專利名稱：冬蟲夏草菌的固體發酵法的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體涉及冬蟲夏草菌的固體發酵生產方法。
背景技術：
冬蟲夏草(Ophiocordysepes sinensis = Cordycepes sinensis (Berk.) Sacc.)
是寄生于蝙蝠蛾幼蟲上的真菌和蟲尸復合物。冬蟲夏草上的"草"，是該菌的有性器官-子 座，"蟲"，是其寄主蟲尸，內為該菌的菌絲體-菌核。冬蟲夏草分離得的菌種，是冬蟲夏草的
無性型，菌種學名為中國被毛 包(Hirsutella sinensis Liu， Guo， Yu et Zeng)，俗稱冬蟲 夏草菌(真菌學報，1988， 8 (1) ， 35-40)。 冬蟲夏草菌的發酵生產，已有多篇專利報道。如申請號97110448. 4,03131904. 1， 200410019092. 4,200410025517. 2， 200410101728. X， 200710142960. 1等。但上述專利描 述的都是中國被毛孢的液體發酵法，都需用10-50噸大型發酵罐，生產中還需不斷壓送無 菌空氣，能源耗損大，且另有廢棄醪液排放，有礙環境保護，發酵終產物為液體醪液，不易貯存。 申請號為03135622. 2的發明專利，提出了冬蟲夏草菌的固體發酵生產法。該專利 用固體發酵罐來取代液體發酵罐，讓中國被毛孢在蔗糖、酵母和蠶蛹粉等固體基質上生長， 其終產品為固體培養物，易貯存，生產中亦無廢液排放，但該法仍需用發酵罐，仍然需要向 罐內壓送無菌空氣，能源耗損大。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于研究設計毋需壓縮空氣，亦無廢液排放，節能減 排，成本低廉的冬蟲夏草菌生產方法。 本發明提供了一種冬蟲夏草菌的固體發酵生產方法。其特點是用中國被毛孢的液 體菌種，讓它在以谷物為基本料的固體基質上發酵生長。
本發明方法具體包括下列步驟
—、液體菌種生產 (1)菌禾中生產菌禾中為中國被毛抱Hirsutella sinensis Liu， Guo， Yu et Zeng， 可從天然冬蟲夏草分離而得，或從中國科學院微生物研究所或安徽農業大學經濟昆蟲菌物 研究所購得，經DNA指紋譜鑒定，應與天然冬蟲夏草的相似率為95% -100% ;
(2)液體菌種生產 ①.液體母種的培養取在14 1『C下培養2-3月的中國被毛孢菌苔，用無菌手 術刀切割成小塊，移入盛有100ml液體培養基的250ml錐形瓶中，在轉速為80 200rpm的 旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養，培養溫度為14 18°C ， 2 3周后，即可獲得冬蟲夏草 菌的液體母種； ②.液體菌種的擴大生產將冬蟲夏草菌的液體母種，移植到2 3倍量(V/V)的 液體培養基中，在溫度為14 18t:，轉速為80 200rpm的旋轉式或往復式搖瓶機上繼續振蕩培養6 8天，即得冬蟲夏草菌的液體菌種(圖1)。此液體菌種還可進一步擴大移植 到2 3倍量(v/v)的液體培養基中。擴大培養所用的錐形瓶容量，可達500至5000ml，培 養條件同上。 冬蟲夏草菌的擴大培養，也可在血清瓶(10升)中進行。用血清瓶培養時所需的 無菌空氣，可由市售的小型空氣壓縮機經空氣過濾器過濾而得。通氣量是液體培養基體積 的0. 2 1. 0/分(v/v); 生產冬蟲夏草菌液體菌種的培養基，由碳源、氮源、礦物質、復合營養成分、維生 素和水組成；其中碳源為下列一種或幾種成分蕈糖、蜂蜜、糖蜜和葡萄糖，含量為2. 0 4. 0% w/v ;氮源為下列一種或多種成分蛋白腺、酵母浸出粉、蠶蛹粉或奶粉，含量為0. 1 3. 0% w/v ;礦物元素為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或硫酸鎂，含量為0. 01 0. 1% w/v ;復合
營養成分為下列一種或多種成分菇蕈、米麩、麥麩、玉米，含量為1. 0 10. 0% W/V ;維生
素為硫胺素，含量為0. 001 0. 01% w/v ;水為飲用水，含量為83 97% w/v。液體培養基 的pH值為6. 0 7. 0 ;
二、固體發酵生產
(1)固體發酵的培養基 冬蟲夏草菌固體發酵的培養基由谷物、輔料和水組成。 所述谷物為大米、小米、玉米、小麥、大麥或蕎麥的一種或多種，含量為固體發酵培 養基的35 40% w/w ;輔料為下列一種或多種蠶蛹粉、麥麩或玉米粉，含量為固體發酵培 養基的5 15% w/w ;水為飲用水，含量為固體發酵培養基的50 55% w/v ;
(2)滅菌將上述固體發酵培養基裝入容器(玻瓶或耐熱塑料袋)內，在l. 1KG/ cm2下蒸汽滅菌30-60分鐘； (3)接種將步驟一得到的冬蟲夏草菌液體菌種灌注入上述經滅菌並冷卻的固體 發酵培養基中，接種量為固體發酵培養基干重的10 50%，接種后應及時攪拌或翻動，使 液體菌種均勻分散在固體培養基上； 或采用拌種法，即液體菌種和固體發酵培養料的拌和，是在攪拌器中完成的，所 述攪拌器外形為圓筒形或圓錐形，直徑60cm，長120cm，上有投料口 ，下有出料口 ，可封閉， 可耐1. 1Kg/cm2壓力，能通入蒸汽滅菌，單層或具夾套，攪拌器中央有攪拌軸，能將液體菌 種和固體培養料拌和均勻，并能將此拌和料分批推送至發酵袋內，拌種時的液體菌種用量 為每100Kg固體發酵培養料(以濕重計)拌入液體菌種10±2L ; (4)發酵培養和采收瓶或袋內的固體培養料，當接入液體菌種后即可移入發酵 室中進行培養。發酵室的室溫為12 18°C ，相對濕度為65± 10% ，袋/瓶內的品溫為14 16°C。當發酵培養8 12周后，培養物表面的菌絲體色澤由白色轉為黃褐色，這時發酵培 養已成熟，即可采收。(圖2、圖3) (5)冷凍干燥培養成熟的固體發酵培養物，可按下列步驟作冷凍真空干燥；干燥 品再經粉碎、過篩，即得冬蟲夏草菌的固體發酵菌粉。 ①.冷凍將新鮮的固體發酵培養物在-20 _301:下冷凍1 4h ; ②.升華干燥在真空度為30 60Pa，冷阱溫度為-40 -2(TC下升華干燥，時間
4 7h ; ③.解吸干燥在真空度為10 40Pa，冷阱溫度為_20 4(TC下作解吸干燥，直至培養物中的含水量下降至3 5%。 對冬蟲夏草菌的固體發酵培養物作冷凍真空法干燥，能最大限度地保持冬蟲夏草 菌的生理活性，且含水量低，可長期保藏。 (6)檢驗用本發明生產的固體發酵菌粉，經HPLC檢測，其腺苷Adenosine)、鳥苷 (Guanosine)、肌苷(Inosine)、尿苷(Uridine)和胞苷(Cytidine)的色譜峰，與天然冬蟲夏 草的相應色譜峰重疊一致。(圖4) 本發明取用冬蟲夏草菌的發酵醪液作液體菌種，利用了液體菌種流動性好，培養 時間短，活力強、污染少的優點。同時，又讓冬蟲夏草菌在谷物等基質上進行固體發酵。生 產中無需大型發酵設備，亦無廢料排放。節能減排，友好環境，成本低廉。
本發明綜合了液體發酵和固體發酵的雙重優點，其終產品為富含冬蟲夏草菌的谷 物，可直接用作加工食品的原料。
圖1.冬蟲夏草菌的液體菌種。 圖2.用液體菌種為種子的固體發酵培養物，瓶裝。
圖3.用液體菌種為種子的固體發酵培養物，袋裝。 圖4.天然冬蟲夏草(上)和冬蟲夏草菌固體發酵菌粉(下)的HPLC色譜圖。 兩者的腺苷(Adenosine)、鳥苷(Guanosine)、肌苷(Inosine)、尿苷(Uridine)和胞苷 (Cytidine)色譜峰，完全重疊一致。
具體實施方式
實施例1
—.菌種制備 1.菌禾中生產菌禾中為中國被毛孢(Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng)，
從中國科學院微生物研究所或安徽農業大學經濟昆蟲菌物研究所等單位購得，經DNA檢
測，其RDNA核苷酸序列和天然冬蟲夏草的相似率99% ; 2.菌種的擴大繁殖 (1).瓊脂斜面瓊脂斜面培養基配方 蕈糖20g，蛋白胨3g，酵母浸出粉2g，磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 3g，瓊脂20g，水
1000ml， p朋.5，待瓊脂溶化后分裝入100ml小三角瓶中，每瓶裝培養基50ml，滅菌121°C，
25分鐘。用中國被毛孢yy0701菌株接種，16。C下培養70天； *蕈糖，又名海藻糖，英文名Trehalose，該糖在昆蟲和藻類中普遍存在 (2).搖瓶培養 培養基配方取香菇100g，麥麩10g，蠶蛹粉10g和玉米粉10g，加水1000ml，煮沸， 維持20分鐘。用布過濾，取濾汁，並定容至1000ml。在上述濾汁中另加蕈糖10g，蛋白胨 5g，酵母浸出粉2g，磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 2g及硫胺素15mg。溶解並混和后，用lMol 氫氧化納溶液調pH至6. 8 ; 分裝和滅菌將上述培養液分裝入500ml園錐瓶內，裝量100ml/瓶，滅菌121°C 下30分鐘;
接種與培養取在16t:下已培養70天的中國被毛孢菌苔(約2平方厘米大)，用 手術刀切割成10 20個小塊。然后移入上述搖瓶培養基中，在頻率為150rpm，溫度為17°C 下，振蕩培養20天。這時培養液中已長滿菌絲小球，醪液靜置后不分層，即可作為液體母 種，進一步擴大繁殖。方法是將上述液體母種，移植至裝量為200ml的500ml圓錐瓶中，即 總量為300ml的醪液中含液體母種100ml，接種量為33%。培養基和培養條件同上，振蕩培 養6天后即得冬蟲夏草菌的液體菌種；
二、固體發酵生產
1.固體發酵配方及裝袋 配方秈大米100Kg、玉米粉10Kg，搖瓶培養基80L， 裝瓶將上述配方經混和后，分裝入耐熱塑料袋中，裝量每袋2Kg ; 滅菌121。C，35分鐘； 2.接種將上述冬蟲夏草菌液體菌種，用灌注法接入上述已經滅菌并冷卻至室溫 的固體發酵袋中，每袋灌入液體菌種150ml，並隨即將袋內培養物倒轉或側向翻動5次，使 液體菌種能均勻地分散在米粒基質上，然后移入發酵室中培養。整個接種和翻動可在自動 流水綫上進行。 3.培養、采收冬蟲夏草菌的固體發酵室，其室溫應控制在為16士2t:，相對濕度 在65±10% ;袋內品溫在15±2°C。發酵培養3周后，米粒基質上已長滿中國被毛孢菌絲 體，培養8周后，培養物表面的菌絲體色澤已由白色轉為黃褐色。 4.冷凍真空干燥將上述發酵成熟的培養物，先在-20 -3(rC下冷凍3h，然后置 真空度為40Pa，冷阱溫度為-3(TC下升華干燥，8h后繼續在真空度為15Pa下解吸干燥，直至 培養物中的含水量下降到5%。干燥物經粉碎並通過3號藥篩后，即得冬蟲夏草菌的固體發 酵菌粉100Kg ; 5.檢驗將冬蟲夏草菌的固體發酵菌粉用HPLC儀測定，其腺苷、鳥苷、胞苷、肌苷、
和尿苷的色譜峰，應和天然冬蟲夏草的相應色譜峰}疊合一致。
實施例2 本實施例中的菌種制備和液體菌種生產方法，均同實施例1。但在固體發酵生產 項下的接種方式，采用拌種法，即液體菌種和固體發酵培養料的拌和，是在攪拌器中完成 的，所述攪拌器外形為圓筒形或圓錐形，直徑60cm，長120cm，上有投料口 ，下有出料口 ，可 封閉，可耐1. 1Kg/cm2壓力，能通入蒸汽滅菌，單層或具夾套，攪拌器中央有攪拌軸，能將液 體菌種和固體培養料拌和均勻，并能將此拌和料分批推送至發酵袋內，拌種時的液體菌種 用量為每100Kg固體發酵培養料(以濕重計)拌入液體菌種10±2L ;固體發酵用的塑料 袋(發酵袋)大20X40cm，事先應用r射線輻照滅菌。拌種后的固體發酵培養料(拌和料) 裝入發酵袋的量為5士0，2Kg/袋(以濕重計)。然后扎口，並運送至固體發酵培養室培養， 其培養條件、采收和檢測標準，同實施例1。 本實施例因采用拌和法接種，中國被毛孢菌絲體在谷粒培養基上分布更均勻，發 酵周期比灌注接種法可縮短1 2周。
實施例3 本實施例中的菌種制備和固體發酵生產方法同實施例2，但液體菌種的擴大改用 大容量的血清瓶培養。方法和步驟如下
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取在16t:下巳培養90天的中國被毛孢菌苔(約3平方厘米大)，用手術刀切割成 10 20個小塊，移入裝有200ml液體培養基的500ml園錐瓶中，經搖瓶培養得中國被毛孢 的液體母種； 2.取上述兩瓶500ml園錐瓶中的400ml液體母種，移入內裝液體培養基1000ml 的1500ml大園錐瓶中.接種量為28% .然后置往復式搖床上振蕩培養，振幅8cm，頻率為 80 100次/分；培養溫度為16士2t:，振蕩培養6 7天后，每瓶大園錐瓶中即可得中國 被毛孢搖瓶種子1. 4L ; 3.上述搖瓶種子可進一步在容量為10升的血清瓶中擴大培養.每10L容量的 血清瓶中裝液體培養基6L，用2瓶振蕩培養所得的液體菌種(共2. 8L)接種，即接種量為 32%。 4.將上述接種了液體菌種的血清瓶，移入室溫為16士2t:，相對濕度為65±10% 的培養室內，並向血清瓶內通入無菌空氣。無菌空氣是由醫用小型空氣壓縮機將空氣經空 氣過濾器除菌后獲得的。每臺小型空氣壓縮機可為3 10個血清瓶提供無菌空氣。通氣 量為醪液體積的0. 5 1. 0(v/v)/min。通氣培養6 8天后，每個血清瓶即可生產得冬蟲 夏草菌液體菌種8. 8L.每5 6個血清瓶的液體菌種生產量，相當于一只100立升種子罐 的液體菌種生產量，可足夠供應生產冬蟲夏草菌固體發酵菌粉300Kg。
權利要求
一種冬蟲夏草菌的固體發酵法，其特征在于該方法包括下列步驟一、液體菌種生產(1)菌種生產菌種為中國被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu etZeng；菌種經DNA指紋譜鑒定，與天然冬蟲夏草的相似率為95％-100％；(2)液體菌種生產①液體母種的培養取在14～18℃下培養2-3月的中國被毛孢菌苔，切成小塊，移入盛有100ml液體培養基的250ml錐形瓶中，在轉速為80～200rpm的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養，培養溫度為14～18℃，2～3周后，即可獲得冬蟲夏草菌的液體母種；②液體菌種的擴大生產將冬蟲夏草菌的液體母種，移植到2～3倍量v/v的液體培養基中，繼續在溫度為14～18℃，轉速為80～200rpm的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養6～8天，即得冬蟲夏草菌的液體菌種；所述液體培養基由碳源、氮源、礦物質、復合營養成分、維生素和水組成；其中碳源為下列一種或多種成分蕈糖、蜂蜜、糖蜜和葡萄糖，含量為2.0～4.0％w/v；氮源為下列一種或多種成分蛋白胨、酵母浸出粉、蠶蛹粉或奶粉，含量為0.1～3.0％w/v；礦物元素為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或硫酸鎂，含量為0.01～0.1％w/v；復合營養成分為下列一種或多種成分菇蕈、米麩、麥麩、玉米，含量為1.0～10.0％w/v；維生素為硫胺素，含量為0.001～0.01％w/v；水為飲用水，含量為83～97％w/v；液體培養基的pH值為6.0～7.0；二、固體發酵生產(1)固體發酵的培養基固體發酵的培養基由谷物、輔料和水組成；所述谷物為大米、小米、玉米、小麥、大麥或蕎麥的一種或多種，含量為固體發酵培養基的35～40％w/w；輔料為下列一種或多種蠶蛹粉、麥麩或玉米粉，含量為固體發酵培養基的5～15％w/w；水為飲用水，含量為固體發酵培養基的50～55％w/v；(2)滅菌將上述固體發酵培養基裝入容器內，在1.1KG/cm2下蒸汽滅菌30～60分鐘；(3)接種將步驟一所得的冬蟲夏草菌液體菌種，灌注入上述已經滅菌並冷卻的固體發酵培養基中，接種量為固體發酵培養基干重的10～50％v/w；(4)發酵培養和采收冬蟲夏草菌的固體發酵培養，其室溫控制在12～18℃，料溫控制在14～18℃，相對濕度在65±10％，經8～12周發酵培養后，培養物表面的菌絲體色澤由白色轉為黃褐色，這時發酵培養已成熟，即可取出作冷凍真空干燥；(5)冷凍干燥冬蟲夏草菌的固體發酵培養物，可用冷凍真空干燥法干燥，干燥物經粉碎、過篩，即得冬蟲夏草菌的固體發酵菌粉。
2. 根據權利要求l所述的方法，其中步驟一 (2)冬蟲夏草菌液體菌種的生產，用血清瓶作通氣培養，通氣量為i : o.2 i : lv/v。
3. 根據權利要求l所述的方法，所述步驟二 (3)采用拌種法，即液體菌種和固體發酵 培養料的拌和，是在攪拌器中完成的；所述攪拌器外形為圓筒形或圓錐形，上有投料口 ，下 有出料口 ，可封閉，可耐1. 1Kg/cm2壓力，能通入蒸汽滅菌，單層或具夾套，攪拌器中央有攪 拌軸，能將液體菌種和固體培養料拌和均勻，并能將此拌和料分批推送至發酵袋內；拌種時 的液體菌種用量為每100Kg固體發酵培養料以濕重計拌入液體菌種10士2L。
4.根據權利要求l所述的方法，其中步驟二 (4)，固體發酵培養物的冷凍真空干燥，通過下列步驟依次進行(1) 冷凍將新鮮的固體發酵培養物在-20 -3(TC下冷凍，時間1 4h ;(2) 升華干燥在真空度為30 60Pa，冷阱溫度為-40 -2(TC下升華干燥，時間4 7h ;(3) 解吸干燥在真空度為10 40Pa，冷阱溫度為-20 4(TC下作解吸干燥，直至培 養物中的含水量下降至3 5%。
全文摘要
本發明公開了一種冬蟲夏草菌的固體發酵法。本法采用生產菌種為中國被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng的液體發酵醪液作液體菌種，通過灌注或拌和接種，讓冬蟲夏草菌在以谷物為基質的固體培養基上發酵生產。本法綜合了液體發酵和固體發酵的雙重優點。既有菌種培養時間短、活力強、流動性好、發育點多的優點，又具有生產設備投資小、能耗低、無廢液排放、產品易貯存等特點。本發明的終產品，為富含冬蟲夏草菌的谷物。可直接作為保健食品的原料應用。
文檔編號C05G1/00GK101695257SQ20091019795
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者楊慶堯 申請人:上海芝草生物技術有限公司;