專利名稱：枯草芽孢桿菌制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物制劑的制作方法。
背景技術：
枯草芽孢桿菌制劑為活菌類廣譜剎蟲劑，其主要成分為抗生素和枯草芽孢桿菌的芽孢，是一種新型的生物環保農藥，對水稻稻瘟病、馬鈴薯晚疫病、棉花黃枯萎病、蔬菜灰霉病、蔬菜白粉病、小麥白粉病等有優異防效。枯草芽孢桿菌制劑是國內外發展綠色食品、無公害農產品、保護環境安全的生物農藥，其市場前景非常好，目前己經在廣東、云南、山東、四川、河北、浙江、湖北、湖南、江西等地農田廣泛使用。現在多采用2007年《果樹學報》上趙妍發表的一篇名為《枯草芽孢桿菌(Bacillus subtils)B10對采后草莓果實病害的抑制效果》中所述的枯草芽孢桿菌B10來制作枯草芽孢桿菌制劑，傳統的方法為將枯草芽孢桿菌B10發酵培養后，其發酵液經過板框過濾，過濾后的濾液在經過流化床千燥，再經過粉碎即制得枯草芽孢
桿菌制劑。但是該方法還存在以下問題1、由于板框過濾不能有效的去除可溶性蛋白、糖類、色素等雜質，制作得到的枯草芽孢桿菌制劑產品的中的有效成分含量較低，該方法制作得到的枯草芽孢桿菌制劑中的芽孢數僅為800億/克，抗生素在芽孢桿菌制劑產品中的質量百分比僅為0.05%左右；2、在板框過濾操作時需要加入助濾劑以提高濾速，且板框過濾需要大量的人力進行操作，該法的成本高；3、由于該法
對發酵液中糖類的去除率低，使制作得到的枯草芽孢桿茵制劑產品極易吸潮，產品的保存期短。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有的枯草芽孢桿菌制劑的制作方法存在的制作成本高及制作得到的有效成分含量低、保存期短的問題，而提供了一種枯草芽孢桿菌制劑的制作方法。
本發明枯草芽孢桿菌制劑按照以下步驟進行 一、枯草芽孢桿菌B10經發酵后
得到發酵液；二、將發酵液通過截流分子量為30000~100000k的超濾膜過濾分離，操作壓力為3 6bar，溫度20 45。C'膜通量為55 65LMH，通過超濾膜的溶液為抗生素溶液，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為5~7倍，水
3的洗滌用量為發酵液體積的20°/。 40%;三、將步驟二中的抗生素溶液通過截流分子量為3000 10000k的超濾膜過濾得到抗生素透過液，操作壓力為10 26bar，溫度為20 45°C，膜通量為45~55LMH，濃縮倍數為7 10倍，其中通過超濾膜的溶液為抗生素透過液；四、將步驟三中的抗生素透過液通過截流分子量為400 600k的納濾膜過濾得到抗生素濃縮液，操作壓力為15~30bar，溫度為20 45°C ，膜通量為35 45LMH，濃縮倍數為10-15倍，其中被截留在膜的進液惻的溶液為抗生素濃縮液；五、將步驟四中抗生素濃縮液和步驟二中的芽孢溶液混合均勻，再進行噴霧干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢桿菌制劑，噴霧千燥的進口溫度為190~210°C，出口溫度為80~100°C。
本發明的方法中的膜過濾的方法自動化程度高，操作簡單，減少了人力成本，且不需要使用過濾劑進行過濾，本發明的制作方法成本低；本發明中膜過濾的方法與現有的板框過濾相比較，本發明的方法有效的去除掉了發酵液中的可溶性蛋白、'糖類及色素，本發明制作得到的枯草芽孢桿菌制劑中的有效成分含量高，本發明制作得到的枯草芽孢桿菌制劑中的芽孢數達到1500億/克左右，抗生素在枯草芽孢桿菌制 劑的質量百分比為0.1%左右；本發明的方法對發酵液中糖類的去除率達到80%以上，制作得到的枯草芽孢桿菌制劑不易吸潮，保質期長，在空氣中放置3個月，增重率僅為3%。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式枯草芽孢桿菌制劑的制作按照以下步驟進行一、枯草芽孢桿菌B10經發酵后得到發酵液；二、將發酵液通過截流分子量為30000~100000k的超濾膜過濾分離，操作壓力為3 6bar，溫度20~45°C，膜通量為55 65LMH，通過超濾膜的溶液為抗生素溶液，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為5 7倍，水的洗滌用量為發酵液體積的20% 40%;三、將步驟二中的抗生素溶液通過截流分子量為3000~10000k的超濾膜過濾得到抗生素透過液，操作壓力為10 26bar,溫度為20~45°C，膜通量為45 55LMH，濃縮倍數為7 10倍，其中通過超濾膜的溶液為抗生素透過液；四、將步驟三中的抗生素透過液通過截流分子量為400 600k的納濾膜過濾得到抗生素濃縮液，操作壓力為i5 30bar，溫度為20 45。0,膜通量為35 45LMH，濃縮倍數為10~15倍，其中被截留在膜的迸液側的溶液為抗生素濃縮液；五、將步驟四中抗生素濃縮液和步驟二中的芽孢溶液混合均勻，再進行噴霧干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢桿菌制劑，噴霧干燥的進口溫度為190 210°C，出口溫度為80 10(TC。
本實施方式步驟一中的枯草芽孢桿菌BIO可通過全俄羅斯植物保護研究所購買得到。
本實施方式步驟二中芽孢溶液中枯草芽孢桿菌B10耐高溫，在250°C的條件下存活60min，芽孢的直徑為0.3 0.6pm，長1.5pm 2.(^m。
本實施方式步驟二中抗生素溶液的主要成份為抗生素、大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，其中抗生素耐高溫，抗生素在200。C的條件下，持續30分鐘，仍然有84%的殘留；抗生素的分子量為1000~2000k。
本實施方式步驟二中抗生素溶液為深黃色。
本實施方式步驟三中的超濾膜過濾掉抗生素溶液中的大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，所得到的抗生素透過液為淡黃色。
本實施方式步驟四被截留在膜的進液側的抗生素濃縮液中的主要成份為抗生素，而通過納濾膜的為單糖、無機鹽等小分子雜質，達到了去除單糖、無機鹽等小分子雜質的目的。
本實施方式制作得到的枯草芽孢桿菌制劑中的芽孢數達到1500億/克左右，抗生素在枯草芽孢桿菌制劑的質量百分比為0.1%左右。
本實施方式制作得到的枯草芽孢桿菌制劑的保質期為2年以上。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中將枯草芽孢桿菌B10接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為36 39。C，發酵時間為65 75h。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
本實施方式枯草芽孢桿菌B10將發酵培養后，發酵液中的有效活芽孢含量為200~400億/克。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二中芽孢溶液濃縮倍數為6倍。其它步驟及參數與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三不同的是步驟四中濾液通過截流分子量為500k的納濾膜過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟五中噴霧干燥的
進口溫度為21(TC，出口溫度為90。C。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
二不同的是枯草芽孢桿菌BIO接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為37。C，發酵時間為70h。其它步驟及參數
5與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中將發酵液通過截流分子量為50000 S0000k的超濾膜過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具休實施方式一不同的是步驟二中操作壓力為
4 5bar，溫度28 38。C，膜通量為57 63LMH，芽孢溶液濃縮倍數為5 6倍，水的洗滌用量為發酵液體積的25%~35%。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中透過液通過截流分子量為5000~8000k的超濾膜過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十本實施方式枯草芽孢桿菌制劑的制作按照以下步驟進行一、枯草芽孢桿菌B10經發酵后得到發酵液；二、將發酵液通過截流分子量為60000k的超濾膜過濾分離，操作壓力為5bar，溫度35'C，膜通量為60LMH，通過超濾膜的溶液為抗生素溶液，被截留在膜的進液惻的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為5 7倍，水的洗滌用量為發酵液體積的30%;三、將步驟二中的抗生素溶液通過截流分子量為6000k的超濾膜過濾得到抗生素透過液，操作壓力為22bar，溫度為35。C，膜通量為50LMH，濃縮倍數為8倍；其中通過超濾膜的溶液為抗生素透過液；四、將步驟三中的抗生素透過液通過截流分子量為500k的納濾膜過濾得到抗生素濃縮液，操作壓力為25bar，溫度為35t:，膜通量為40LMH,濃縮倍數為12倍，其中被截留在膜的進液側的溶液為抗生素濃縮液；五、將步驟四中抗生素濃縮液和步驟二中的芽孢溶液混合均勻，再進行噴霧干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢桿菌制劑，噴霧干燥的進口溫度為21(TC，出口溫度為9(TC。
本實施方式步驟一中將枯草芽孢桿菌B10接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為36 39。C，發酵時間為65 75h;其中培養后的發酵液中的芽孢含量為300億/克。 .
本實施方式步驟二中濃縮液的主要成份為芽孢，芽孢的直徑為0.3 0.6nm,長1.5^n 2.0nm;芽孢耐高溫，在25(TC的條件下存活60min。
本實施方式步驟二中抗生素溶液的主要成份為抗生素、大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，其中抗生素的分子量為1000 2000k。
本實施方式步驟二中抗生素溶液為深黃色。
本實施方式步驟三中的超濾膜過濾掉抗生素溶液中的大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，所得到的抗生素透過液為淡黃色。
本實施方式步驟四被截留在膜的進液側的抗生素濃縮液中的主要成份為抗生素，而通過納濾膜的為單糖、無機鹽等小分子雜質，達到了去除單糖、無機鹽等小分子雜質的目的。
木實施方式制作得到的枯草芽孢桿菌制劑中的有效成分含量高，本實施方式采用血球計數板測定制作得到的枯草芽孢桿菌制劑的芽孢數為1600億/克；本實施方式
采用分光光度計法測定抗生素在枯草芽孢桿菌制劑的質量百分比為0.12%，分光光度計的波長為250nm;本實施方式對發酵液中糖類的去除率達到80%以上，制作得到的枯草芽孢桿菌制劑不易吸潮，在空氣中放置3個月，增重率僅為3%，而相同重量的由傳統方法制作得到的枯草芽孢桿菌制劑在空氣中放置3個月，增重率為30%左右，本實施方式制作得到的枯草芽孢桿菌制劑保質期長，保質期為2年以上，不會變質。
權利要求
1、枯草芽孢桿菌制劑的制作方法，其特征在于枯草芽孢桿菌制劑按照以下步驟進行一、枯草芽孢桿菌B10經發酵后得到發酵液；二、將發酵液通過截流分子量為30000～100000k的超濾膜過濾分離，操作壓力為3～6bar，溫度20～45℃，膜通量為55～65LMH，通過超濾膜的溶液為抗生素溶液，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為5～7倍，水的洗滌用量為發酵液體積的20％～40％；三、將步驟二中的抗生素溶液通過截流分子量為3000～10000k的超濾膜過濾得到抗生素透過液，操作壓力為10～26bar，溫度為20～45℃，膜通量為45～55LMH，濃縮倍數為7～10倍，其中通過超濾膜的溶液為抗生素透過液；四、將步驟三中的抗生素透過液通過截流分子量為400～600k的納濾膜過濾得到抗生素濃縮液，操作壓力為15～30bar，溫度為20～45℃，膜通量為35～45LMH，濃縮倍數為10～15倍，其中被截留在膜的進液側的溶液為抗生素濃縮液；五、將步驟四中抗生素濃縮液和步驟二中的芽孢溶液混合均勻，再進行噴霧干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢桿菌制劑，噴霧干燥的進口溫度為190～210℃，出口溫度為80～100℃。
2、 根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌制劑的制作方法，其特征在于步驟一中將枯草芽孢桿菌B10接種到發酵罐中進行發酵培養，發酵溫度為36~39°C，發酵時間為65 75h。
3、 根據權利要求1或2所述的枯草芽孢桿菌制劑的制作方法，其特征在于步驟二中芽孢溶液濃縮倍數為6倍。
4、 根據權利要求3所述的枯草芽孢桿菌制劑的制作方法，其特征在于步驟四中濾液通過截流分子量為500k的納濾膜過濾。
5、 據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌制劑的制作方法，其特征在于步驟五中噴霧干燥的進口溫度為210。C，出口溫度為90。C。
全文摘要
枯草芽孢桿菌制劑的制作方法，它涉及一種微生物制劑的制作方法。本發明的方法解決了現有的枯草芽孢桿菌制劑的制作方法存在的制作成本高及制作得到的有效成分含量低、保存期短的問題。方法一、枯草芽孢桿菌B10經發酵后得到發酵液；二、發酵液經超濾膜分離得到抗生素溶液和芽孢溶液；三、抗生素溶液經超濾膜過濾得抗生素透過液；四、抗生素透過液再經納濾膜過濾得抗生素濃縮液；五、將抗生素濃縮液和步驟二中的芽孢溶液混合經噴霧干燥制成粉末，即制作得到枯草芽孢桿菌制劑。本發明的制作方法成本低，制作得到的產品質量好，保質期長，密封條件下可保存2年以上不變質。
文檔編號A01P3/00GK101558763SQ20091007209
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月22日 優先權日2009年5月22日
發明者偉 劉, 孫新宇, 張龍豐, 李宏園, 敏 王, 莉 田 申請人:黑龍江強爾生化技術開發有限公司