專利名稱：一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因在植物病害防治上的應用，尤其涉及一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因在植物病害防治中的應用。
背景技術：
植物病害一直是困擾農業生產的主要問題之一。植物病害主要由病毒、細菌、真菌和線蟲引起。病原物對寄主作物的侵害使得農作物減產甚至絕收，造成嚴重的經濟損失。據資料統計，全球每年因病害導致的作物減產高達20%。因此，研究開發對環境友善的植物病害防治方法是人們所關心的問題。對植物病原物致病分子機理的深入研究，可為設計和發展植物病害防治新方法提供工作基礎。
十字花科黑腐病菌，也稱野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonascampestris pv. campestris)，會在世界范圍內尤其是熱帶和亞熱帶地區引起十字花科作物(如大白菜、甘藍、花椰菜、蘿卜以及油菜)等發生黑腐病，造成嚴重的經濟損失。該病菌屬革蘭氏陰性細菌，能通過水孔、氣孔或傷口侵入植物體內，引起病害。十字花科黑腐病菌一直是研究植物病原菌致病性分子機理的模式菌。因此，鑒定與十字花科黑腐病菌致病相關的新的基因，對防治植物病害具有重要的意義。
近二十年來，分子植物病理學的研究確定了許多病原細菌的致病生化因子，如多糖、毒素、生化激素、胞外酶以及依賴III型分泌系統的效應蛋白分子等。III型分泌系統是近十多年來證實在動植物病原菌中保守存在并對病原菌的致病性起重要作用的分泌系統。病原菌通過該分泌系統將效應分子(毒性因子)運送至寄主細胞中，刺激或干擾寄主的正常的細胞程序，使寄主表現感病或產生抗病反應。在植物病原菌中，該分泌系統由hrp 基因(hypersensitiveresponse and pathogenicity，過敏反應禾口至文病個生)所編石馬。hrp基因是一類具有在非寄主植物引起過敏反應而在寄主植物引起病害的雙重功能的基因，在染色體中通常是多個基因串聯在一起形成大小約為15 401Λ的hrp基因簇，不同致病變種 (pathovar)、生理小種(physiologic race)甚至種(species)的病原菌hrp基因結構和功能具有高度的相似性(或保守性)。已知病原菌生長在基本培養基或寄主內時hrp基因的表達受到誘導，而生長在營養豐富培養基則受到抑制。
有關hrp基因表達調控的分子機理一直受到人們的關注。在十字花科黑腐病菌中，hrp基因簇由約包含有20個基因的6個操縱子所構成(hrpA hrpF)，已知這些基因的表達受兩個位于hrp基因簇外的基因hrpG和hrpX的編碼產物所調控。hrpG編碼一個OmpR 家族的雙組分調控系統(two-component regulatorysystem)的響應調控蛋白 (response regulator)，但與其相應的感受蛋白(sensor)卻一直沒有克隆到。HrpG蛋白激發hrpX基因的表達，hrpX所編碼的AraC型轉錄激活因子接著激活另外6個hrp操縱子的表達。但是，有關HrpG的表達受哪些蛋白質因子或環境信號的調控，目前知之甚少。
雙組分調控系統是革蘭氏陰性菌的一類調控系統，不同的細菌擁有數量不同的雙組分調控系統。該系統調控菌體幾乎所有的生理途徑，如細胞間的信號傳導、趨化性、芽孢形成以及致病性等等。一個典型的雙組分調控系統是由一個感受蛋白和一個響應調控蛋白組成，感受蛋白位于細胞膜，能夠感知周圍環境的信號，而響應調控蛋白則能與相應基因的啟動子區域結合，激活或阻遏相應基因的轉錄。感受蛋白通常是一個組氨酸激酶，當接受到外界相應信息時，發生自身磷酸化作用，然后將磷酸基團傳遞到響應調控蛋白的氨基末端區域，改變調控蛋白與DNA特異序列的結合能力，使得調控蛋白結合到啟動子區域或從啟動子區域解離下來。響應調控蛋白也可能與核糖核酸(RNAjibonucleicAcid)聚合酶互相作用，增強相應基因的轉錄或阻遏相應基因的轉錄。另外，感受蛋白也可將磷酸基團在多個調控蛋白間逐級傳遞。
參考文獻 Alfano，J.R. &Collmer，A. (1997). The type 111 (Hrp) secretion pathway ofplant pathogenic bacteria !trafficking harpins, Avr proteins, and death. J Bacterioll79,5655-5662. Bonas, U.，Schulete，R.，Fenselau, S.，Minsavage, G. V.，Staskawicz, B. J. &Stall, R. Ε. (1991). Isolation of a gene cluster from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria that determines pathogenicity and the hypersensitive response on pepperand tomato. Mol Plant-Microbe Interact 4，81—88· Brito, B. ， Marenda, Μ. ， Baberis, P. ， Boucher, C. ， &Genin, S. (1999). prhj andhrpG two new components of the plant signal-dependent regulatory cascadecontrolled by PrhA in Ralstonia solanacearum. Mol Microbiol 31,237-251. Buttner, D.&Bonas，U. (2006) . Who comes first ？ How plant pathogenicbacteria orchestrate type III secretion. Curr Opin Microbiol 9， 193-200. Huang，D. _L.，Tang D. -J.，Liao，Q.，Li，X. -Q.，He，Y. -Q.，Feng，J. -X.， Jiang，B. -L，Lu，G. -Τ.，Tang, J. -L (2009). The Zur of Xanthomonas campestris is involvedin hypersensitive response and positively regulates the expression of the hrp clustervia hrpX but not hrpG. Mol Plant Microbe Interact 22，321—329. Hueck，C. J. (1998). Type III protein secretion systems in bacterial pathogensof animals and plants. Microbiol Mol Biol Rev 62，379—433. Schulte, R. &Bonas, U. (1992). A Xanthomonas pathogenicity locus isinduced by sucrose and sulfur-containing amino acid. Plant Cell 4,79-86. Stock，A. M.，Robinson, V. L. &Goudreau, P. N. (2000). Two-componentsignal transduction. Annu Rev Biochem 69，183—215. Swings, J.G.&Civerolo, E. L. (1993).Xanthomonas 1st edition London Chapman&Hall. Tang, X. , Xiao, Y. &Zhou, J. M. (2006). Regulation of the type III secretionsystem in phytopathogenic bacteria. Mol Plant-Microbe Interact 19， 1159-1166. Wangelnik, K.&Bonas，U. (1996) · HrpXv，an AraC-type regulator， activatesexpression of five of the six loci in the hrp cluster of Xanthomonas
4campestris pv. vesicatoria. J Bacteriol 178,3462-3469. ffengelnik, K. , Van den Ackerveken, G. &Bonas, U. (1996a). HrpG, a key hrpregulatory protein of Xanthomonas campestris pv.vesicatoria is homologous totwo-component response regulators. Mol Plant-Microbe Interact 9,704-712.
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因及其應用，該基因編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶，并影響hrp基因的表達，作為抗病育種靶標或藥物靶標應用于防治植物病害。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因 (XC_3670)在防治植物病害上的應用。
優選地，該基因編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶，并影響hrp基因的表達，作為抗病育種靶標或藥物靶標，用于十字花科黑腐病病害的防治。
優選地，該基因是下列核苷酸序列之一 (1)序列表中序列1的DNA序列； (2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
優選地， 自5'端的第253 1491位核苷酸為該基因的開放閱讀框(ORF)，自5'端的第 253 255位核苷酸為該基因的起始密碼子(ATG)，自5'端的第1492 1494位核苷酸為該基因的終止密碼子(TAG)。
優選地， 序列表中序列2的蛋白質序列是該基因編碼的組氨酸激酶演繹的氨基酸序列，由 413個氨基酸組成；該蛋白質序列預測分子量為47084. 01道爾頓，等電點為7. 90。
優選地，該基因的缺失突變體(3670DM)以及攜帶所述基因的質粒。
優選地，該質粒為pL3670。
本發明在十字花科黑腐病菌中鑒定到一個與致病性相關的編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶(HK，HiStidine Kinase)的基因，該基因調控hrpGhrpX和其它hrp基因的表達。該基因突變后，會使得病原菌對寄主植物的致病性基本喪失，誘導非寄主植物產生過敏反應的能力明顯降低，hrp基因的表達水平明顯降低。由于該基因編碼產物組氨酸激酶是一個跨膜蛋白，能感受并傳遞細胞外的環境信號，因此是開發防治植物病害新方法的一個潛在的抗病育種靶標或藥物靶標。
圖1為本發明鑒定的基因(XC_3670)在十字花科黑腐病菌8004菌株基因組中的遺傳圖譜； 圖2為XC_3670基因的克隆酶切電泳圖譜； 圖3為XC_3670基因突變體3670DM及其互補菌株C3670的菌落形態； 圖4為XC_3670基因的缺失突變體3670DM及其互補菌株C3670DM在寄主蘿卜葉片形成的病斑； 圖5為XC_3670基因突變體3670DM及其互補菌株C3670DM在辣椒葉片引起的過敏反應； 圖6為XC_3670基因對hrp基因報告質粒表達的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和優選實施例詳細描述本發明的技術方案。以下例舉的實施例僅用于說明和解釋本發明，而不用于限制本發明的技術方案。本發明的請求保護的范圍由權利要求具體限定。
本發明鑒定的十字花科黑腐病菌致病相關的基因，編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶，能夠作為抗病育種靶標或藥物靶標應用于防治植物病害。
本發明提供的編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶的基因(XC_3670基因)， 是下列核苷酸序列之一 1)序列表中序列1的DNA序列； 2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列是十字花科黑腐病菌野生型菌株8004的基因組中的一段DNA序列，由1511個核苷酸組成。該DNA序列含完整的編碼組氨酸激酶的基因 XC_3670,自5'端的第253 1491位核苷酸為該基因的開放閱讀框(ORF，Open Reading Frame)，自5'端的第253 255位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5'端的第1492 1494位核苷酸為終止密碼子TAG。
序列表中序列2的蛋白質序列是XC_3670基因編碼的組氨酸激酶演繹的氨基酸序列，由413個氨基酸組成。該蛋白質序列預測分子量為47084. 01道爾頓，等電點為7. 90。
上述DNA序列已在美國國立生物技術信息中心(NCBI)公布，基因組序列號為 NC_007086，該基因編碼蛋白序列號為YP_244731。該基因的缺失突變體3670DM及攜帶該基因的質粒PL3670已在廣西大學生命科學與技術學院保存。
本發明還涉及含有上述基因(XC_3670)的表達載體，該表達載體優選為pL3670。
含有上述基因(XC_3670)的開放閱讀框及其部分序列的表達載體均屬于本發明的保擴范圍。
將本發明提供的十字花科黑腐病菌致病相關的基因作為抗病育種靶標或藥物靶標應用于防治植物病害。
在本發明的一個實施例中，所述植物病害是由十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)所導致的十字花科作物黑腐病。
在以下實施例中所用到的材料包括 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)野生型菌株 8004，購于英國植物病原細菌國家保藏中心(NCPPB，The National Collection ofPlant Pathogenic Bacteria)，保藏號為 NCPPB No. 1145 ； 大腸桿菌(Escherichiacoli)株系 JM 109、載體 pGEM_3Zf (+)購自 Promega 公司； pLAFR3 (Staskawicz et al.，1987)和不帶啟動子的pLAFR6 (Huynh et al.，1989) 為廣西大學本研究室保存的柯斯質粒；
6 限制性內切酶、連接酶和其它修飾酶等試劑購自！Iomega、QIAGEN公司等。
PCR反應所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
實施例1 十字花科黑腐病菌XC_3670基因突變體的構建 采用基因置換的策略，以一段927bp包含卡那霉素抗性基因(Kan)替換1239bp的 XC_3760(見圖1)，構建XC_3760的缺失突變體，具體方法參照陸光濤等所描述(生物工程學報 2003，19(6) :661-667)。
根據XC_3760基因上下游的DNA序列(基因組序列號NC_007086，Qian etal. ,2005),設計弓丨物 UF/R(UF :ACAGTT GAATTCGGGCAACGTGCGCGAGTT :UR :ACAGTT GGTACCAGCAGCACCACCACGGCC)禾口 DF/R(DF :ACAGTTTCTAGACAACGGCATGAACGAGGC :DR ACAGTTCTGCAGCTCATACCGATCACTGCC)，以十字花科黑腐病菌8004菌株總DNA為模板，采用 PCR 法(95°C預變性 ^iin ；95°C變性 lmin，55°C復性 30s，74°C延伸 lmin，30 個循環；74°C延伸5min)分別擴增XC_3670基因上游412bp和下游47^p的DNA同源片段。
為方便克隆，引物的5'端分別加上相應的酶切位點序列(即上述DNA序列中的下劃線部分)。另外，Kan基因DNA片段是以轉座子pLAFRl::Tn5guSA5為模板，通過PCR 擴增得到的，詳細可參考陸光濤等所描述(生物工程學報2003，19 (6) :661-667)。將所獲得的三段片段依次克隆在載體pGEM-3Zf (+)上，得到的重組質粒再克隆到載體PLAFR3 的EcoRI位點，獲得重組質粒pLA3670。通過三親本接合，將pLA3670導入十字花科黑腐病菌8004菌株，然后通過二親本接合，將一個與PLAFR3及其衍生質粒不相容的質粒 pPHlJI (Hirsch&Beringer. 1984.)導入，篩選XC_3760的缺失突變體。三親本接合和二親本接合具體方法可參考Turner等所述(198 。XC_3760的缺失突變體3670DM的菌落形態見圖3。
實施例2 XC_3670基因的克隆、序列測定及XC_3670基因突變體的功能互補 根據XC_3670 基因的 DNA 序列(NC_007086，Qian et al. ,2005), 設計引物 3670F/R(3670F ACAGTTGGATCC TGCGTAATGTGCTGCAAC ；3670R ACAGTTAAGCTTGACTCCAAACTGAGGCGC)，以十字花科黑腐病菌8004菌株總DNA為模板， PCR(95°C預變性 ^iin ；95°C變性 lmin，55°C復性 30s，74°C延伸 2min，30 個循環；74°C延伸 5min)擴增該基因全長序列。為方便克隆，引物的5'端分別加上BamHI和HindIII的酶切位點序列(即上述DNA序列的下劃線部分)。將所獲得的DNA片段克隆至載體pGEM3Zf(+) 中，用Sanger末端中止法在ABI 377 DNA自動測序儀上測定DNA核苷酸序列(見序列1)。 將測序驗證正確的XC_3670基因DNA片段克隆至穿梭載體pLAFR6的BamH/Hindlll位點上， 獲得了含該基因的重組質粒PL3670。該質粒用BamH、HindIII酶切，除了一條約221Λ的載體DNA片段外，還有一條約1. 5kb的外源片段，請參見圖2 1 IOObp 標準 DNA ； 2 :XC_3670 基因片段； 3 重組質粒pL3670的酶切圖； 4 λ /Hindi 11 標準 DNA XC_3670基因突變體的功能互補的實施，是采用Turner等所述的三親本接合法將重組質粒PL3670導入XC_3670基因突變體3670DM，獲得攜帶重組質粒pL3670的菌株 C3670DM，請參見圖3。
將十字花科黑腐病菌接種到IOmL的NYGB培養基中，搖床培養過夜，對培養物濃度進行調節，使OD6tltl ^ 0. 6，用移液器精確取1 μ L的培養物，分別接種于含2%葡萄糖的 NYGA培養基平板(Daniels et al.，1984)，培養箱中培養3天，再將平板放置于培養箱外，見光培養2天，拍照觀察。
實施例3 十字花科黑腐病菌XC_3670基因突變體的致病性試驗及誘導過敏反應能力的檢測 實驗所用寄主植物為蘿卜苗(種名為Raphanus sativus L. var. radiculusPers.)，所用的接種方法為剪葉法(Dow et al.，2003)。十字花科黑腐病菌菌株在 NYG(每升溶液含 5g of peptone, 3g of yeast extract 禾口 20g of glycerol,根據三組分縮寫為NYG，pH 7. 0 ;Daniels et al.，1984)液體培養基在中培養15-18個小時后， 稀釋到0D600 0. 01，用滅過菌的剪刀在菌液浸泡5秒鐘后，在健康葉片距葉尖l-2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒鐘，被接種的植物在25-30°C培養10天后觀察結果，正對照選用十字花科黑腐病菌野生型菌株8004，負對照用清水。致病試驗表明，XC_3670基因突變體3670DM在蘿卜葉片上形成的病斑長度與野生型菌株8004相比顯著降低，而互補菌株 C3670DM形成的病斑長度則與野生型基本相當，請參見圖4，表明了 XC_3670基因與致病性有關。
過敏反應(hypersensitive reaction, HR)試驗是在十字花科黑腐病菌的非寄主植物辣椒 ECW-10R (Capsicum annuum cv. ECW-10R)品種上進行(Newmanet al. ,2001) 將培養好的菌液用IOmM磷酸緩沖液(5. 8mM Na2HPO4,4. 2mMNaH2P04, pH 7. 0)稀釋至 0D600 0. 01(約lX107CFU/ml)后，用不帶針頭的注射器將5 μ L的細菌懸浮液壓滲到葉片的葉肉組織中。被接種的植物在中培養16或M小時，觀察拍照，請參見圖5。
實施例4 十字花科黑腐病菌XC_3670基因對hrp基因表達的影響 為了解XC_3670基因是否影響hrp基因的表達，將hrpG、hrpX和6個hrp操縱子(hrpB-F)的報告質粒 ρ⑶ShrpG、ρ⑶ShrpX、ρ⑶ShrpB、ρ⑶ShrpC、ρ⑶ShrpD、ρ⑶ShrpE、 ρ⑶SirpF分別導入野生型菌株8004及XC_3670基因缺失突變體3670DM，獲得的報告菌株在 XVM2 培養基(20mM NaCl，IOmM(NH4)2S04，5mM MgSO4, ImM CaCl2,0. 16mM KH2PO4,0. 32mM K2HPO4,0. OlmM FeSO4, IOmM果糖，IOmM蔗糖，0. 03%酸水解酪素。文獻見^fengelnik etal.， 1996b)培養24h后，測定葡萄糖苷酸酶(GUS)活性。結果參見圖6，報告質粒在突變體背景的表達水平要比在野生型背景顯著降低，表明突變體的hrpG、hrpX和其它hrp基因的表達水平降低。hrp報告質粒由本實驗室構建并保存，hrp報告質粒的構建是通過將hrp 基因的啟動子DNA片段與編碼β-葡萄糖苷酸酶的gusA基因的編碼區融合后，克隆到載體 PLAFR6而成，詳細構建方法參考Huang等Q009)。⑶S活性的測定方法參考Henderson等 (1985)。
在圖6中，將十字花科黑腐病菌菌株的過夜培養物的濃度調至0D_約為0. 5后，取 1. OmL 接種至Ij 200mL 的 NYGB 培養基(Daniels et al.，1984)中搖瓶培養 36h,吸取 1. OmL培養液，按Henderson等(198 所描述的方法，以硝基苯酚葡糖苷酸(P-nitrophenyl β -D-Glucuronide)為反應底物，測定GUS活性。用IOltl活菌數(cfu)所顯示的酶活性來比較菌株間的⑶S活性的差異。
從本實施例可以看出，本發明要求保護的基因的失活直接導致十字花科黑腐病菌致病力的下降。因此，本發明要求保護的基因可以用于植物病害防治，特別是由十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)所導致的十字花科黑腐病。另外,本發明要求保護的基因可以作為開發用于植物病害防治的抗病育種靶標或藥物靶標。本領域技術人員可以根據本說明書的教導和啟示，開發用于防治植物病害、特別是十字花科黑腐病的藥物。
參考文獻 Daniels, Μ. J. , Barber, C. Ε. , Turner, P. C. , Sawczyc , Μ. K. , Byrde, R. J. W. &Fielding, A. H. (1984). Clonging of genes involved in pathogenicity ofXanthomonas campestris pv. campestris using the broad-host-range cosmidpLAFRl. EMBO J3，3323-3328. Dow, J. M.，Crossman, L.，Findlay, K.，He, Y. -Q.，Feng, J. -X.，&Tang，J. -L. 2003. Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by Cell-Cel1Signaling and is required for full virulence to plants. Proc Natl Acad Sci USA 100, 10995-11000. Henderson, R. F. , Benson, J. Μ. , Hahn, F. F. , Hobbs, C. H. , Jones, R. K. , MauderIy, J. L. , McClellan, R. 0. &Pickrell, J. A. (1985). New approaches for theevaluation of pulmonary toxicity :bronchoalveolar lavage fluid analysis. FundamApp1 Toxicol 5, 451-458. Hirsch, P. R. &Beringer, J. E. (1984). A physical map of pPHlJI and pJB4JI. Plasmid 12，139-141. Huang, D. -L. , Tang D. -J. , Liao, Q. , Li, X. -Q. , He, Y. -Q. , Feng, J. -X. , Jiang, B. -L. , Lu, G. -Τ. , Tang, J. -L. (2009). The Zur of Xanthomonas campestris isinvolved in hypersensitive response and positively regulates the expression of thehrp cluster via hrpX but not hrpG. Mol Plant Microbe Interact 22,321-329. Huynh, Τ. V. ， Dahlbeck, D. &Stask￡iwicz， B. J. (1989). Bacterial blight ofsoybean !regulation of a pathogen gene determining host cultivar specificity. Science245,1374-1377. Newman, Μ. A. , yon Roepenack-Lahaye, Ε. , Parr, A. , Daniels, M. J. &Dow, J. M. (2001). Induction of hydroxycinnamoyl-tyramine conjugates in pepperby Xanthomonas campestris, a plant defense response activated by hrpgenedependent and hrp gene-independent mechanisms. Mol Plant-Microbe Interactl4,785-792. Qian, W. , Jia, Y. , Ren,S.X.et al. (2005). Comparative and functionalgenomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestrispv. campestris. Genome Res 15,757-767. Staskawicz , B. ，Dahlbeck, D. ，Keen , N.&Napoli， C. ( 1987).Molecularcharacterization of cloned avirulence genes from race O and race 1 of Pseudomonassyringae pv. glycinea. J Bacteriol 169，5789—5794· Turner, P. ， Barber, C. E. &Daniels, M.J. (1985) . Evidence for clusteredpathogenicity genes in Xanthomonas campestris pv. campestris. Mol Gen Genet 199，338-343. Wengelnik, K. ， Marie, C. ， Russel, Μ. ， &Bonas, U. (1996b). Expression and1 οca1iζ ation of HrpA1, a protein of Xanthomonas campestris pv.Vesicatoriaessential for pathogenicity and induction of the hypersensitive reaction. J. Bacterioll78，1061-1069. 陸光濤，唐紀良，何勇強，陳保善，唐東階.野油菜黃單胞菌野油菜致病變種中一個與EPS合成有關的新基因的鑒定.生物工程學報2003，19 (6) :661-667
0093]XC_3670基因序列表0094]序列1 :DNA序列0095]TGCGTAATGTGCTGCAACGCGCGACGTTGCTGGCGCAGGGCGTGCGCATCGAGGCCACCG600096]ATCTCAACCTGCCGCGCAGTGCCACTGCACGTCCAGCCCCGCTGCCCGGCGGCGAGCCGG1200097]ATCGCGCACGCATCGAACAGGCCTTGGCGCGCGCGCAAGGGGTGATCGCACAGGCTGCGG1800098]CCGATCTGGGCCTAAGCCGGCAGGCGCTGTACCGGCGCATGGACCGTTACGGCATCAGCC2400099]AGGACTAGGCCGATGCTGTCGCGCTCCTTCACCTTCTCGCTGTTTCTGCGCCTGCTCCCG3000100]GTGCTGGTACTGGCTGCCGCCTTGCCGTGGGCCATTGCCTACTGGCTGGACCGTGGCTGG3600101]CAAGTGGCCGCCGTGTCGGCCGTGGTGGTGCTGCTGACGATGTGGTGGAGCCTGCAGCGC4200102]GCCACCGCGCCGATGCGCTCGCTGTTCCGCGCCCTGGCCGGCACCACCAGCAGCTACCGC4800103]GATGGCGAATACAACTTCGGTGTGTACTGGCGCGGCAACGACGAGCTGGCGCAGTTGGTA5400104]CAGGCGCATGCCGAACTGGGCGAGGTCCTGCGTGCACAGCGGCGCGATCTGGTGCAGCGC6000105]GAACTGATGCTGGACACCATGTTGCAGAACACGCCGGTGGCCATGTTGCTGGTGGTGCCC6600106]GGCGGCGATGGCCTGCGCCGCATCGGGTTTTCCAACAACGCGGCGCGCAAGCTGCTGCAT7200107]GGCGGCCGCAAGCTCGAGGGGCAGCATCTGGACGACGTGCTGGAACGCATGCCCAACGAA7800108]CTGCGCGACGCGCTGGCACGTGGTGGCGACTGTCTGTTCGCCGTGCGCGAAGACGGCGAC8400109]GATGAAGAAGACGAGCAGATCTATCACCTGTCGCGCCGCGCCTTCCATTTGAACGGCCGC9000110]GGCCACGAACTGCTGCTGATCCGCACCCTCACCACCGAACTGCGGCGCCAGGAAGTGCAG9600111]ACCTGGAAGAAAGTGATCCGGGTGATCAGCCACGAATTGAACAACTCGCTCGCGCCGATC10200112]GCCTCGCTGGCGCACTCCGGCGCCGAGCTGCTGCGCCGTGAGCGCACCGATCGGCTGGGC10800113]ACGGTGTTCGAGACCATCGAAGAACGCGCGCGCCACCTGGAGGGCTTCATTCGCGGCTAT11400114]GCGCGCTTTGCCAAACTGCCGCAGCCACAGTTGCAGACCATCGAATGGGCGCCATTTCTG12000115]GAGCGCCTGCGGCAGCAGATTCCGTTCCAGCTGGAGGGCACGCCTGTCGATGTCTCCAGC12600116]CGCATCGATGCCGCACAGATCGAACAGGCGCTGCTCAACCTGCTGAAGAACGCACACGAG13200117]GCCTGCAGTGAGGCGCAGCCGCCCAACAGCGAGGTGGCGGTGCGCGTCACCCGCTTGCCG13800118]CAGTGGCTGCGCATCGAAGTGCTGGACCGCGGCAACGGCATGAACGAGGCCGTATTGCAC14400119]AACGCACTGATGCCGTTCTATTCGACCAAGCGACGTCCCCCCAATTTTGAGTAGCGCCTC15000120]AGTTTGGAGTC 1511
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權利要求
1.一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因(XC_3670)在防治植物病害上的應用。
2.按照權利要求1所述的應用，其特征在于，所述基因編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶，并影響hrp基因的表達，作為抗病育種靶標或藥物靶標，用于十字花科黑腐病病害的防治。
3.按照權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的DNA序列；(2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
4.按照權利要求3所述的應用，其特征在于，自5'端的第253 1491位核苷酸為所述基因的開放閱讀框(ORF)，自5 ‘端的第 253 255位核苷酸為所述基因的起始密碼子(ATG)，自5'端的第1492 1494位核苷酸為所述基因的終止密碼子(TAG)。
5.按照權利要求3所述的應用，其特征在于，序列表中序列2的蛋白質序列是所述基因編碼的組氨酸激酶演繹的氨基酸序列，由 413個氨基酸組成；所述蛋白質序列預測分子量為47084. 01道爾頓，等電點為7. 90。
6.按照權利要求3至5任一項所述的應用，其特征在于，所述基因的缺失突變體 (3670DM)以及攜帶所述基因的質粒。
7.按照權利要求6所述的應用，其特征在于，所述質粒為PL3670。
全文摘要
本發明提供一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因(XC_3670)在防治植物病害上的應用，該基因編碼雙組分調控系統感受蛋白組氨酸激酶，并影響hrp基因的表達，作為抗病育種靶標或藥物靶標，可用于十字花科黑腐病病害的防治。
文檔編號A01N57/16GK102187874SQ201010125229
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者唐紀良, 陸光濤, 李瑞芳, 唐永勤, 何勇強 申請人:廣西大學