專利名稱：用細胞工程培養的泛生墻蘚原絲體制備的動物拒食劑的制作方法
技術領域：
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本發明涉及一種用細胞工程培養的泛生墻蘚原絲體制備的動物拒食劑，屬生物技術 領域。
背景技術：
在植物界，苔蘚植物是由一類水生生活轉為陸生生活過渡型的植物類群，是地球上 陸生植物中最古老的種群之一。目前地球上包括南極在內除5000米以上高山及海洋外， 在不同的生態系統中均有苔蘚植物的足跡。苔蘚植物隸屬于高等植物中的孢子植物，全 世界約有23000種，種數僅次于被子植物，是植物界中的一個重要門類。
由于苔蘚植物分布廣，生境多樣化以及對惡劣環境的特殊適應機制，多數的苔蘚植 物能產生特別豐富的次生代謝物質，如單萜和倍半萜類化合物等。苔蘚植物被認為是生 物活性物質的源泉。在民間，苔蘚植物被廣泛用于治療創傷、燒傷、感染、肺結核、神 經衰弱、驚厥、燙傷和肺炎等癥。
另外，幾乎所有的苔蘚植物都不被各種動物所采食，也不被細菌、真菌或病毒所感 染，所有這些都表明苔蘚中存在著一些活性物質作為自身保護劑，來抵御外界的有害刺 激，例如，德國農場主曾用田邊采集到的苔蘚用水勻漿后噴灑在巻心菜上防止蟲害；婁 紅祥等發現苔蘚的某些成分可以有效抵抗HIV病毒等。由于苔蘚植物含有多種類型化合 物，而且許多化合物表現出良好的生物活性，因此苔蘚植物有可能成為前景廣闊的農用、 藥用植物資源，造福人類。然而，苔蘚植物形體小，混雜叢生，種間不易區別和分離， 單獨一種苔蘚的人工培養繁殖還沒有成熟體系，某些種類采集足夠量的樣品又比較困 難，導致了苔蘚植物相關產品的研究開發面臨原料困境。植物的組織培養技術恰恰可以 解決這一難題，利用快速繁殖技術，能在相對較短的時間內，獲得大量單一種類的純凈 的材料，即能用于研究，又能為利用苔蘚制備各種活性制劑提供大量原材料。
參考文獻 Stefan A. Rensing, Daniel Lang, Andreas D. Zimmer, et al. The Physcomitrella Genome Reveals
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發明內容
本發明的目的在于將通過細胞工程的方法獲得大量發育程度一致的泛生墻蘚原絲 體，并將其用作原料，用乙醇提取粗提物制備動物拒食制劑。
本發明是這樣實現的
一、泛生墻蘚原絲體的獲得和大量繁殖 1、泛生墻蘚成熟孢子的無菌萌發獲得初生原絲體
泛生墻蘚成熟孢子的無菌初生原絲體的獲得經由成熟孢子的滅菌、固體培養基上的 萌發得到，具體歩驟如下
(1) 成熟孢子的滅菌
挑選泛生墻蘚成熟飽滿的孢蒴，從孢蒴以下1—2cm，蒴柄中間部分剪斷，用清水洗 凈孢蒴表面，然后用體積濃度75%的酒精浸泡孢蒴，預消毒組織表面0.5-l分鐘；而后 用含1. 0g/L的氯化汞和1, 0%餐洗劑的溶液對孢蒴表面進行消毒，處理時間為3-5分鐘； 再用滅菌水反復浸泡清洗孢蒴4次，洗凈材料孢蒴表面的氯化汞和洗滌劑殘留；然后用 無菌鑷子固定蒴柄，以無菌眼科剪刀橫向切斷孢蒴頂部，暴露出內部的孢子，用鑷子擠 出孢子到盛有無菌水的離心管中，使孢子分散懸浮起來；將盛有孢子的離心管密封好， 在4(TC的水浴中刺激40-50秒；
(2) 固體培養基上的萌發
在無菌條件下，取密度為104-106/ml的孢子，接種到改良的MS培養基(添加了 2， 4_ 二氯苯氧基乙酸(2， 4-Dichlorophe駆yacetic acid，簡稱2， 4-D) 2-5mg/L，
5硅酸鈉2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS培養基)中。培養溫度為25°C±3°C，光照度 為40001x。 10-20天之后就可以獲得由孢子萌發的初生原絲體。
2、原絲體的大量繁殖及收集
原絲體的大量繁殖及收集由搖瓶培養或發酵罐通氣培養后經離心或過濾工序得到， 具體如下
(1)原絲體的大量繁殖 用鑷子輕輕夾取體積為10-1000mn^的萌發原絲體，接種到添加了2， 4-D 2-5mg/L， 硅酸鈉2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液體培養基的體積為50-1000ml三角瓶中，每 個三角瓶中加入的培養液為三角瓶容積的1/3-1/2， 120rpm搖床培養7-10天，環境溫 度控制在25土3'C，光源為漫射光；隨后用相同的培養基和控制條件進行轉瓶培養7-15 后獲得大量原絲體。如需要更大的量，則在無菌條件下，將培養得到的原絲體連同培養 液倒入玻璃發酵罐中，加入3 — 10倍體積的新鮮培養液，底部通入無菌空氣(200L/小 時)，使得培養液中的原絲體不斷翻騰，以發酵罐底部無永久沉積的原絲體為標準，培 養7—15天后，停止進氣，待原絲體沉入罐底后，用蠕動泵在無菌條件下緩慢將處于罐 體上部的培養液抽出2/3，再加入新鮮無菌培養液至原初體積的5倍，繼續重復擴大培 養，如此可反復至罐體最大容積為止，即能獲得更大量的原絲體。
(2)原絲體的收集
將培養瓶中的全部混懸液倒入離心管中，在800rpm/min (轉/分)離心2分鐘， 棄去上清液，回收得到原絲體；發酵罐中的大量原絲體可以用4一8層紗布過濾收 集獲得。
二、動物拒食制劑的制備 動物拒食制劑經乙醇提取工序得到。具體如下
1. 收集的原絲體用0. 5倍體積的90%乙醇研磨，再加入10-100倍體積的75%乙醇， 在5(TC溫度下密閉提取4-8小時，再在35-5(TC溫度下用旋轉蒸發儀去除乙醇及水，至 最后20min回收溶劑體積不會變化時，獲得動物拒食的濃縮膠狀粗提物；
2. 收集的原絲體也能用8(TC烘干后保存，待需要使用時，將烘干的原絲體在50'C 溫度下，先用1-2倍體積的75%乙醇浸泡l-2小時，然后研磨，其余步驟同鮮活原絲體。
本發明具有制備方法簡便、環保、動物拒食效果佳的優點。
具體實施例方式
以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。實施例中的高抗紫外線細 胞克隆按照發明內容部分所述的方法獲得。
61、泛生墻蘚成熟孢子的無菌萌發獲得初生原絲體
泛生墻蘚成熟孢子的無菌初生原絲體的獲得經由成熟孢子的滅菌、固體培養基上的 萌發得到，具體步驟如下-
(1) 成熟孢子的滅菌挑選泛生墻蘚成熟飽滿的孢蒴，從孢蒴以下lcm，蒴柄中 間部分剪斷，用清水洗凈孢蒴表面，然后用體積濃度75%的酒精浸泡孢蒴，預消毒組織 表面0. 5分鐘；而后用濃度為1. 0g/L的氯化汞和1. 0%餐洗劑的溶液對材料孢蒴表面進 行消毒，處理時間為3分鐘；再用滅菌水反復浸泡清洗孢蒴4次，洗凈材料孢蒴表面的 氯化汞和洗滌劑殘留；然后用無菌鑷子固定蒴柄，以無菌眼科剪刀橫向切斷孢蒴頂部， 暴露出內部的孢子，用鑷子擠出孢子到盛有無菌水的離心管中，使孢子分散懸浮起來； 將盛有孢子的離心管密封好，在4(TC的水浴中刺激40秒；
(2) 固體培養基上的萌發在無菌條件下，取密度107ral的孢子，接種到添加了
2， 4-二氯苯氧基乙酸2mg/L，硅酸鈉2. Og/L，蔗糖2. 0%、 pH5. 8的MS培養基中，培養 溫度為25土3'C,光照度為40001x， IO天后獲得由孢子萌發的初生原生體。
2.原絲體的大量繁殖及收集
用鑷子輕輕夾取體積為10mn^萌發的原絲體，接種到添加了2， 4-D 2mg/L，硅酸 鈉2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液體培養基的體積為50ml三角瓶中，每個三角瓶 中加入的培養液為三角瓶容積的1/3， 120rpm搖床培養7天，環境溫度控制在25±3 °C，光源為漫射光；隨后用相同的培養基和控制條件將得到的原絲體轉入大瓶中培養， 7后獲得大量原絲體，隨后將培養瓶中的全部混懸液倒入離心管中，800rpm/min (轉/ 分)離心2分鐘，棄去上清液，即能回收得到原絲體。
3、動物拒食制劑的制備
收集的原絲體用0. 5倍體積的90%乙醇研磨，再加入20倍體積的75%乙醇，在50°C 溫度下密閉提取5小時，再在45。C溫度下用旋轉蒸發儀去除乙醇及水，至最后20min 回收溶劑體積不會變化時，即獲得膠狀粗提物。
在防止煙青蟲和蚜蟲危害煙葉試驗中，將上述膠狀物用蒸餾水稀釋2000倍后，加 入O. 1%的表面活性劑，如十二烷基璜酸鈉后均勻噴灑在煙葉表面，即能達到驅趕煙青 蟲和蚜蟲的作用。
實施例2:
基本同實施例l，不同之處在于 l.泛生墻蘚成熟孢子的無菌萌發獲得初生原絲體時，75%的酒精預消毒時間為1分
7鐘，氯化汞消毒5分鐘，水浴刺激時間為50秒，固體培養基上的萌發時，孢子密度為 107ml， 2， 4-D濃度為5 mg/L。
2.原絲體的大量繁殖及收集中 用鑷子輕輕夾取體積為200mm3原絲體，接種到添加了 2，4-D 5mg/L，硅酸鈉2.0g/L， 庶糖2.0%、 pH5.8的MS液體培養基的體積為500ml三角瓶中，每個三角瓶中加入的培 養液為三角瓶容積的1/3，120rpm搖床培養7天，環境溫度控制在24°C，光源為漫射 光；隨后用相同的培養基和控制條件進行轉瓶培養，12天后獲得大量原絲體。
這些培養瓶中的原絲體全部用于轉瓶擴大繁殖，在無菌條件下，將500ml三角培養 瓶中的原絲體及其培養液全部倒入玻璃發酵罐，加入1000ml新鮮培養液，底部通入無 菌空氣200L/小時，使得培養液中的原絲體不斷翻騰，培養15天后，停止進氣，待原絲 體沉入罐底后，用蠕動泵在無菌條件下緩慢將處于罐體上部的培養液抽出2/3，再加入 新鮮無菌培養液2500ml，繼續重復擴大培養，15天后重復上述步驟，加入新鮮無菌培 養液至罐體最大有效容積10L為止，培養8天后將全部罐內物體全部倒出，用純6層紗 布過濾清洗后得到大量的原絲體，
3、 動物拒食制劑的制備
收集的原絲體用0. 5倍體積的90%乙醇研磨，再加入20倍體積的75%乙醇，在5CTC 溫度下密閉提取5小時，再在45r溫度下用旋轉蒸發儀去除乙醇及水，至最后20min 回收溶劑體積不會變化時，即獲得膠狀粗提物。
在防止蝸牛啃食巻心菜的試驗中，將上述膠狀物用蒸餾水稀釋1200倍后，加入O. 1 %的表面活性劑，如十二垸基璜酸鈉后均勻噴灑在巻心菜表面，即達到防止蝸牛啃食的 作用。
實施例3:
基本同實施例l，不同之處在于
1. 成熟孢子的滅菌時，75%的酒精浸泡孢蒴，預消毒組織表面1.5分鐘，氯化汞消 毒3分鐘，水浴刺激時間為45秒。
2. 固體培養基上的萌發時，孢子密度為107ml， 2， 4-D濃度為3mg/L。
3. 原絲體的大量繁殖及收集中
用鑷子輕輕夾取體積為1000mm3原絲體，接種到添加了 2， 4-D3mg/L,硅酸鈉2.0g/L， 蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液體培養基的體積為1000ml三角瓶中，每個三角瓶中加入的 培養液為三角瓶容積的1/3， 120ipm搖床培養7天，環境溫度控制在24"，光源為漫 射光；隨后用相同的培養基和控制條件進行轉瓶培養，12天后獲得大量原絲體。
4、 動物拒食制劑的制備中5個1000ml培養瓶中回收干燥后的原絲體先用2倍 體積的75%乙醇浸泡1小時，然后研磨，再加入20倍體積的75%乙醇，在45。C溫度下密閉提取5小時，再在5(TC溫度下用旋轉蒸發儀去除乙醇及水，至最后20min回收溶 劑體積不會變化時，即獲得膠狀粗提物。
在防止蝸牛啃食煙葉的試驗中，將上述膠狀物用蒸餾水稀釋IOOO倍后，加入0.1% 的表面活性劑，如十二垸基璜酸鈉后均勻噴灑在菜葉表面，即達到防止 蝸牛啃食的作用。
9
權利要求
1、一種用細胞工程培養的泛生墻蘚原絲體制備的動物拒食劑，其特征在于該動物拒食劑經以下工序得到a. 成熟孢子的滅菌挑選泛生墻蘚成熟飽滿的孢蒴，從孢蒴以下1—2cm，蒴柄中間部分剪斷，用清水洗凈孢蒴表面，然后用75％的酒精浸泡孢蒴，預消毒組織表面0.5-1分鐘；而后用含1.0g/L的氯化汞和1.0％餐洗劑的溶液對孢蒴表面進行消毒，處理時間為3-5分鐘；再用滅菌水反復浸泡清洗孢蒴4次，洗凈材料孢蒴表面的氯化汞和洗滌劑殘留；然后用無菌鑷子固定蒴柄，以無菌眼科剪刀橫向切斷孢蒴頂部，暴露出內部的孢子，用鑷子擠出孢子到盛有無菌水的離心管中，使孢子分散懸浮起來；將盛有孢子的離心管密封好，在40℃的水浴中刺激40-50秒；b. 固體培養基上的萌發在無菌條件下，取密度為104-106/ml的孢子，接種到添加了2，4-二氯苯氧基乙酸2-5mg/L，硅酸鈉2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培養基中，在培養溫度為25℃±3℃，光照度為40001x的條件下培養10-20天后獲得由孢子萌發的初生原絲體；c. 原絲體的大量繁殖及收集用鑷子輕輕夾取體積為10-1000mm3萌發的原絲體，接種到添加了2，4-D 2-5mg/L，硅酸鈉2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液體培養基的體積為50-1000ml三角瓶中，每個三角瓶中加入的培養液為三角瓶容積的1/3-1/2，120rpm搖床培養7-10天，環境溫度控制在25±3℃，光源為漫射光；隨后用相同的培養基和控制條件進行轉瓶培養7-15后獲得大量原絲體；如需要更大的量，則在無菌條件下，將培養得到的原絲體連同培養液倒入玻璃發酵罐中，加入3—10倍體積的新鮮培養液，底部按200L/小時通入無菌空氣，使得培養液中的原絲體不斷翻騰，以發酵罐底部無永久沉積的原絲體為標準，培養7—15天后，停止進氣，待原絲體沉入罐底后，用蠕動泵在無菌條件下緩慢將處于罐體上部的培養液抽出2/3，再加入新鮮無菌培養液至原初體積的5倍，繼續重復擴大培養，如此反復至罐體最大容積為止，即獲得更大量的原絲體；收集原絲體時，將三角瓶中培養的原絲體全部混懸液倒入離心管中，在800rpm/min下離心2分鐘，棄去上清液，即得到原絲體；發酵罐中的大量原絲體用4—8層紗布過濾收集獲得；d. 動物拒食制劑的制備收集的原絲體用0.5倍體積的90％乙醇研磨，再加入10-100倍體積的75％乙醇，在50℃溫度下密閉提取4-8小時，再在35-50℃溫度下用旋轉蒸發儀去除乙醇及水，至最后20min回收溶劑體積不會變化時，即獲得動物拒食的濃縮膠狀粗提物；收集的原絲體也能在80℃烘干后保存，待需要使用時，將烘干的原絲體在50℃溫度下，先用1-2倍體積的75％乙醇浸泡1-2小時，然后研磨，隨后加入10-100倍體積的75％乙醇，其余提取步驟同剛收集的新鮮原絲體。
全文摘要
本發明涉及一種用細胞工程培養的泛生墻蘚原絲體制備的動物拒食劑，屬生物技術領域。本發明的動物拒食劑經以下工序得到由細胞工程方法繁殖得到的泛生墻蘚原絲體用0.5倍體積的90％乙醇研磨，再加入10-100倍體積的75％乙醇，在50℃溫度下密閉提取4-8小時，再在35-50℃溫度下用旋轉蒸發儀去除乙醇及水，至最后20min回收溶劑體積不會變化時，即獲得動物拒食的濃縮膠狀粗提物；收集的原絲體也能在80℃烘干后保存，待需要使用時，將烘干的原絲體在50℃溫度下，先用1-2倍體積的75％乙醇浸泡1-2小時后研磨，隨后加入10-100倍體積的75％乙醇，其余步驟同鮮活原絲體。本發明具有制備方法簡便、環保、動物拒食效果佳的優點。
文檔編號A01N65/00GK101485342SQ200910094148
公開日2009年7月22日 申請日期2009年3月2日 優先權日2009年3月2日
發明者鴿 張, 李育中, 汪家樂, 霏 沈, 靜 范, 陳正貴, 陳穗云, 黎興江 申請人:云南大學