專利名稱：色素萬壽菊的組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域的組織培養方法，具體是一種色素萬壽菊的組 織培養方法。
技術背景萬壽菊(Tagetes erecta)又名臭芙蓉，為菊科萬壽菊屬的一種，原產墨西哥 及美洲地區,現世界各地均有栽培。按用途可將其分為觀賞萬壽菊和色素萬壽菊， 色素萬壽菊花瓣內葉黃素含量極其豐富，是提取天然葉黃素的理想原料，葉黃素 可廣泛用于食品著色、醫藥及禽類詞料中，具有很高的經濟價值。近年來，國外萬壽菊品種選育方面取得了長足的進展，而我國Fl代萬壽菊育 種尚處于起步階段， 一些涉及Fl制種技術如播種技術、育苗技術、親本識別方 法、授粉方法、父本和母本播種比例、種子采收時間及栽培范圍等雖己有報道， 但培育出與國外品種有競爭力的自主產權的品種還需時日，而通過常規的繁殖方 法如種子繁殖，則后代易發生變異；插扦繁殖則耗時長，短時期無論法獲得大量 種苗。我國被認為是目前世界上最大的萬壽菊潛在消費市場，對色素萬壽菊種子 的需求量大，除了加強制種技術的研制外，尋找及建立一種色素萬壽菊的快速繁 殖方法已成當務之急，采用組織培養法對具有優良品種特性的萬壽菊進行快速繁 殖，在短期內生產出大量整齊均勻的健壯種苗，建立一個高效的植株再生體系， 有利于種質資源的保存和優良品種的推廣，同時也為基因工程育種奠定了基礎。經對現有技術的文獻檢索發現，鄒永梅、黃雪芳在《江蘇林業科技》2005年32巻6期17 19頁發表了題 為"萬壽菊的組織培養和瓶苗開花研究"；蘇福才、錢國珍在《內蒙古農牧業學 院學報》1999年20巻3期第108 111頁發表了 "萬壽菊莖段組織培養"。但 兩學者所選取的外植體均為莖段，其取材范圍較窄；Marilyn M. Belarmino等在《.Japan. J. Breed》(日本育種雜志)1992 年42期第835 841頁發表了 " Callus induction and plant regeneration inAfrican Marigold (Tagetes erecta L.)"(非洲萬壽菊愈傷誘導與植物再生)一 文，該學者利用萬壽菊胚軸、葉片為外植體誘導植株再生，但利用葉片建立萬壽 菊再生體系未能成功；PratibhaMisra等在《In Vitro Cellular & Developmental Biology》 (離 體分子發育生物學)2001年10期466發表了" Direct differentiation of shoot buds in leaf segments of white marigold (Tagetes erecta L).，，(白花萬壽 菊葉片直接誘導芽分化)一文，文中提到，利用白花萬壽菊葉片為外植體誘導了 植株再生，但可能由于品種基因型的差異，從預備試驗結果看，其結果不適宜用于F1色素萬壽菊植株再生；Pablo E, Vanegas等在《Plant Cell Tissue and Organ Culture》(植物 細胞組織與器官培養)2002年69期第279 283頁發表了" Plant regeneration via organogenesis in marigold"(通過器官發生萬壽菊實現植株再生) 一文， 文中提到，利用萬壽菊葉片為外植體建立了再生體系，但是存在著不定芽誘導率 低的缺點(69.3%),同時還發現在其條件下誘導植株再生，不定芽還存在著玻璃 化的傾向，不能發育成正常苗。發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種色素萬壽菊的組織培養方 法。本發明的方法取材方便、可提供的材料充足，可高頻率地誘導出大量的萬壽 菊再生芽，再生植株成活率高，最高可達100%，而且具有再生植株變異小和遺 傳穩定性較高的優點；本發明為擴大萬壽菊的繁殖系數、種質保存及其遺傳轉化 奠定了良好的基礎。本發明是通過以下技術方案實現的，包括如下步驟-步驟一，取萬壽菊葉片，滅菌后誘導；誘導使用的分化培養基具體為MS基 本培養基，添加劑為3mg/L的6-BA， 3mg/L的IAA， 30g/L的蔗糖，6g/L的植 物凝膠；培養條件為溫度23 27。C，光照時間10h 20h / d，光照強度2000 30001ux，不定芽的誘導時間為9 14d;步驟二，將步驟一誘導得到的不定芽進行繼代培養，使用的生長培養基與步 驟一中的分化培養基相同，培養條件為溫度23 27°C，光照時間10h 20h/d， 光照強度2000 30001ux，培養時間為30 50d;步驟三，將步驟二得到的分化伸長的芽進行生根培養，生根培養時間為30d，得到萬壽菊再生植株。步驟一中，所述滅菌具體為取生長45 60d萬壽菊植株的幼嫩葉片，用自 來水沖洗lmin，在超凈臺上用體積分數為75%的酒精浸泡5 8s,用無菌水沖洗 3次，再用質量分數為1.0°/。的次氯酸鈉溶液浸泡10s，再經無菌水沖洗5次，將 消毒后的葉片切成0. 5cmX0. 5cm的小塊。步驟一中，所述培養條件具體為，光照時間為16h/d，光照強度為25001ux， 誘導時間為13d。步驟二中，所述培養條件具體為，光照時間為16h / d，光照強度為25001ux， 誘導時間為40d。本發明提供了一種萬壽菊組織培養方法，該方法是以葉片作為外植體，通過 器官發生途徑得到再生植株。本發明的方法取材方便、可提供的材料充足，可高頻率地誘導出大量的萬壽 菊再生芽，再生植株成活率高，最高可達100%，而且具有再生植株變異小和遺 傳穩定性較高的優點；本發明為擴大萬壽菊的繁殖系數、種質保存及其遺傳轉化 奠定了良好的基礎。
圖1為葉片外植體上誘導產生的不定芽照片圖； 圖2為不定芽伸長30d后的植株照片圖； 圖3為萬壽菊再生苗照片圖。
具體實施方式
以下實例將結合附圖對本發明作進一步說明。本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于 下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實施例本實施例的萬壽菊的組織培養方法，包括以下步驟步驟一，取生長45 60d的萬壽菊植株(萬壽菊Fl代種子)的幼嫩葉片，用自 來水沖洗lmin，在超凈工作臺上用體積分數為75%的酒精浸泡5 8、用無菌水 沖洗3次，再用質量分數為1. 0%的次氯酸鈉溶液浸泡10s，再經無菌水沖洗5次。 將消毒后的葉片切成0.5cmX0.5cm的小塊。之后進行誘導培養，誘導使用的分化培養基具體為MS基本培養基，添加劑為3mg/L的6-BA， 3mg/L的IAA， 30g/L 的蔗糖，6g/L的植物凝膠；培養條件為溫度23 27'C，光照時間為16h/d， 光照強度為25001ux，誘導時間為13d，誘導效果見圖l。其中，MS基本培養基 的配制可參照Murashige T， Skoog F.在《Physiol. Plant》(植物生理)1962 年15期473-497頁發表的《A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures》(一種用于煙草組織培養中快速生長和生物測 定的優化培養基) 一文，其配制方法相同。步驟二中，在超凈臺上將步驟一中誘導出的不定芽移至植物組織培養瓶中進行繼代培養，使用的生長培養基與步驟一中的分化培養基相同，培養條件為溫度23 27。C，光照時間為16h/d，光照強度為25001ux，誘導時間為40d，效果 見圖2。步驟三中，在超凈臺上將分化伸長的，已經長出真葉，高約3cm植株轉移至 生根培養基上，即MS基本培養基。所述培養條件具體為，光照時間為16h/d， 光照強度為25001ux， 30d后發育成完整植株，效果見圖3。對步驟三中經生根培養后得到的再生苗進行煉苗，待再生苗長出10 15片 真葉時，將其與空氣接觸，23 27'C下生長5 10d;然后用流水洗去再生苗根上的培養基，將其移栽到消毒栽培基質(蛭石草炭=i : i，體積比)中培養，得到萬壽菊再生植株，成活率達100%。
權利要求
1、一種色素萬壽菊的組織培養方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取萬壽菊葉片，滅菌后誘導；誘導使用的分化培養基具體為MS基本培養基，添加劑為3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝膠；培養條件為溫度23～27℃，光照時間10h～20h/d，光照強度2000～30001ux，不定芽的誘導時間為9～14d；步驟二，將步驟一誘導得到的不定芽進行繼代培養，使用的生長培養基與步驟一中的分化培養基相同，培養條件為溫度23～27℃，光照時間10h～20h/d，光照強度2000～30001ux，培養時間為30～50d；步驟三，將步驟二得到的分化伸長的芽進行生根培養，生根培養時間為30d，得到萬壽菊再生植株。
2、 根據權利要求1所述的色素萬壽菊的組織培養方法，其特征是，步驟一 中，所述滅菌具體為取生長45 60d萬壽菊植株的幼嫩葉片，用自來水沖洗 lmin，用體積分數為75。/。的酒精浸泡5 8s，用無菌水沖洗3次，再用質量分數 為1.0%的次氯酸鈉溶液浸泡10、再經無菌水沖洗5次，將消毒后的葉片切成 0. 5cmX0. 5cm的小塊。
3、 根據權利要求1所述的色素萬壽菊的組織培養方法，其特征是，步驟一 中，所述培養條件具體為，光照時間為16h/d，光照強度為25001ux，誘導時間 為13d。
4、 根據權利要求1所述的色素萬壽菊的組織培養方法，其特征是，步驟二 中，所述培養條件具體為，光照時間為16h/d，光照強度為25001ux，誘導時間 為40d。
全文摘要
一種生物技術領域的色素萬壽菊的組織培養方法，包括如下步驟取萬壽菊葉片，滅菌后誘導；誘導使用的分化培養基具體為MS基本培養基，添加劑為3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝膠；培養條件為溫度23～27℃，光照時間10h～20h/d，光照強度2000～3000lux，不定芽的誘導時間為9～14d；將分化出的不定芽繼代培養，誘導芽生長培養基與步驟一中的分化培養基相同，培養條件為溫度23～27℃，光照時間10h～20h/d，光照強度2000～3000lux，培養時間為30～50d；將分化伸長的芽進行生根培養，生根培養時間為30d，得到萬壽菊再生植株。本發明的方法取材方便、可高頻率地誘導出大量的萬壽菊再生芽，再生植株成活率高，再生植株變異小和遺傳穩定性較高。
文檔編號A01H4/00GK101543185SQ20091005045
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月30日 優先權日2009年4月30日
發明者唐克軒, 佳 孫, 張永強, 麗 曾, 帆 楊, 趙子剛 申請人:上海交通大學