專利名稱：一種豬精液冷凍保存方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體是一種豬精液冷凍方法。
背景技術：
國內也有一些單位研究和優化豬精液冷凍保存方法，例如西北農林科技大學、浙江大學等，我們研制的方法與他們不同，本發明進一步豐富了豬精液冷凍保存的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種豬精液冷凍保存方法。本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種豬精液冷凍保存方法，精液樣品要求新鮮精液活力> 0. 7，冷凍方法按以下操 作步驟進行1.豬精液冷凍稀釋液配方與稀釋液的配制1. 1豬精液冷凍稀釋液配方稀釋液分為常溫稀釋液和冷凍稀釋液1. 1. 1常溫稀釋液配方常溫稀釋液由葡萄糖32. 0g/L;TES 12. Og/L ；Tris 2. Og/L ；KCl 0. 8g/ L ；EDTA-Na2 1. 5g/L ；甘氨酸 5. Og/L ；青霉素(Penicillin G) 10000IU/L,硫酸鏈霉 (Streptomycin sulfate)0. 05g/Lo1.1. 2冷凍稀釋液配方在常溫稀釋液的基礎上加卵黃20% (ν/ν)、甘油6% (ν/ν)即為冷凍稀釋液。1.2.稀釋液的配制1. 2. 1常溫稀釋液的配制準確稱量所需藥品至事先經過滅菌過的圓底燒瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于 4°C冰箱中待用。1. 2. 2冷凍稀釋液的配制新鮮雞蛋1 2只，先用75%的酒精消毒雞蛋表面、鑷子及手，待酒精干后用消毒 好的鑷子輕輕敲開雞蛋大頭(氣室)面，去掉蛋清，用IOml —次性注射器去掉針頭抽取所 需卵黃量，置于事先消毒好的離心管中，然后放到離心機中離心去除卵黃顆粒。如需配冷凍 稀釋液IOml時，取常溫稀釋液7. 4ml，卵黃上清2ml，甘油0. 6ml混勻即為冷凍稀釋液，冷凍 稀釋液為現配現用。2.精液稀釋2.1常溫稀釋液的稀釋在豬精液一經采出來后，馬上用常溫稀釋液1 1稀釋，然后快速將精液運送回實 驗室，一般要求盡快把精液送回實驗室。2. 2冷凍稀釋液的稀釋
當精液送回實驗室后離心去除1/2上清，其沉淀物用II液1 1稀釋后，檢查活 力，如精液活力> 0. 7即可進行精液預冷平衡。3.精液預冷平衡把稀釋好的精液用4 6層紗布包裹后放置4°C冰箱中平衡4h。4.精液的滴凍 把液氮倒到一個泡沫箱中，在液氮上方5cm高處放置一個鋁盤，鋁盤要預冷 IOmin0把平衡好的精液按0. 25ml/滴滴在鋁盤上，蓋上泡沫箱蓋，IOmin后把顆粒鏟進液氮 中。5.精液解凍和凍后活力檢查從液氮中抽取1 2顆精液放進離心管或玻璃小瓶中，置于50°C的水中進行解凍， 解凍標準為精液剛好溶解1/2即可，放置37°C恒溫箱中5min，然后精子圖像計算機輔助分 析儀(CASA)進行活力的檢查，重復檢查兩次結果取平均值。本發明的益效是本發明進一步豐富了豬精液冷凍保存的方法。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述。實施例一種豬精液冷凍方法，精液樣品要求新鮮精液活力> 0. 7，冷凍方法按以下操作步 驟進行1.豬精液冷凍稀釋液配方與稀釋液的配制1. 1豬精液冷凍稀釋液配方稀釋液分為常溫稀釋液和冷凍稀釋液1. 1. 1常溫稀釋液配方常溫稀釋液由葡萄糖32. Og/L ；TES 12. Og/L ；Tris 2. Og/L ；KCl 0. 8g/ L ；EDTA-Na2 1. 5g/L ；甘氨酸 5. Og/L ；青霉素(Penicillin G) 10000IU/L,硫酸鏈霉 (Streptomycin sulfate)0. 05g/Lo1. 1. 2冷凍稀釋液配方在常溫稀釋液的基礎上加卵黃20% (ν/ν)、甘油6% (ν/ν)即為冷凍稀釋液。1. 2.稀釋液的配制1. 2. 1常溫稀釋液的配制準確稱量所需藥品至事先經過滅菌過的圓底燒瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于 4°C冰箱中待用。1. 2. 2冷凍稀釋液的配制新鮮雞蛋1 2只，先用75%的酒精消毒雞蛋表面、鑷子及手，待酒精干后用消毒 好的鑷子輕輕敲開雞蛋大頭(氣室)面，去掉蛋清，用IOml —次性注射器去掉針頭抽取所 需卵黃量，置于事先消毒好的離心管中，然后放到離心機中離心去除卵黃顆粒。如需配冷凍 稀釋液IOml時，取常溫稀釋液7. 4ml，卵黃上清2ml，甘油0. 6ml混勻即為冷凍稀釋液，冷凍 稀釋液為現配現用。2.精液稀釋
2. 1常溫稀釋液的稀釋在豬精液一經采出來后，馬上用常溫稀釋液1 1稀釋，然后快速將精液運送回實驗室，一般要求盡快把精液送回實驗室。2. 2冷凍稀釋液的稀釋當精液送回實驗室后離心去除1/2上清，其沉淀物用II液1 1稀釋后，檢查活 力，如精液活力> 0. 7即可進行精液預冷平衡。3.精液預冷平衡把稀釋好的精液用4 6層紗布包裹后放置4°C冰箱中平衡4h。4.精液的滴凍把液氮倒到一個泡沫箱中，在液氮上方5cm高處放置一個鋁盤，鋁盤要預冷 IOmin0把平衡好的精液按0. 25ml/滴滴在鋁盤上，蓋上泡沫箱蓋，IOmin后把顆粒鏟進液氮 中。5.精液解凍和凍后活力檢查從液氮中抽取1 2顆精液放進離心管或玻璃小瓶中，置于50°C的水中進行解凍， 解凍標準為精液剛好溶解1/2即可，放置37°C恒溫箱中5min，然后精子圖像計算機輔助分 析儀(CASA)進行活力的檢查，重復檢查兩次結果取平均值。6.精子的質膜完整性采用低滲腫脹實驗(HOST)進行檢測。取5yL解凍精液放入ImL低滲液中 (1.3512g果糖和0. 7352g 二水檸檬酸鈉溶于IOOmL去離子水)混勻。孵育30min后，取 20 μ L精液滴在血細胞計數板上，在400 X相差顯微鏡下觀察精子尾部情況，分析精子質膜 情況。7.精子的頂體完整性頂體完整率檢查參照江一平等_報道的方法，用考馬斯亮藍R250染色液對解凍 精子進行染色，然后在1000Χ顯微鏡下檢查精子畸形率和頂體完整率。每個處理制片2張， 每片記數200個以上的精子。8.精子的線粒體活性按JC-I試劑盒說明書操作。JC-I染液的配制(2. 5 μ 1 JC-I染料+100 μ L JC緩 沖液+400 μ L超純水)/樣本，避光放置。洗滌液的配制(400 μ L JC緩沖液+1600 μ L超純 水)/樣本。取8mL解凍精液加ImL PBS輕輕打勻，2000r/min離心6min，總共洗兩次。然 后，加JC-I染液和PBS各0. 5mL，混勻后在37°C水浴鍋中蔽光孵育30min。孵育后，再用配 制好的洗滌液洗兩次(2000r/min離心6min)。400X熒光顯微鏡下觀察。9.試驗設計在冷凍稀釋液基礎上添加不同濃度(0，0.5g/L，lg/L，1.5g/L)的牛血清白蛋白 (BSA)作為試驗組。然后根據解凍后，精子的活率、活力、質膜完整率、頂體完整率和線粒體 活性等指標來評定凍后精子的質量。10.統計分析對試驗數據用SAS統計軟件進行分析。把活率、活力、質膜完整率、頂體完整率和 線粒體活性的數據進行反正弦轉換，再用一般線性模型下的Duncan’ s多重比較檢驗各組 之間差異的顯著性。
結果與分析 試驗重復6次。從表1的試驗分析結果可知，添加不同濃度(0. 5g/L，lg/L，1. 5g/ L)的BSA與對照組相比，凍后精子的活率、活力、質膜完整率、頂體完整率和線粒體活性均 無顯著差異(P >0.05)。但通過數據可以看出，0. 5g/L BSA組的凍后精子活力略高于對照 組及其他試驗組；質膜完整率、頂體完整率和線粒體活性也要略高于其它各組。總體來說， 各個試驗組與對照組相比均無顯著差異(P > 0. 05)。表1不同濃度的BSA對豬精液冷凍效果的影響
BSA濃度(g/L) 活率(%)活力(%) 質膜完整率(%)
頂體完整率(%) 線粒體活性(%)
BSA concen.ViabilityMotility Membrane integrity 同一列數據上標不同字母表示差異顯著(a、b :P < 0. 05)。Figures with different letters within columns differ significantly(a、 b :P < 0. 05).
權利要求
一種豬精液冷凍保存方法，其特征在于，精液樣品要求新鮮精液活力≥0.7，冷凍方法按以下操作步驟進行1)豬精液冷凍稀釋液配方與稀釋液的配制1.1)豬精液冷凍稀釋液配方稀釋液分為常溫稀釋液和冷凍稀釋液1.1.1)常溫稀釋液配方常溫稀釋液由葡萄糖32.0g/L；TES 12.0g/L；Tris 2.0g/L；KCl 0.8g/L；EDTA-Na2 1.5g/L；甘氨酸5.0g/L；青霉素(Penicillin G)10000IU/L，硫酸鏈霉(Streptomycin sulfate)0.05g/L；1.1.2)冷凍稀釋液配方在常溫稀釋液的基礎上加卵黃20％(v/v)、甘油6％(v/v)即為冷凍稀釋液；1.2.)稀釋液的配制1.2.1)常溫稀釋液的配制準確稱量所需藥品至事先經過滅菌過的圓底燒瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于4℃冰箱中待用；1.2.2)冷凍稀釋液的配制新鮮雞蛋1～2只，先用75％的酒精消毒雞蛋表面、鑷子及手，待酒精干后用消毒好的鑷子輕輕敲開雞蛋大頭(氣室)面，去掉蛋清，用10ml一次性注射器去掉針頭抽取所需卵黃量，置于事先消毒好的離心管中，然后放到離心機中離心去除卵黃顆粒。如需配冷凍稀釋液10ml時，取常溫稀釋液7.4ml，卵黃上清2ml，甘油0.6ml混勻即為冷凍稀釋液，冷凍稀釋液為現配現用；2)精液稀釋2.1)常溫稀釋液的稀釋在豬精液一經采出來后，馬上用常溫稀釋液1∶1稀釋，然后快速將精液運送回實驗室，一般要求盡快把精液送回實驗室；2.2)冷凍稀釋液的稀釋當精液送回實驗室后離心去除1/2上清，其沉淀物用II液1∶1稀釋后，檢查活力，如精液活力≥0.7即可進行精液預冷平衡；3)精液預冷平衡把稀釋好的精液用4～6層紗布包裹后放置4℃冰箱中平衡4h；4)精液的滴凍把液氮倒到一個泡沫箱中，在液氮上方5cm高處放置一個鋁盤，鋁盤要預冷10min。把平衡好的精液按0.25ml/滴滴在鋁盤上，蓋上泡沫箱蓋，10min后把顆粒鏟進液氮中；5)精液解凍和凍后活力檢查從液氮中抽取1～2顆精液放進離心管或玻璃小瓶中，置于50℃的水中進行解凍，解凍標準為精液剛好溶解1/2即可，放置37℃恒溫箱中5min，然后精子圖像計算機輔助分析儀(CASA)進行活力的檢查，重復檢查兩次結果取平均值。
全文摘要
本發明公開了一種豬精液冷凍保存方法。該方法要求精液樣品新鮮精液活力≥0.7，冷凍方法按以下操作步驟進行1)豬精液冷凍稀釋液配方與稀釋液的配制；2)精液稀釋；3)精液預冷平衡；4)精液的滴凍；5)精液解凍和凍后活力檢查。本發明的益效是本發明進一步豐富了豬精液冷凍保存的方法。
文檔編號A01N1/02GK101869101SQ20101021615
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者盧克煥, 盧晟盛, 李林 申請人:廣西大學