一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質及其分離純化方法

專利名稱：一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質及其分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質及其分離純化方法。
背景技術：
任何一種生物在自然界都不可能是孤立的存在，各種生物能夠生存，都得益于其自身防御機制。植物、微生物等能夠合成一些小分子抗生物質，如酚類(Phenols)、黑色素(Melanins)、丹寧酸(Tannins)或植物凝集素類(Phytoalexins)等物質。其次還能合成抗菌蛋白質，抗菌蛋白質是由基因編碼的生物大分子，抗菌蛋白質從類型上可以分為是誘導型表達抗菌蛋白質和組成型表達抗菌蛋白質。抗菌蛋白質的作用主要是抵抗病原菌的入侵，提高生物體本身的抗病性，維護生命活動的延續和正常活動。抗菌蛋白質研究在最近幾年取得了很大進展，隨著蛋白質研究術、分離和純化技術的深入以及生物質譜技術的飛速發展，人們對抗菌蛋白質的研究和認識不斷的深入，對自然界各種生物的自身防御體系有了進一步的認識。人們已大量從動物、植物、和微生物中分離和純化到多種抗菌蛋白質，幾乎每天都有新的發現，目前人們已經發現了數以百計的抗菌蛋白質和抗菌肽。
枯草芽孢桿菌是一種有益的土壤細菌。枯草芽孢桿菌具有發達的分泌系統和較強的適應性，抗逆性。在農業生產中廣泛應用。枯草芽孢桿菌對多種病原菌具有拮抗性能，生產中用于防治多種植物病害。在防治芒果的軟腐病、辣椒炭疽病、蘋果輪紋病、水稻紋枯病、水稻白葉枯病和一些鐮刀菌引起的病害中均有應用。
枯草芽孢桿菌分泌的抗菌物質種類較多，主要有兩種，低分子量抗菌素和抗菌蛋白質。目前已鑒定的枯草芽孢桿菌產生的抗生素有數十種，主要是脂肽類和肽類化合物。如非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)和fengycin，這類抗菌素分子量比較小，研究已經有近50年的歷史。
抗菌蛋白質的研究在最近十多年也有開展。劉伊強，王雅平從枯草芽孢桿菌TG26中，在70％的(NH4)2SO4飽和度時分離到一個分子量14.5kD左右，等電點為5.58；該抗菌蛋白質中富含谷氨酸、酪氨酸和脯氨酸，屬于一種具有活性的偏酸性蛋白，同時該蛋白在高溫高壓處理后仍保持大部分活性，對熱穩定，對蛋白酶和胰蛋白酶部分敏感，該蛋白質對Gibberellazeae有較強的抗菌活性(參見ZL 92112764.2)；童有仁、馬志超等分離了枯草芽孢桿B034拮抗蛋白質，在70％的(NH4)2SO4飽和度時獲得了分子量50.3KD，等電點6.25抗菌的蛋白質，該蛋白質對水稻白葉枯病菌有拮抗作用，作者對其部分序列進行了測定；謝棟等從枯草芽孢桿菌BS-98中分離到抗菌蛋白質X98III，分子量為59kD，等電點為4.5，該蛋白質對蘋果輪紋病菌(Physalospora piricola)有較強的抗菌活性；林東，劉憶舟等分離了枯草芽孢桿菌SO113分泌的抗菌蛋白質，對水稻白葉枯病菌具有很好的抑制作用；研究表明Bacillus subtilis SO113至少能分泌2種抗菌蛋白(在pH6.0時至少一種帶負電，另一種帶正電)，且這些抗菌蛋白都是由染色體編碼的。
有許多學者研究了枯草芽孢桿菌的抗菌物質，但主要集中于對粗提物的理化性質的研究，未明確確定抗菌物質的組成，活性成分。上述抗菌物質的研究多數集中于小分子抗菌素的研究，研究抗菌蛋白質的也未明確揭示抗菌蛋白質的組成、也未利用生物質譜技術對抗菌蛋白質進行鑒定，抗菌蛋白質的生物功能并不清楚，也未見克隆抗菌蛋白質的功能基因的報道。
枯草芽孢桿菌Bs-916是從土壤分離獲得的對水稻紋枯病菌有較好拮抗作用的菌株，并于2002年9月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.0808，江蘇省農業科學院曾經用枯草芽孢桿菌Bs-916(保藏號為CGMCC No.0808)與井岡霉素復配申請了專利(專利號ZL 02138379.0，證書編號199610)。近幾年將枯草芽孢桿菌Bs-916大面積應用于防治水稻紋枯病取得了比較理想的效果，但對枯草芽孢桿菌Bs-916的胞外抗菌蛋白質沒有深入研究，也未見有相關的文獻報道。

發明內容
本發明的目的在于通過對枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質的研究，尤其是對枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白質的研究，揭示Bs-916的抗菌作用和抗菌機制，前期研究了Bs-916對幾種植物病原菌的抗菌活性及其毒力效果，并在此基礎上向社會提供一種新的枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質及其分離純化方法。
本發明的目的是這樣實現的一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質，其特征在于經SDS-PAGE檢測，其分子量大約為41.9kD；經過胰蛋白酶消解后，用基質輔助激光解吸附離子化-飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)進行鑒定，胞外抗菌蛋白質存在26個質荷比峰(m/z)，他們分別是849.390、874.44、1016.58、1108.56、1178.60、1184.65、1191.65、1207.60、1244.65、1298.56、1478.79、1513.91、1529.89、1536.63、1572.83、1588.84、1888.83、2104.06、2163.01、2265.13、2299.04、2309.04、2324.97、2511.04、2526.97和2542.99；再經過電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜(Q-TOF2)分析后獲得五個肽的氨基酸序列，氨基酸序列分別為VTIVDEKGR，FSFSDVHNR，VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK；胞外抗菌蛋白質和枯草芽孢桿菌的草酸鹽脫羧酶、地衣芽孢桿菌的草酸鹽脫羧酶具有顯著的相關性。
在本發明中，所述的胞外抗菌蛋白質具有廣譜的抗菌活性。所述的廣譜抗菌活性是指對擔子菌亞門、子囊菌亞門、半知菌亞門的病原菌具有抗菌活性。
在本發明中，所述的胞外抗菌蛋白質具有核糖核酸酶活性和凝集素活性。
一種如上所述的枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質的分離純化方法，其特征在于
a)從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離粗蛋白質；b)將粗蛋白質用DEAE Sepharose F.F.分離后，在紫外光OD280nm處檢測，有A、B、C三個吸收峰，其中B峰收集液具有抑菌活性，經SDS-PAGE檢測，B峰收集液不是單一蛋白質條帶。
c)將B峰收集液再經Phenyl Sepharose 6F.F.分離后，在紫外光OD 280nm檢測，有D、E兩個吸收峰，其中E峰收集液具有抑菌活性，經SDS-PAGE檢測，E峰也不是一個蛋白質條帶。
d))E峰收集液經羥基磷石灰石柱分離后，在紫外光OD 280nm檢測，有F、G兩個主峰，其中G峰收集液具有抑菌活性，將G峰收集液經SDS-PAGE檢測，G峰收集液中只有1個蛋白質帶，其分子量大約為41.9kD；G峰各管收集液中的蛋白質即為純化獲得的Bs-916的胞外抗菌蛋白質。
在本發明的分離純化方法中所述的從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離粗蛋白質是將枯草芽孢桿菌Bs-916移入YPG(酵母膏5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，水1000ml)培養液中，28℃下120r/min振蕩培養48h，4℃10000rpm離心10min，濾去菌體，用細菌濾器真空抽濾，獲得枯草芽孢桿菌Bs-916的無菌濾液，再將硫酸銨加入至枯草芽孢桿菌Bs-916的無菌濾液中，硫酸銨的飽和度為100％，4℃下過夜后，12000rpm離心25min，去上清，沉淀物用0.067mol/L的磷酸緩沖液洗下，置于透析袋中，4℃透析48h后，獲取抗菌粗蛋白質。
本發明的優點在于本發明是一種從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離純化獲得新的胞外抗菌蛋白質，它表現出多種生物功能抗菌蛋白質表現出廣譜的抗菌活性，對擔子菌亞門、子囊菌亞門、半知菌亞門的多種病原菌表現出廣譜的抗菌活性，特別指出，該抗菌蛋白質對Alternaria屬的病原菌具有很高的毒力，目前生產上對由Alternaria屬病原菌引起的早疫病害缺乏有效的防治措施；抗菌蛋白質廣譜的抗菌活性對保護作物天然品質、減少農藥殘留具有廣泛應用前景；同時，抗菌蛋白質還表現出核糖核酸酶活性和凝集素活性，具有多種生物功能。


圖1是抗菌粗蛋白質經的DEAE Sepharose Fast Flow柱層析圖；圖2是抗菌粗蛋白質B峰收集液經Phenyl Sepharose 6F.F.柱層析圖；圖3是抗菌粗蛋白質E峰收集液經羥基磷石灰石柱的層析圖；圖4是抗菌蛋白質的SDS-PAGE電泳圖；圖5是抗菌蛋白質對水稻紋枯病菌的抑制作用；圖6是抗菌蛋白質對水稻稻瘟病菌的抑制作用；圖7是抗菌蛋白質對油菜菌核病菌的抑制作用；圖8是抗菌蛋白質對甘藍黑斑病菌的抑制作用；圖9是抗菌蛋白質對白菜黑斑病菌的抑制作用；圖10是抗菌蛋白質對灰霉病菌的抑制作用；圖11是抗菌蛋白質的核糖核酸酶活性測定結果；圖12是抗菌蛋白質的MALDI-TOF-MS的胰蛋白酶酶切肽圖；圖13是電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜解析的第1條肽氨基酸序列圖；圖14是電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜解析的第2條肽氨基酸序列圖；圖15是電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜解析的第3條肽氨基酸序列圖；圖16是電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜解析的第4條肽氨基酸序列圖；圖17是電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜解析的第5條肽氨基酸序列圖。
具體實施例方式
實施例1將枯草芽孢桿菌Bs-916移入YPG培養液中(所述的YPG培養液為胰蛋白胨5g、葡萄糖5g、酵母膏5g)，28℃下120r/min振蕩培養48h，4℃10000rpm離心10min，濾去菌體，用細菌濾器真空抽濾，獲得枯草芽孢桿菌Bs-916的無菌濾液，再將硫酸銨加入至枯草芽孢桿菌Bs-916的無菌濾液中，硫酸銨的飽和度為100％，4℃下過夜后，12000rpm離心25min，去上清，沉淀物用0.067mol/L的磷酸緩沖液洗下，置于透析袋(截留分子量為8～10KD)中，4℃透析48h后，獲取袋內物質，即為抗菌粗蛋白質。
取上述制備的胞外粗蛋白質，過DEAE Sepharose Fast Flow(Amersh-am生產)層析柱，柱體積25ml。DEAE Sepharose Fast Flow柱層析采用步行法層析。層析柱預先用0.1M NaCl-25mMTris-HCl(pH8.01)平衡后，上樣品10ml后，分別采用0.25M，0.50M和1M NaCl-25mMTris-HCl(pH8.01)進行分步層析，分別收集，每管收集2.0ml。層析流速1ml/min，上樣流速1ml/min。共檢測到三個蛋白質吸收峰(A、B、C)(見圖1)，檢測各收集管對水稻紋枯病菌的抑菌活性，其中B峰具有抑菌活性。SDS-PAGE電泳檢測具有抗菌功能收集液的蛋白質的組成。將具有抑菌活性的B峰再過Phenyl Sepharose 6F.F.層析柱，(Ame-rsham預裝柱，柱體積為1ml)。Phenyl Sepharose 6F.F.采用梯度層析。先用2M(NH4)2SO4-25mMTris-HCl，平衡層析柱后，上樣B峰收集液6ml，采用2M(NH4)2SO4-25mM Tris-HCl-0-25mMTris-HCl梯度洗脫，每管收集1.5ml。析流速1ml/min，上樣流速1ml/min。共獲得二個吸收峰(D、E)(見圖2)，檢測各收集液對水稻紋枯病菌的抑菌活性，其中E峰收集液具有抑菌活性。SDS-PAGE電泳檢測具有抗菌的蛋白質的組成E峰不是單一的蛋白質條帶。將經Phenyl Sepharose 6F.F.層析柱層析后具有抑菌活性的F峰收集液用羥基磷石灰石柱層析，柱體積為1ml，采用梯度法洗脫。采用20mM磷酸緩沖液平衡緩沖體系，上樣后用20mM磷酸緩沖液洗脫不能吸附的蛋白質，再用20mM-0.6M磷酸緩沖液梯度洗脫20個柱體積，流速為1ml/min，上樣流速為1ml/min。分管收集，每管收集1.5ml，測定有蛋白質吸收峰的各管收集液對水稻紋枯病菌的抑菌活性。共獲得二個峰(F、G)(見圖3)，其中G峰具有抑菌活性，SDS-PAGE電泳檢測具有抗菌的蛋白質的組成，發現G峰為單一的蛋白質條帶，(見圖4，圖中1為標準分子量的蛋白質，2為本抗菌蛋白質)。
SDS-PAGE電泳采用垂直板電泳，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％。層析系統為AKTA Explore低壓層析系統(Amersham AKTAExplore system)。
實施例2抗菌蛋白質抑菌譜測定采用濾紙片法。病原菌分別為水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、甘藍黑斑病菌(Alternaria oleracea)、白菜黑斑病菌病菌(A.brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)。將上述病原菌培養于PDA培養基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000ml)上，待長出新鮮菌落后，用打孔器將上述病原菌制成6.5mm的菌絲塊，將新鮮菌絲塊分別移入PDA培養基平板中央，待菌絲生長后，在距離菌絲快25mm處對角線放置無菌濾紙片(直徑65mm)，一側加入分離的抗菌蛋白質，另一側加入0.067M磷酸緩沖液作為對照。每處理重復3次。待菌絲生長至對照處時觀察抗菌蛋白質對不同病原菌的抑菌活性。發現抗菌蛋白質對擔子菌亞門，如水稻紋枯病菌(見圖5)、對子囊菌亞門，如水稻稻瘟病菌(見圖6)，油菜菌核病菌病原菌(見圖7)等病菌；對半知菌亞門，如白菜黑斑病菌(見圖9)、甘藍黑斑病菌(見圖8)、灰霉病菌(見圖10)等具有較強的抑菌抗菌活性。
測定了抗菌蛋白質對水稻紋枯病菌、甘藍黑斑病菌、白菜黑板病菌、灰霉病菌的EC50。將抗菌蛋白質分成3個劑量分別加入到8ml 45℃的PDA培養基中，迅速倒入無菌平板。對照加入緩沖液。將上述病原菌分別移入到PDA平板的中央，待對照張滿平板后，量取菌落直徑，計算抗菌蛋白質對病原菌的抑制率，計算抗菌蛋白質對不同病原菌的EC50。
抗菌蛋白質對幾種病原菌的毒力測定結果表明，抗菌蛋白質對水稻紋枯病的EC50為2.740μM；灰霉病菌的EC50為4.011μM；對白菜黑斑病菌的EC50為0.055μM；對甘藍黑斑病菌的EC50為0.087μM。結果顯示枯草芽孢桿菌Bs-916胞外抗菌蛋白質尤其對Alternaria屬的病原菌具有較高的毒力，對甘藍黑斑病菌、白菜黑板病菌的EC50分別為水稻紋枯病菌的1/49.8和1/31.5(見表1)。
表1是抗菌蛋白質對幾種病原菌的抑制中量(EC50)

實施例3凝集素活性的測定方法離心獲得兔子紅細胞，用PBS緩沖液(pH 7.2)將兔子紅細胞配制成2％的懸浮液。抗菌蛋白質進行雙倍數稀釋，在20℃下，每濃度分別取50μl和2％的兔子紅細胞PBS懸浮液50μl在U型盤(U-Plates)中混合均勻，在測定不同濃度下，用無蛋白質的磷酸緩沖液作為對照。20℃下靜置大約1小時后，等到對照紅細胞全部沉淀后，觀察處理中的紅細胞凝集狀況。凝集素的單位(The hemagglutination titer)的定義最高稀釋倍數下仍然呈現凝集素活性，這個濃度就是該蛋白質的一個凝集素單位(one titer)，蛋白質的凝集素活性是以每毫克的有多少個凝集素活性單位來表示的。應用上述方法測定，結果表明該蛋白質具有凝集素活性。
核糖核酶酸活性的測定采用酵母tRNA的方法測定抗菌蛋白質的核糖核酸酶活性。酵母tRNA按照200μg溶于150μl 100mM MES(pH 6.0)，取150μl和抗菌蛋白質混合，至于37℃下1小時進行反應。反應結束時加入3.4％的高氯乙酸350μl中止反應，冰浴15分鐘后，4℃下離心(15000g，15min)。測定上清液OD260。結果表明，該抗菌蛋白質具有核糖核酸酶活性(見圖11)。
實施例4抗菌蛋白質的基質協助激光解吸附離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜(Q-TOF)分析由中國軍事醫學院生物測試中心測定，質譜數據檢索利用網絡資源(www.matrixscience.com)。鑒定結果表明抗菌蛋白質的MALDI-TOF-MS數據獲得26個質荷比峰(m/z)(見圖12)，他們分別是849.390、874.44、1016.58、1108.56、1178.60、1184.65、1191.65、1207.60、1244.65、1298.56、1478.79、1513.91、1529.89、1536.63、1572.83、1588.84、1888.83、2104.06、2163.01、2265.13、2299.04、2309.04、2324.97、2511.04、2526.97和2542.99。在Matrix Science數據庫中鑒定，共發現有20個(類)蛋白質質譜數據有匹配，但相關性并不顯著。
電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜(Q-TOF)結果表明，枯草芽孢桿菌B-916胞外抗菌蛋白質共獲得5條肽的氨基酸序列，它們分別為VTIVDEKGR(圖13)，FSFSDVHNR(圖14)，VYIADSTNFK(圖15)，ELPISENLASVNMR(圖16)，EAEWAYMITGK(圖17)。在Matrix Science數據庫中鑒定，發現有2個蛋白質具有相關性。分別為枯草芽孢桿菌的脫羧酶和地衣芽孢桿菌的脫羧酶具有同源性。但對這兩個蛋白質的抗菌性能及其核糖核酸酶活性、凝集素活性未見報道。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質，其特征在于經SDS-PAGE檢測，其分子量大約為41.9kD；經過胰蛋白酶消解后，用基質輔助激光解吸附離子化-飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)進行鑒定，胞外抗菌蛋白質存在26個質荷比峰m/z，他們分別是849.390、874.44、1016.58、1108.56、1178.60、1184.65、1191.65、1207.60、1244.65、1298.56、1478.79、1513.91、1529.89、1536.63、1572.83、1588.84、1888.83、2104.06、2163.01、2265.13、2299.04、2309.04、2324.97、2511.04、2526.97和2542.99；再經過電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜(Q-TOF2)分析后獲得五個肽的氨基酸序列，氨基酸序列分別為VTIVDEKGR，FSFSDVHNR，VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK；胞外抗菌蛋白質和枯草芽孢桿菌的草酸鹽脫羧酶、地衣芽孢桿菌的草酸鹽脫羧酶具有顯著的相關性。
2.根據權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質，其特征在于所述的胞外抗菌蛋白質具有廣譜的抗菌活性。
3.根據權利要求2所述的一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質，其特征在于所述的廣譜抗菌活性是指對擔子菌亞門、子囊菌亞門、半知菌亞門的病原菌具有抗菌活性。
4.根據權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質，其特征在于所述的胞外抗菌蛋白質具有核糖核酸酶活性和凝集素活性。
5.一種如權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質的分離純化方法，其特征在于a)從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離粗蛋白質；b)將粗蛋白質用DEAE Sepharose F.F.分離后，在紫外光OD 280nm處檢測，有A、B、C三個吸收峰，其中B峰收集液具有抑菌活性，經SDS-PAGE檢測，B峰收集液不是單一蛋白質；c)將B峰收集液再經Phenyl Sepharose 6F.F.分離后，在紫外光OD 280nm檢測，有D、E兩個吸收峰，其中E峰收集液具有抑菌活性，經SDS-PAGE檢測，E峰也不是一個蛋白質條帶；d)E峰收集液經羥基磷石灰石柱分離后，在紫外光OD 280nm檢測，有F、G兩個主峰，其中G峰收集液具有抑菌活性，將G峰收集液經SDS-PAGE檢測，G峰收集液中只有1個蛋白質條帶，其分子量大約為41.9kD；G峰各管收集液中的蛋白質即為純化獲得的Bs-916的胞外抗菌蛋白質。
6.根據權利要求5所述的一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質的分離純化方法，其特征在于所述的從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離粗蛋白質是將枯草芽孢桿菌Bs-916移入YPG培養液中，28℃下120r/min振蕩培養48h，4℃10000rpm離心10min，濾去菌體，用細菌濾器真空抽濾，獲得枯草芽孢桿菌Bs-916的無菌濾液，再將硫酸銨加入至枯草芽孢桿菌Bs-916的無菌濾液中，硫酸銨的飽和度為100％，4℃下過夜后，12000rpm離心25min，去上清，沉淀物用0.067mol/IL的磷酸緩沖液洗下，置于透析袋中，4℃透析48h后，獲取抗菌粗蛋白質。
全文摘要
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌的胞外抗菌蛋白質及其分離純化方法。胞外抗菌蛋白質的分子量約為41.9kD；經過胰蛋白酶消解后，質譜鑒定存在26個質荷比峰(m/z)；由電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜獲得五個肽的氨基酸序列VTIVDEKGR，FSFSDVHNR，VYIADSTNFK，ELPISENLASVNMR，EAEWAYMITGK；其分離純化方法是從枯草芽孢桿菌Bs－916中分離粗蛋白質后，用DEAE Sepharose F.F.分離，將其中的B峰收集液再經Phenyl Sepharose 6 F.F.分離，將其中的E峰收集液經羥基磷石灰石柱分離，獲得的G峰收集液即為純化的胞外抗菌蛋白質。該蛋白質具有廣譜的抗菌活性、核糖核酸酶活性和凝集素活性。
文檔編號C12N9/88GK1974597SQ20061009784
公開日2007年6月6日 申請日期2006年11月15日 優先權日2006年11月15日
發明者劉永鋒, 陳志誼 申請人:江蘇省農業科學院