專利名稱：一種酶解餅粕蛋白生產飼用混合小肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用蛋白酶酶解餅粕蛋白生產飼用混合小肽的方法，屬于用 酶制劑方法獲得飼用生物制品技術領域，可作為添加劑或飼料蛋白源用于畜禽和 水產飼料中。
背景技術：
蛋白質的酶法水解是在一定條件下對蛋白質分子進行催化水解，使蛋白質分 子降解成不同鏈長的小分子，與酸堿催化反應相比，它具有反應條件溫和，副反 應少，不破壞氨基酸和其它營養成分的特點，同時生成的肽類和氨基酸能更好的 被動物吸收和利用。
目前酶類制品商品化生產非常普遍，有動物性內源酶、微生物酶和植物蛋白 酶。從酶解成本來看，微生酶價格低，活性強，適合應用于大規模生產。常用的 酶解蛋白原料有酪蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、魚肉蛋白、餅粕蛋白等。以動物 蛋白原料作為酶解蛋白源，其價格較高，而餅粕類等植物蛋白，如豆粕、棉粕、 花生粕等，作為水產飼料中常見的植物蛋白原料，來源廣泛，價廉物美，廣泛應 用于動物的配合飼料中。因此，積極開發餅粕類植物蛋白資源對飼料業的可持續 發展具有顯著意義。
大量研究證明，由于大豆蛋白，花生蛋白，棉粕蛋白等結構復雜，分子量較 大，不易在體內消化吸收，而蛋白質的短肽物質不但消化吸收效果好，且分子量 集中在3000Da以下的肽具有降血壓、抗氧化、降膽固醇等功能。在動物飼料中添 加小肽制品可有效避免游離氨基酸之間的競爭，提高飼料中蛋白質和微量元素的 利用率，促進動物生長，改善飼料報酬，提高動物的免疫力和抗應激能力。另外， 小肽不僅具有很好的溶解性、低粘度、抗凝膠形成性，可用來制作達到健康目標 的各種食品，且吸收速度快、耗能低、不易飽和，各種肽之間運轉無竟爭性與抑 制性，因此動物對肽的吸收比對游離氨基酸吸收更迅速，更有效。
目前，在醫藥生化制劑制造領域，應用生物與化學工程技術已開發出數百種 肽制品，作為多種生物活性因子、激素、受體、生物活性物的抑制劑、營養添加 劑等，其產品純度高、功能確切，但價格十分昂貴。在動物飼料加工業領域，目 前也有一些通過水解、微生物發酵等工藝生產的蛋白質一肽一氨基酸混合制品， 但由于成分復雜，屬于肽應用的初級產品。
因此，加強對飼料源活性肽的基礎研究，對于開發生產經濟實用的飼料肽產 品和進一步提高動物生產性能具有積極的現實意義。
技術問題
本發明的目的是提供"一種酶解餅粕蛋白生產詞用混合小肽的方法"，克服 當前飼料蛋白源短缺、植物蛋白氨基酸不平衡以及抗營養因子問題，尤其對提高動物對蛋白質的消化吸收率提供了一種工藝簡便、成本低廉、綠色環保型生物產 品，可用于大規模工業化生產，為畜禽及水產飼料提供一種新型蛋白源及添加劑。
技術方案
本發明所述的飼用混合小肽的制備方法，其步驟為
1) 將無霉變的豆粕和棉粕去除雜物，分別粉碎過ioo目篩，按一定比例充分混 合均勻后，按兩種餅粕混合物與水質量比為1: (3 5)的比例將水加入復合餅 粕粉料中，攪拌均勻得到液態混合物；
2) 在液態混合物中加入NaOH溶液調節酸堿度維持反應體系的pH值在6.8 7.2 之間；
3) 按1500IU/g蛋白的比例加入枯草桿菌蛋白酶，在45 55'C條件下進行水浴反 應，反應時間為4 6h，得到反應后液態混合物；
4) 反應結束后，將反應后液態混合物放置于85T:以上溫度下水浴滅活，然后冷 卻，離心取其上層液體，干燥成干粉，即為混合小肽。
在步驟l)中，豆粕和棉粕按一定比例混合，其質量比最好為豆粕棉粕=
3: 7，在復合餅粕粉料中加入的水為去離子水，其最佳比例為復合餅粕粉料水 =1: 3。
在步驟2)中，在反應過程中不斷攪拌，最好溫度保持在5(TC，并加NaOH 溶液維持反應體系的pH值在7.0，反應時間為5h。
在步驟3)中，將反應后液態混合物置于85'C以上溫度下，在容器中加熱 10min進行滅活，然后采用離心等物理方法，取其上層液體部分干燥成混合小肽。
有益效果
本發明選用豆粕和棉粕，按特定比例混合后作為酶解底物，以內切蛋白微生 物酶類對餅粕蛋白進行酶解，通過正交試驗設計，系統地分析得出制備高水解度 小肽的最佳酶解條件，為工業化生產飼用混合小肽提供了成熟的酶解工藝。
(1) 用枯草桿菌蛋白酶酶解豆粕和棉粕蛋白混合物，水解度(DH)非常高， 達到9;分子量小于3000Da的小分子蛋白質、肽等比例高達30%以上。表明枯草桿 菌蛋白酶對復合餅粕具有很強的酶解能力。
(2) 獲得混合小肽的方法和程序簡單易行枯草桿菌蛋白酶的酶解條件為 p朋.8 7.2，溫度45 55X:，時間4 6h。條件溫和，方法簡便安全、高效，并 無副毒物產生，避免象酸堿水解而產生毒副產物和蛋白質變性，并可產生活性肽
(3) 資源豐富、價格低廉我國餅粕類蛋白資源非常豐富、價格低廉、蛋 白質含量高，是很好的動物飼料蛋白資源；同時，微生酶價格較低，并且活性較 強，適合應用于大規模生產。
(4) 營養價值高餅粕蛋白經過酶解之后，可溶性蛋白比例比原來增加了 1倍，其中，分子量小于3000Da的小分子蛋白比例高達32%。動物營養研究表明， 分子量在3000Da以下的肽，具有吸收速度快、耗能低、不易飽和，且各種肽之 間運轉無竟爭性與抑制性的特點。(5)經濟環保該技術應用可實現使用餅粕蛋白資源部分或完全替代動物 蛋白資源的目標，既降低了生產成本，解決了動物蛋白資源短缺的問題，又對外 界環境無污染，是一種具有很高生態環境保護價值的新方法。
圖混合小肽生產工藝圖
具體實施例方式
將無霉變的豆粕和棉粕去除雜物，分別粉碎過100目篩，按3:7的比例充分 混合后，按3: 1的比例將去離子水加入復合餅粕粉料中，攪拌均勻得到液態混 合物。用NaOH溶液調節混合物pH值為7后，按1500IU/g蛋白的比例加入枯 草桿菌蛋白酶，在5(TC條件下水浴反應5小時。反應結束后，在85。C以上溫度 下加熱滅活10min，然后冷卻，在室溫3500r/min下離心10min，取上清液干燥， 即為混合小肽。通過高效液相色譜分析，混合小肽的分子量分布比例見表2。
表2混合小肽的分子量分布比例(%)
分子量1700Da-3443Da170Da-1700Da93Da-170Da<93Da
比例9. 3364.8121.084, 77
注Da表示道爾頓，是表示分子量大小的單位
飼用混合小肽的應用
1)混合小肽在異育銀鯽腸道中的吸收機制
為了研究異育銀鯽腸道完整吸收小肽與腸道中小肽的關系，用生理鹽水和混合小肽進行 異育銀鯽腸道灌注試驗。20分鐘后尾靜脈采血制備血漿，高效液相色譜分析結果表明灌 注混合小肽溶液組異育銀鯽血漿中小肽總量較灌注生理鹽水組異育銀鯽增加了 28.02% (分 子量180Da-1800Da)，如表3所示。說明異育銀鯽血漿中肽量的增加與腸道提供的肽種類和 數量有關，異育銀鯽腸道能夠一定程度完整吸收某些小肽直接進入血液循環，進而快速高效 的被機體吸收利用。
表3異育銀鯽血漿:中蛋白質組分峰面積比例(%)
分子量74Da-l,a180Da-1800Da1800Da-謂00Da
生理鹽水組60. 0418. 0621.90
混合小肽組61.2023. 1315. 67
注Da表示道爾頓，是表示分子量大小的單位
2)混合小肽對石斑魚的促生長作用以2%混合小肽、0.01%芽孢桿菌、0.2%菊糖、0. 01%芽孢桿菌和0. 2%菊糖混合物作為添 加劑添加到基礎日糧中飼喂石斑魚。養殖試驗結束后發現，與其他組相比，添加混合小肽能 顯著提高石斑魚30天時的特定生長率(SGR)， 60天時的增重率(WGR)以及養殖期間石斑 魚的飼料利用率(FCR)，見表4。
表4混合小肽對石斑魚生產性能的影響(％)
組別30d SGR60d WGRFCR
基礎飼料(對照組)147. 07 ±14. 76a199. 82 ±16. 97a37. 38±3. 83a
基礎飼料+混合小肽163. 70±14. 51a248. 58 ±24. 52b39. 10±3. 9a
基礎飼料+芽孢桿菌158, 85 ±12. 34a212. 25±5. 91ab36. 23±3. 37a
基礎飼料+菊 糖152.91士11.01a213,62±29. 72ab36. 38±2. 36a
基礎飼料+益生菌+糖155. 62±3. 14a215. 9±8. 23ab35. 24±1.15a
注同一列小寫字母不同者差異顯著(P<0.05),同一列小寫字母相同者差異不顯著(P〉0.05)。
3)混合小肽的抗應激作用
在曰糧中添加1%混合小肽，可以提高異育銀鯽機體血液中超氧化物歧化酶活性，降低 乙酰膽堿酯酶和谷草轉氮酶活性，對緩解異育銀鯽熱應激損傷，提高機體免疫力和抗氧化能
力具有良好的調控作用，見表5。
表5常溫和熱應激狀態下異育銀鯽血清中免疫酶活性(n=3)
組別超氧化物歧化酶乙酰膽堿酯酶谷草轉氨酶
常溫下 應激后常溫下 應激后常溫下 應激后
對照組 小肽組176.76±14.61Aa 73.41±1.20Ba 162.3 l士16.79Aa 153.74士3.60Ab3.54±0.37Aa 4.79±0.49Aa 2.33±0.21Aab 4.85±0.27Ba33.50±4.40Aab 58.73±5.90Ba 29.27±2.60Aab 37.50±0.29Ac
注同行(大寫字母)和同列(小寫字母)中數據字母不相同者差異顯著(P〈0.05)，相同者差異不顯著
(P>0.05)。
權利要求
1. 一種酶解餅粕蛋白生產飼用混合小肽的方法，是一種由復合餅粕蛋白經蛋白酶水解生成混合小肽的方法。
2. 如權利要求1所述的飼用混合小肽的制備方法，其特征在于其步驟為1) 將無霉變的豆粕和棉粕去除雜物，分別粉碎過ioo目篩，按一定比例充分混 勻后，按質量比復合餅粕水=1: 3 5的比例將水加入復合餅粕粉料中，攪拌 均勻得到液態混合物；2) 在液態混合物中加入NaOH溶液維持反應體系的pH值在6. 8 7. 2之間，按 1500IU/g蛋白的比例加入枯草桿菌蛋白酶，在45 55'C條件下進行水浴反應， 反應時間為4 6h，得到反應后液態混合物；3) 反應結束后，將反應后液態混合物放置于85'C以上溫度下滅活酶活，然后冷 卻，離心取其上層液體部分，干燥成干粉，即為混合小肽。
3. 如權利要求2所述的混合小肽的制備方法，其特征在于，在步驟l)中，混合 比例為豆粕棉粕=3: 7，在復合餅粕粉料中加入的水為去離子水，其比例為復 合餅粕粉料水=1: 3。
4. 如權利要求2所述的混合小肽的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，在容 器中震蕩的溫度為50°C。
5. 如權利要求2所述的混合小肽的制備方法，其特征在于，在步驟1)中，用 Na0H溶液的pH至7.0。
6. 如權利要求2所述的混合小肽的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，反應 時間為5h。
7. 如權利要求2所述的混合小肽的制備方法，其特征在于在步驟3)中，將反應 溶液置于85°C以上溫度下加熱10min進行滅活，然后3500r/min離心10min，取 其上層液體干燥，即為混合小肽。
8. 權求1-7之一所述方法獲得的混合小肽產品。
9. 權利要求8所述混合小肽產品的應用。
全文摘要
本發明涉及“一種酶解餅粕蛋白生產飼用混合小肽的方法”，屬于生物制品技術領域。采用的復合餅粕是按照豆粕∶棉粕＝3∶7的質量比例配置而成，使用的蛋白酶是指枯草桿菌蛋白酶；在pH＝7，溫度50℃的條件下，反應5小時酶解生成混合小肽。該技術選用特定比例的復合餅粕作為酶解底物，以內切蛋白微生物酶類對餅粕蛋白進行酶解，通過正交試驗設計，系統地分析得出制備高水解度小肽的最佳酶解條件。該技術一方面提升了餅粕蛋白的應用價值，另一方面精確地控制了酶解反應的進行，提高了植物蛋白肽的水解度，降低了小肽生產成本。獲得具有高溶解度、低黏度等優良特性的混合小肽。
文檔編號A23K1/16GK101530156SQ20091002945
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月14日 優先權日2009年4月14日
發明者劉文斌, 方星星, 丹 桂, 恬 王 申請人:南京農業大學