見表2。表2BM-2菌株的培養特征<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>"++++":生長良好；"+++":生長一般；"+":生長差。2.3生理生化試驗生理生化試驗包括明膠液化試驗、淀粉水解試驗、纖維素分解試驗、油脂水解試驗、尿素酶試驗、石蕊牛奶試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、檸檬酸鹽試驗、過氧化氫酶試驗、糖醇發酵試驗、氨基酸脫羧酶試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗和葡萄糖的氧化發酵試驗等多項試驗。生理生化試驗結果見表3。__表3BM-2菌林的生理生化特性_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>糖醇發酵試驗結果，綜合見表4。糖醇發酵試驗中產酸呈陽性的說明待測菌能分解該糖或醇產生酸因而使指示劑溴甲酚紫顯現出黃色，糖醇發酵試驗產酸呈陰性的說明待測菌不能分解該糖醇產生酸因而不使指示劑顯現黃色；糖醇發酵試驗產氣呈陽性說明待測菌能分解該糖或醇產生氣體。表4BM-2菌株糖醇發酵試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>麥芽糖+-乳糖++蔗糖++甘露糖++D-果糖+-棉子糖_-D-木糖+_L-鼠李糖+-纖維二糖+-甘露醇+-肌醇-+D-山梨醇+-根據形態、培養特征觀察及生理生化試驗結果，査閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》第九版和《鏈霉菌鑒定手冊》，BM-2菌株符合鏈霉菌科鏈霉菌屬的特征。2.4BM-2菌株16SrDNA基因的序列分析2.4.1BM-2菌株液體培養BM-2菌株經斜面活化后，將孢子用無菌水洗下制成孢子懸液，濃度約為1(^個/mL，接種于液體海水高氏1號培養基(250mL三角瓶裝液量30mL)，28°C180卬m搖床培養3d。2.4.2DNA的提取采用CTAB裂解法。2.4.3PCR擴增擴增引物序列為fDl:16SF:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'rDl:16SR:5'-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3'由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。按表5反應體系和條件進行擴增表5PCR擴增體系(25fU體系)試劑含量(P1)dNTP(10mMeach)0.510xbuffer2.5Mg2+(20mM)2.5引物1(25jiM)0.5引物2(25jiM)0.5模板DNA1.0Taq酶(5U/y1)0.3ddH2017.2擴增條件為95"C預變性5min;94。C變性lmin，65。C退火lmin，72。C延伸3min，3個循環；94。C變性lmin，63。C退火lmin，72。C延伸3min，3個循環；94。C變性lmin，61。C退火lmin，72"延伸3min，3個循環;94。C變性lmin，59。C退火lmin，72"C延伸3min，3個循環；94。C變性lmin，57。C退火lmin，72。C延伸3min，3個循環；94。C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸3min，3個循環；94。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸3min，20個循環；72'C再次延伸10min;4'C永久保存。2.4.4PCR擴增產物的檢測及其序列測定采用LO^瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。點樣量為5)al。將擴增出的PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測得序列已于2009年2月4日在Genebank公開(登錄號為FJ595715)。在GenBank中對所得序列進行BLAST分析，BM-2菌株的16SrDNA基因序列與5^印tomyc"sp.(FJ001761)同源性達99%。結合形態學觀察和生理生化測定結果，認為BM-2菌株屬于鏈霉菌(S^e/tom_ycassp.)3、BM-2菌株抑菌試驗。3.1無菌發酵液對病原真菌菌絲生長的抑制作用(1)無菌發酵液的制備。將BM-2菌株接種到海水高氏1號培養基斜面上，培養4d，用5mL無菌海水沖洗下菌體，接種到裝有50mL液體海水高氏1號培養基的250mL三角瓶內，25°C，190r/min振蕩培養5d，培養液于4。C，5000r/min離心10min，去除菌體，上清液用直徑0.22fim的細菌過濾器過濾，得到無菌發酵液。(2)無菌發酵液對9種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用測定。在PDA培養基平板中央接種直徑為5mm的受試植物病原真菌菌苔，距皿邊緣15mm處，對稱打直徑為5mm的孔，三個孔內滴200^UBM-2菌株的無菌發酵液，另一孔作為對照，內滴等量的液體海水高氏1號培養基，25"C恒溫培養5d后，觀察受試植物病原真菌的菌落生長狀況，測量抑菌帶寬度。重復3次。BM-2菌株的發酵液的抑菌范圍廣，抗菌作用強，對所有供試病原真菌都具有較強的抑制作用，其中對小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的抑菌帶寬度分別達到了25.1mm和20mm，表現出了良好的應用前景。表6BM-2菌株無菌發酵液對病原真菌的抑制作用供試病原菌抑菌帶寬度(mm)小麥赤霉病菌25.1小麥根腐病菌6.5玉米圓斑病菌14.0番茄早疫病菌11.5棉花枯萎病菌20.0斑點落葉病菌10.5雪腐鐮刀病菌10.0玉米小斑病菌12.5細鏈格孢菌10.53.2無菌發酵液對細鏈格孢菌分生孢子萌發的影響(1)細鏈格孢菌分生孢子懸浮液的制備。將培養7d的細鏈格孢菌用無菌水洗下孢子，用4層紗布過濾去除菌絲，濾液在室溫下3500r/min離心5min，沉淀為孢子，用BM-2菌株的無菌發酵液配制成濃度為1()S個孢子/mL的孢子懸浮液，以液體海水高氏l號培養基為對照。(2)孢子萌發率的測定。取0.1ml孢子懸浮液涂布在無菌玻片上，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿內，25。C下黑暗恒溫培養，分別于l、2、3、4、5、6h觀察孢子萌發情況，計算孢子萌發率，測量芽管長度。如6h對照的孢子萌發率低于90%，則繼續定時觀察，同時觀察無菌發酵液對病原真菌孢子及芽管的破壞作用。孢子萌發率(％)=孢子萌發數/調查孢子總數BM-2菌株的發酵液對細鏈格孢菌的分生孢子的萌發有一定的抑制作用，處理后的孢子萌發率降低，芽管伸長緩慢。BM-2菌株的發酵液對孢子萌發的抑制作用強，處理后的孢子萌發率明顯降低，6h孢子萌發率僅為30%，芽管生長慢，6h芽管長度為140um，而對照的萌發率高，6h孢子萌發率達到96%,芽管生長速度快，6h芽管長度達到了280um。顯微觀察結果表明處理孢子的原生質濃縮，細胞壁變薄，芽管生長較慢。隨著處理時間的延長，處理孢子的芽管開始畸形，出現扭曲，粗短，孢子體形異常，甚至串珠狀膨大。而對照組的芽管細長，分枝多，很少有泡囊出現。3.3無菌發酵液對5種細菌的抑菌作用(1)5種細菌大腸桿菌(五sc/zen'c/n'aco/0、枯草芽孢桿菌CBac///2^s由z'fe)、金黃色葡萄球菌(5"啤/z盧"occt^awrg—、嗜水氣單胞菌(爿er纖o"os/^(irap/zz7a)、耳卩爾森菌(7erw'm'asp.)。大腸桿菌(五"/zen'c/z/aco//)、枯草芽孢桿菌CSac"/ussw6"fc)、金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcusawews)用牛肉膏蛋白胨培養基培養。嗜水氣單胞菌(^erawo"oy/^Jrap/n'/a)、耶爾森菌(F簡'w'flsp.)用2216E培養基培養。(2)培養基牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏0.3g、蛋白胨l.Og、氯化鈉0.5g、瓊脂20g，水1000mL。2216E培養基蛋白胨5g、酵母膏lg、瓊脂20g、陳海水1000mL，pH8.0。(3)BM-2菌株發酵液對5種細菌的抑菌作用測定方法。采用打孔擴散法。將在細菌培養基斜面上培養24h的5種細菌用0.85%的無菌生理鹽水洗下，制備成濃度為5X106個/mL菌懸液，取0.2mL菌懸液滴在平板培養基表面中央，用無菌涂布棒平涂布均勻。用直徑5mm的打孔器在距離培養皿邊緣1.5cm處的含菌平板四周打孔，每孔分別注入BM-2菌株的發酵液50yL，以等量的無菌海水高氏1號液體培養基為對照。2『C培養箱中恒溫，培養24h后觀察測定抑菌圈直徑，結果見表7。表7BM-2菌林發酵液對細菌的抑菌作用測定結果枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌嗜水氣單胞菌17耶爾森菌_^_從表7可以看出，BM-2菌株發酵液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌有很強的抑制作用，但對金黃色葡萄球菌和耶爾森菌的抑制作用較弱。4、BM-2菌株抑菌物質產生條件優化4.1培養基對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。配制6種不同的液體培養基(見表8，用陳海水配制)，分裝到250ml的三角瓶中，每個三角瓶裝入50ml。接種量為7%，在28。C、轉速為190r/min的條件下，培養5d，每種培養基3個重復，測定不同培養基發酵液的抑菌效果，根據抑菌效果確定最適培養基。表8培養基配方沐養A培養基組分(1000ml)編號i可-溶性淀粉20g,~~灘酸鉀lg,~"氯化鈉0.5g,磷酸氫二鐘0.5g,硫酸鎂0.5g~葡糖糖5g,淀粉40g,魚粉5g，黃豆餅粉10g,磷酸氫二鐘3g,碳酸鈣4g,氯化鈣5g3淀粉14g,乳糖16g,黃豆粉16g，磷酸氫二鐘3g,碳酸媽4g，，氯化鉀0.4g4葡糖糖4g,魚粉5g，黃豆餅粉10g,磷酸氫二鉀3g,碳酸鈣4g,氯化鈣5g黃豆餅粉10g,淀粉10g,玉米粉15g,魚粉5g，蛋白胨2g,葡萄糖5g，硝酸郜0.5g,破酸鉀4g玉米粉40g>麩皮10g,麩質粉5g>硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,碳酸鉤4g，葡萄糖10g結果發現，培養基組成對麗-2菌株發酵液的抑菌活性有較大影響，3號培養基發酵液的抑菌作用最強，發酵液的抑菌帶寬度最大，為9.0ran，其次為1、6號培養基，認為3號培養基為供試的培養基中BM-2菌株產生抗菌物質的最適培養基。4.2BM-2菌株產生抑菌物質發酵條件的優化。根據篩選出的產生抗菌物質的最適培養基配方，進行發酵條件優化。4.2.1培養時間對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。配制最適培養基，分裝到250ml的三角瓶中，每瓶裝入50ml。接種量為7%，放入振蕩培養箱中，在28。C、180r/min條件下，分別培養ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d，每個培養時間做3個平行，測定不同培養時間的發酵液抑菌效果，根據抑菌效果確定最適培養時間。結果發現，不同培養時間對BM-2菌株發酵液的抑菌作用影響較大，在前3d發酵液抑菌活性較低，隨時間的延長，抑菌活性增強，培養時間為5d時，發酵液的抑菌帶寬度最大，達到7.0mm，因此確定BM-2菌株產抑菌物質最佳時間為5d。4.2.2培養溫度對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。配制最適培養基，分裝到250ml的三角瓶中，每個三角瓶裝入50ml。接種量7%，轉速為180r/min，分別在15。C，20°C,25°C，28°C，30°C，35°C，37。C條件下培養5d。每個溫度做3個平行，測定發酵液的抑菌效果。結果發現，BM-2菌株在15t^37。C之間培養時，其發酵液均具有抑菌作用，培養溫度為28。C時，發酵液的抑菌帶寬度最大，達到13mm，因此BM-2菌株產生抑菌物質最佳溫度為28°C。4.2.3pH對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。配制最適培養基，分別調pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每個pH值做3個平行。接種量為7%，28°C、180r/min條件下培養5d，測定不同pH值發酵液的抑菌效果。測定不同pH下BM-2菌株發酵液的抑菌帶寬度結果表明pH為7.5時抑菌帶寬度最大，可達13.0mm，為產生抗菌物質的最佳pH。4.2.4接種量對BM-2菌株產抑菌物質的影響。配制最適培養基，接種量分別為.-1%、3%、5%、7%、9%、11%、13°/。、15%，每個接種量重復3次。放入28'C、180r/min的振蕩培養箱中培養5d，測定不同接種量發酵液的抑菌效果。接種量實驗結果表明BM-2在接種量為7%時抑菌效果最好。4.2.5裝瓶量對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。配制最適培養基，在250ml三角瓶中裝液量分別為30、40、50、60、70、80、90、100ml，每個裝瓶量做3個平行，接種量為7%，28°C，180r/min條件下振蕩培養5d，分別測定發酵液的抑菌效果。測定不同裝瓶量下BM-2菌株發酵液的抑菌帶寬度，結果表明裝瓶量在30mrS0ml時抑菌帶寬度不斷增大，裝瓶量為80ml時抑菌帶最寬，此后增加裝液量，抑菌效果逐漸減弱，因此裝瓶量為80ml時為最佳裝瓶量。4.2.6鹽度對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。在最適培養基中加入NaCl，分別配制含1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%NaCl培養基，接種量為7%，28°C、180r/min振蕩培養5d，測定不同NaCl含量培養基發酵液的抑菌效果。結果發現，在Nad含量為1%3%時，隨著鹽濃度的提高，抑菌作用逐漸增強，濃度超過3%時抑菌作用下降，Nacl含量為3。/。時抑菌效果最好。4.2.7轉速對BM-2菌株產生抑菌物質的影響。配制最適培養基，接種量為7%，將搖床轉速分別調節為160，170，180，190，200，210，220r/min，每個轉速做3個平行，28。C培養5d，測定不同轉速條件下發酵液的抑菌效果。20測定不同搖床轉速下發酵液的抑菌帶寬度結果表明BM-2菌株在轉速為190r/min時，其發酵液的抑菌帶寬度最大，說明抑菌效果最好。當搖床轉速高于或低于190r/mi時，抑菌作用逐漸降低。因此認為該菌株的最佳搖床轉速為190r/min。上述試驗對BM-2菌株發酵條件進行優化，認為BM-2菌株產生抑菌物質的最適培養基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發酵條件為接種量為7%，裝瓶量為80ml(250ml三角瓶)，搖床轉速為190r/min，最適溫度為28匸，培養時間為5d。具體實施例方式以下進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例1。一種來自海洋的鏈霉菌BM-2(&r印fcw^cessp.BM-2)的分離培養方法，其步驟如下(1)富集培養從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養液中，190r/min，25。C條件下搖床培養5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養5天的培養液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10—'的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續稀釋，分別制備成10—2、10-3、10-4、10-5、10-fi、10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、10—6和10—^勺樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏l號培養基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25t:的培養箱中培養，長出菌落；再分別挑取海水高氏l號培養基平板上的菌落，用三區劃線的方法接種到海水高氏l號培養基平板上，置于25i:培養箱中培養，反復劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個純化的菌株分別轉接到海水高氏1號培養基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對峙培養法，以供試的植物病原真菌小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌為受試菌，分別測定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時在PDA培養基平板中央接種培養5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養皿壁15mm處對稱劃線接種分離純化得到的不同菌株，25。C倒置恒溫培養，觀察植物病原真菌菌落生長狀況，培養5d后測量抑菌帶寬度；每個菌株為一處理，每處理重復3次；選取一株對前述2種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株；(4)菌株的鑒定將BM-2菌株于25'C下培養5天，觀察記錄菌落和細胞形態，同時進行生理生化試驗，并進行16SrDNA測序分析；根據形態學和生理生化試驗結果初步認為菌株BM-2屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5V^towyc"sp.，二者的16SrDNA序列相似性為99%，BM-2菌株為鏈霉菌(^SVe/tow;;c"sp.)。本實施例培養方法所得的鏈霉菌BM-2sp.BM-2)具有抑制9種植物病原真菌菌絲生長的作用，而且對其中的細鏈格孢菌分生孢子的萌發有抑制作用；還具備對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌很強的抑制作用。實施例2。實施例1所述的來自海洋的鏈霉菌BM-2(5^印towyc"sp.BM-2)的分離培養方法中，所得的鏈霉菌BM-2菌株的發酵條件為最適培養基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發酵條件為接種量7%，裝瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，搖床轉速190r/min，最適溫度28。C，培養時間5d。權利要求1、一種來自海洋的鏈霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)的分離培養方法，其特征在于，其步驟如下(1)富集培養從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養液中，190r/min，25℃條件下搖床培養5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養5天的培養液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10-1的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續稀釋，分別制備成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液；然后分別取10-5、10-6和10-7的樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏1號培養基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25℃的培養箱中培養，長出菌落；再分別挑取海水高氏1號培養基平板上的菌落，用三區劃線的方法接種到海水高氏1號培養基平板上，置于25℃培養箱中培養，反復劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個純化的菌株分別轉接到海水高氏1號培養基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對峙培養法，以供試的植物病原真菌小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌為受試菌，分別測定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時在PDA培養基平板中央接種培養5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養皿壁15mm處對稱劃線接種分離純化得到的不同菌株，25℃倒置恒溫培養，觀察植物病原真菌菌落生長狀況，培養5d后測量抑菌帶寬度；每個菌株為一處理，每處理重復3次；選取一株對前述2種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株；(4)菌株的鑒定將BM-2菌株于25℃下培養5天，觀察記錄菌落和細胞形態，同時進行生理生化試驗，并進行16SrDNA測序分析；根據形態學和生理生化試驗結果初步認為菌株BM-2屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于Streptomycessp.，二者的16SrDNA序列相似性為99％，BM-2菌株為鏈霉菌(Streptomycessp.)。2、根據權利要求1所述的來自海洋的鏈霉菌BM-2(&reptomyc^sp.BM-2)的分離培養方法，其特征在于，所述的鏈霉菌BM-2菌株的發酵條件為最適培養基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發酵條件為接種量7%，裝瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，搖床轉速l術/min，最適溫度28'C，培養時間5d。3、權利要求1或2所述的鏈霉菌BM-2(6Vreptow少c"sp.BM-2)的抑制植物病原真菌的用途，以及抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌的用途。全文摘要本發明是一種來自海洋的鏈霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)的分離培養方法，其特征在于，其步驟如下它包括富集培養、菌體的分離純化、菌株的篩選和菌株的鑒定等步驟，根據形態學、生理生化試驗結果以及16SrDNA的同源性分析表明分離培養的菌株為鏈霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)。該鏈霉菌BM-2具有抑制多種植物病原真菌及抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌的作用。文檔編號A01N63/04GK101497867SQ20091002516公開日2009年8月5日申請日期2009年2月18日優先權日2009年2月18日發明者吳少杰,張曉君,暴增海,李福后,王偉霞,馬桂珍申請人:淮海工學院