借助游離小孢子培養和ems誘變創制大白菜突變體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物細胞工程技術領域，具體涉及一種在游離小孢子培養過程中與 EMS誘變相結合創制大白菜突變體的方法。
【背景技術】
[0002] 大白菜屬于十字花科蕓薹屬A基因組植物，是我國種植面積最大的蔬菜作物。大 白菜的基因組序列已經于2011年釋放，其分子生物學研宄進入了功能基因組階段，大白菜 突變體是其功能基因組學研宄的重要材料。
[0003] 人工誘變可以產生豐富的突變體材料。人工誘變的方法有很多種，包括物理（如 輻射）誘變，化學誘變（如EMS誘變），T-DNA插入誘變和AC/DS轉座誘變等。其中，EMS是 化學誘變中應用最廣泛的誘變劑。與其他誘變劑相比，EMS誘變產生的點突變頻率高，且多 為顯性突變，染色體畸變相對較少。
[0004] 傳統的誘變方法是利用誘變技術處理植株的種子，并在田間對誘變植株進行鑒 定和選擇。種子是最早也是最常用來作為EMS誘變處理的材料，但通常EMS誘變種子效率 很低。游離小孢子培養可以為離體誘變提供新的途徑，其在創制突變體方面具有明顯的優 勢，可以快速獲得目標性狀、縮短創制純合突變體的時間、提高誘變效率。本發明將游離小 孢子培養和EMS誘變相結合，旨在快速創制純合的大白菜突變體。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是創建一種快速創制大白菜突變體的新方法，將游離小孢子培養技 術和EMS誘變相結合，旨在快速獲得純合的大白菜突變體，提高構建突變體庫的效率。
[0006] 本發明提供的借助游離小孢子培養和EMS誘變創制大白菜突變體的方法，主要步 驟包括：
[0007] (1)所用的誘變材料為雙單倍體純系（DH系），在開花期選取小孢子發育期為單核 晚期至二核早期的未開放花蕾，即長度為2-4mm，進行游離小孢子培養；
[0008] (2)在小孢子培養過程中，采用不同濃度0· 04%、0· 08%、0· 12% [v/v]EMS溶液對 小孢子進行誘變處理，處理時間均為l〇min，經過培養獲得小孢子再生植株（Mtl);
[0009] (3)將Mtl代再生植株移栽到溫室，利用流式細胞儀對其進行倍性鑒定，篩選出雙單 倍體植株；
[0010] (4)在獲得的雙單倍體植株中，通過對葉色、葉形、花瓣顏色、花瓣形態、雄蕊育性 和株型等植物學性狀鑒定，篩選出M tl變異植株；
[0011] (5)將所有的Mtl代雙單倍體植株自交，獲得M #種子；
[0012] (6)播種M1種子，進一步鑒定突變性狀，篩選穩定遺傳的突變體材料；
[0013] (7)經試驗篩選，創制大白菜突變體的適宜EMS溶液濃度為0· 08% ;
[0014] 上述步驟（2)的具體內容：將長度為2-4mm的未開放花蕾在超凈工作臺上經濃度 為75%乙醇溶液表面消毒30s后，用濃度為0. 1 %氯化汞溶液消毒8min，再用無菌水沖洗3 次，每次5min。
[0015] 消毒后的花蕾放入滅過菌的小燒杯內，加入蔗糖濃度為130g · Γ1，PH值為5. 8的 Β5培養基，用無菌研棒碾壓花蕾，使小孢子游離出來，用40 μπι孔徑的尼龍網過濾含小孢 子的懸浮液，收集濾液于IOmL離心管中，1000 rpm離心3min，棄上清液，沉淀加 IOmL Β5培 養基，搖勻，1000 rpm離心3min，棄上清液，所得沉淀物即為純凈小孢子。此時，分別加入濃 度為 〇(對照），0.04 %，0.08 %，0· 12% (v/v)的 EMS 溶液，搖勻，處理 IOmin 后，1000 rpm 離心3min，棄上清液，將誘變處理后的小孢子用NLN培養基稀釋，稀釋密度至1~2X IO5 個，以每皿5mL小孢子懸浮液分裝入直徑60_的無菌培養皿內，每皿添加100 μ L高 溫滅菌后的0. 5g · Γ1瓊脂糖和IOg · LH活性炭混合液；用石蠟膜封口，33°C恒溫箱中暗培 養24小時，再轉移至25°C培養箱暗培養10~15天，肉眼可見胚狀體后，將培養皿轉移到 轉數為40~60轉/分鐘搖床上繼續暗培養，培養溫度為25°C ;將子葉期胚狀體轉接到MS 培養基上，在25°C，16h/8h光周期條件下培養；獲得小孢子再生植株后，再進一步將再生植 株接種到MS培養基上進行生根培養。
[0016] EMS溶液設0.04 %，0.08 %，0. 12% (v/v) 3個濃度梯度，將EMS溶于蔗糖濃度為 130g · Γ1，PH值為5. 8的B5培養基中，抽濾備用，以未處理的小孢子作對照。
[0017] NLN培養基為含130g · Γ1蔗糖，添加激素0. 05mg · L 芐氨基腺嘌呤）和 0· 05mg · L-1NAA ( α -萘乙酸），PH值為5. 8的NLN培養基。
[0018] 誘導再生植株的MS培養基為含30g · Γ1蔗糖，6. 5~7. 5g ·廠1瓊脂，pH值為 5. 8~6. 0,未添加任何激素的MS培養基；誘導再生植株生根的MS培養基為含30g · Γ1蔗 糖，5. 5g · Γ1瓊脂，0· Img · L -1NAA ( α -萘乙酸），pH值為5. 8~6. 0的MS培養基。
[0019] 上述步驟（3)的具體內容：利用流式細胞儀對再生植株進行倍性鑒定，篩選出雙 單倍體植株。首先，取直徑為1~2cm大小的新鮮嫩葉放入培養皿內，加入1. 5~2. OmL Chopping Buffer緩沖液（15mmol · I71三輕甲基氨基甲燒，2mmol ·廠1乙二胺四乙酸二鈉， 0. 5mmol · I71精胺，80mmol ·廠1氯化鉀，20mmol ·廠1氯化鈉，0. 1% [v/v]聚乙二醇辛基苯 基醚和15mmol · Γ1二巰基乙醇，pH 7. 5)，用手術剪刀將葉片剪碎，然后，吸取上清液，用 300目篩網將樣品過濾到離心管內，1000 rpm離心10min，離心后棄上清，沉淀加 ImL PI (碘 化丙啶）染液，混勻避光染色15min，最后，將樣品用500目篩網過濾到上樣管中，混勻上機 檢測，20s后分析儀自動形成代表該樣品倍性的DNA含量峰值圖；以已知二倍體的野生型誘 變材料作為對照，使對照的DNA吸收峰處在200道（X軸）位置，每個待測植株分別測定3 次，DNA吸收峰值處在200道的樣本即為二倍體，而峰值處在100和400道的分別為單倍 體和四倍體。
[0020] 上述步驟（7)的具體內容：在獲得的穩定遺傳的突變體材料中，其中絕大多數突 變體（83. 33% )均來自于濃度為0. 08%的EMS溶液處理，由此，經本試驗篩選，創制大白菜 突變體的適宜EMS溶液濃度為0. 08 %。
[0021 ] 本發明的積極效果
[0022] (1)所用的誘變原始材料為小孢子雙單倍體系（DH系），它是遺傳意義上的純系。 如果獲得突變體，與野生型之間的遺傳背景完全一致，只是在突變位點上存在差異，可以為 克隆突變基因提供了理想的試驗材料。
[0023] (2)在小孢子培養過程中，對單倍體小孢子進行誘變處理，突變了的小孢子再生成 的雙單倍體，即為純合突變體，突變性狀在當代就能表現，可以快速篩選出突變材料。
[0024] (3)以單倍體小孢子為誘變處理材料，便于擴大誘變處理的群體規模。游離小孢子 培養技術具有快速獲得純合育種材料的優點，將其與EMS誘變相結合，可以極大地提高誘 變效率，加快創制突變體的速度。
[0025] (4)本發明獲得的大白菜純合突變體，不僅可以為大白菜育種研宄提供新的種質 資源，還可為大白菜功能基因組學研宄提供優良的突變材料。
【附圖說明】
[0026] 圖1 :經EMS誘變后培養獲得的小孢子胚狀體。
[0027] 圖 1 中：a:0 處理；b:0. 04%處理；c:0. 08%處理；d:0. 12%處理；
[0028] 圖2 :經EMS誘變后小孢子胚狀體的成苗情況。
[0029] 圖2中：a:直接成苗；b:愈傷組織；c