專利名稱：一種冷凍保存紅細胞的方法
技術領域：
本發明屬于細胞保存領域，具體地說，涉及一種冷凍保存紅細胞的方法。
背景技術：
以無基質血紅蛋白為基礎的攜氧液體，是目前得到廣泛關注并極有可能進入臨床 應用的一種紅細胞替代物。在制備這類攜氧液體的一系列流程中，最上游的步驟是采集并 分離、保存紅細胞。紅細胞的采集與分離技術已經比較成熟，尚待完善的部分是紅細胞的 保存。理想的保存用于制備無基質血紅蛋白的紅細胞的方法應同時滿足以下三個方面的 要求(1)紅細胞經2 5年甚至更長時間的保存不發生腐敗；(2)紅細胞中的血紅蛋白經 冷凍-解凍過程不變性，不被氧化為高鐵血紅蛋白；(3)解凍后紅細胞即破碎釋放出游離血 紅蛋白。目前紅細胞的保存方式有冷藏、冷凍和凍干，其中冷藏保存紅細胞的期限最長為6 周，不能滿足長期儲存的要求。凍干保存紅細胞技術尚不成熟，需要解決的問題主要是相變 過程中的血紅蛋白變性。冷凍保存技術是研究時間最長也最成熟的一種保存方法，細胞、蛋 白質、核酸、亞細胞物以至器官、整體動物都有成功凍存的先例，但現有方法皆以保持細胞、 組織、器官結構與功能的完整為目標。在紅細胞冷凍保存領域，現有方法也都追求保持紅細 胞結構完整、功能完全，解凍后紅細胞破碎率低，且約有8 15%的血紅蛋白將被氧化為高 鐵血紅蛋白，不適合冷凍保存用于制備無基質血紅蛋白所需的紅細胞。因此，迫切需要建立 一種冷凍保存制備無基質血紅蛋白所需的紅細胞的方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種冷凍保存紅細胞的方法，按此方法冷凍保存的紅細胞 解凍后即破碎釋放出血紅蛋白，且血紅蛋白經冷凍 解凍過程不變性，不被氧化為高鐵血 紅蛋白。為實現上述目的，本發明提供的冷凍保存紅細胞的方法是向紅細胞中加入還原 劑和甘油以及乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱 氨酸鹽酸鹽或N-乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型 谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，加入的還原劑終濃度各為0. 5 300mM;甘油的量以終體積比計為5% 10% ；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為 0. 1 IOmM ；將上述混合液充分混勻并調節酸度值至6. 5 8. 0，將容器封口，靜置1小時 后在-40°C以下冷凍保存。上述抗壞血酸或抗壞血酸鹽的更優化終濃度為5. 5 115mM，半胱氨酸鹽酸鹽或 N-乙酰半胱氨酸的更優化終濃度為0. 5 60mM，硼氫化鈉的更優化終濃度為2. 5 250mM， 亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉的更優化終濃度為0. 5 50mM，還原型谷胱甘肽的更 優化終濃度為1. 6 130mM。上述乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的更優化終濃度為1 5mM。上述保存紅細胞的容器為軟袋或硬質容器，使用軟袋保存時紅細胞體積不超過軟袋的標稱容量，并排凈空氣；使用硬質容器時要求紅細胞體積與容器容積的比為80% 90%。本方法中甘油濃度經過正交實驗優化，使冷凍保存的紅細胞解凍后破碎率高的同 時血紅蛋白不變性 ’游離Fe3+可導致血紅蛋白自氧化，金屬離子螯合劑可螯合Fe3+，本方法 中使用乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽螯合游離Fe3+，防止自氧化的發生；添加的還原劑 在降低氧分壓的同時，能夠保護血紅蛋白的四級結構免受紅細胞解凍時固-液相的影響， 并能在紅細胞破碎后將高鐵血紅蛋白快速還原。按本方法冷凍保存的紅細胞經長期保存 后，解凍時紅細胞即破碎釋放出血紅蛋白，而血紅蛋白的活性得到有效保護，可直接進入后 續步驟，因此是一種適合冷凍保存制備無基質血紅蛋白所需的紅細胞的方法。為檢驗本方法冷凍保存紅細胞的效果，引入的檢測指標包括(1)解凍后紅細胞 破碎率；(2)解凍后紅細胞中血紅蛋白一級、三級結構變化情況；(3)解凍后紅細胞中血 紅蛋白是否被氧化為高鐵血紅蛋白。解凍后紅細胞破碎率的測定通過以下方法進行取 一管冷凍保存的紅細胞解凍，平均分配至兩個離心管中，其中一管以200W功率超聲破碎 10秒X 10次，另外一管不超聲破碎；兩管皆以200G離心力離心lOmin，取上清液以測定 血紅蛋白濃度。紅細胞破碎率=未超聲破碎管血紅蛋白濃度/超聲破碎管血紅蛋白濃 度X 100%。解凍后血紅蛋白一級、三級結構變化情況以聚丙烯酰胺凝膠電泳法、高效液相 色譜法鑒定。高效液相色譜分析通過裝備GF450分子排阻柱(9.6X250mm，6ym粒徑，力口 裝保護柱)的安捷倫1200液相色譜儀完成，以0. 2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7. 2-7. 4)為流動相，流速lml/min，上樣量5 μ l,254nm檢測；聚丙烯酰胺凝膠電泳參照《分 子生物學實驗指南》(第三版)。解凍前后紅細胞中血紅蛋白濃度以及高鐵血紅蛋白含量通 過丹麥雷度公司(Radiometer ltd.)ABL800型血氣分析儀測定。以本方法冷凍保存的紅細胞經實施例驗證，保存一年解凍后紅細胞破碎率大于 95 %，血紅蛋白無變性，未被氧化為高鐵血紅蛋白。
圖1是以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析的本發明方法保護凍存紅細胞中血紅蛋白 一級結構效果的電泳圖。圖2是以高效液相色譜法分析本發明方法冷凍保存的紅細胞解凍釋放并經陰離 子交換層析純化的血紅蛋白的色譜圖。圖3是以高效液相色譜法分析不經凍存的紅細胞低滲破碎釋放并經陰離子交換 層析純化的血紅蛋白的色譜圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作詳細說明。實施例取180ml洗滌紅細胞，加入以下任意一種或者兩種或兩種以上還原劑的 混合物抗壞血酸(或抗壞血酸鹽)、半胱氨酸鹽酸鹽(或N-乙酰半胱氨酸)、硼氫化鈉、 亞硫酸鈉(或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉)、還原型谷胱甘肽；所加還原劑的終濃度各為0. 5 300mM。
同時還加入終含量以體積比計為5% 10%的甘油以及終濃度為0. 1 IOmM的 乙二胺四乙酸(或乙二胺四乙酸鹽)，充分混勻并調節酸度值至6. 5 8.0，將容器封口，靜 置1小時后-40°C以下冷凍保存。其中，抗壞血酸或抗壞血酸鹽的更優化終濃度為5. 5 115mM，半胱氨酸鹽酸鹽或 N-乙酰半胱氨酸的更優化終濃度為0. 5 60mM，硼氫化鈉的更優化終濃度為2. 5 250mM， 亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉的更優化終濃度為0. 5 50mM，還原型谷胱甘肽的更 優化終濃度為1. 6 130mM。乙二胺四乙酸 或乙二胺四乙酸鹽的更優化終濃度為1 5mM。保存紅細胞的容器為軟袋或硬質容器，使用軟袋保存時紅細胞體積不超過軟袋的 標稱容量，并排凈空氣；使用硬質容器時要求紅細胞體積與容器容積的比為80% 90%。根據不同的還原劑組合及用量、不同的甘油用量以及金屬離子螯合劑的不同做了 共6個實施例，實施例的具體參數見表1。保存1年后，取9管平行分為3組破碎，進行指 標測定。紅細胞破碎率及高鐵血紅蛋白含量變化情況見表2，測定結果表明，解凍后紅細胞 破碎比較完全，破碎率為> 95 %，而血紅蛋白不但沒有被氧化，高鐵血紅蛋白含量還有所下 降；甘油含量影響紅細胞破碎率，但在本方法的含量范圍內其影響并不顯著；溫度也是影 響破碎率的另一因素，通過實施例發現，凍存溫度低時紅細胞破碎率較高。圖1是以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析的本發明方法保護凍存紅細胞中血紅蛋白 一級結構效果的電泳圖(銀染法)，各實施例之間無差異。圖中標號1為按本發明方法凍存 的紅細胞低滲破碎釋放并經陰離子交換層析純化的血紅蛋白；2為不經凍存的紅細胞低滲 破碎釋放并經陰離子交換層析純化的血紅蛋白；3為直接冷凍保存解凍的紅細胞釋放并經 陰離子交換層析純化的血紅蛋白。電泳結果顯示以本發明方法冷凍保存的紅細胞中的血紅 蛋白一級結構未發生改變，而直接凍存的紅細胞釋放的血紅蛋白的一級結構已經發生了變 化，其質荷比不一造成條帶彌散。圖2是以高效液相色譜法分析按本發明方法冷凍保存的紅細胞解凍釋放的血紅 蛋白的色譜圖，各實施例之間無差異。圖3以高效液相色譜法分析不經凍存的紅細胞低滲 破碎釋放并經陰離子交換層析純化的血紅蛋白的色譜圖。對比圖2與圖3結果顯示以本發 明方法冷凍保存的紅細胞解凍釋放的血紅蛋白的保留時間與不經凍存的紅細胞釋放的血 紅蛋白的保留時間一致，提示三級結構未發生改變。本發明說明書和權利要求書中單位ml均表示毫升，mM均表示毫摩爾每升。表1實施例參數表
權利要求
一種冷凍保存紅細胞的方法，其特征在于，向紅細胞中加入還原劑和甘油以及作為金屬離子螯合劑的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；所述還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱氨酸鹽酸鹽或N 乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，所加入的還原劑終濃度各為0.5～300mM；所述甘油的量以終體積比計為5％～10％；所述乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為0.1～10mM；將上述混合液充分混勻并調節酸度值至6.5～8.0，將容器封口，靜置1小時后在 40℃以下冷凍保存。
2.如權利要求1所述一種冷凍保存紅細胞的方法，其特征在于，所述抗壞血酸或抗壞 血酸鹽的更優化終濃度為5. 5 115mM，半胱氨酸鹽酸鹽或N-乙酰半胱氨酸的更優化終濃 度為0. 5 60mM，硼氫化鈉的更優化終濃度為2. 5 250mM，亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞 硫酸鈉的更優化終濃度為0. 5 50mM，還原型谷胱甘肽的更優化終濃度為1. 6 130mM。
3.如權利要求1所述一種冷凍保存紅細胞的方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸或 乙二胺四乙酸鹽的更優化終濃度為1 5mM。
4.如權利要求1所述一種冷凍保存紅細胞的方法，其特征在于，保存紅細胞的容器為 軟袋或硬質容器，使用軟袋保存時紅細胞體積不超過軟袋的標稱容量，并排凈空氣；使用硬 質容器時要求紅細胞體積與容器容積的比為80% 90%。
全文摘要
本發明提供了一種冷凍保存紅細胞的方法，向紅細胞中加入還原劑和甘油以及作為金屬離子螯合劑的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱氨酸鹽酸鹽或N-乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，還原劑終濃度各為0.5～300mM；甘油的量以終體積比計為5％～10％；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為0.1～10mM；充分混勻并調節酸度值至6.5～8.0，將容器封口，靜置1小時后在-40℃以下冷凍保存。以本方法冷凍保存的紅細胞，一年后解凍，紅細胞破碎率大于95％，血紅蛋白無變性，未被氧化為高鐵血紅蛋白。
文檔編號A01N1/02GK101965829SQ20101029976
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者劉建倉, 劉良明, 徐競, 臧家濤 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所