專利名稱：一種冷凍豬精子的方法
技術領域：
本發明涉及用于提高動物精原干細胞增殖率的培養液體系和使用方法，可使動物 精原干細胞在短期內大量增殖。
背景技術：
在豬精液的冷凍過程中，包括稀釋液的選用、精子冷凍和復蘇過程的處理技術等， 其首要目標是阻止在精子細胞內部形成足以使精子致死的冰晶結構，同時提高凍后精子活 率，盡量避免冷凍一解凍過程中對精子頂體及質膜的損傷。I3ace等用超速離心的方法提純 卵黃，發現蛋黃中的一種低密度成分對精子具有冷凍保護作用。卵黃中的低密度成分主要 是由低密度脂蛋白(low delasity IipoproteimLDL)組成，它在精子凍融過程中可以抵御 低溫打擊，提高精子活率、頂體完整率和質膜完整性。Demianowicz等和Moussa等研究證實 卵黃中的低密度脂蛋白具有冷凍保護作用。Crahaml[3]也曾指出，在精子凍融過程中，LDL 可以黏附在精子細胞膜上，從而保護精子質膜的完整性。在牛冷凍精液的研究方面，Moussa 等曾以8% (w/v)的LDL代替卵黃，冷凍，解凍后精子活率以及運動特性均有所提高。在精子冷凍保存中，往往加入蛋黃或牛奶以降低在向5°C降溫過程中精子遭受冷 休克的受損程度。但是蛋黃中的某些成分可抑制精子呼吸，降低精子活率，而且添加蛋黃 后嚴重影響冷后精子品質的檢測。研究證明[7]，蛋黃中的高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein. HDL)可誘導精子膜上的膽固醇外流，從而導致提前獲能或出現一些獲能樣變 化。因此，國外一直在致力于研究蛋黃中對精子真正起保護作用的有效成分及保護機制，試 圖以其中的有效成分完全替代蛋黃。近幾年研究認為，蛋黃中對精子膜起保護作用的有效 成分是低密度脂蛋白(LDL)，且認為LDL以兩種可能得機制保護精子一種機制是，LDL可使 蛋黃發生凝膠化，LDL外膜的磷脂釋放出來在精子膜表面形成一層保護膜，還可代替精子膜 上的一些磷脂，從而降低精子膜相位轉變溫度；另一種機制是，LDL可與精漿蛋白快速、特 異地結合，從而阻止精漿蛋白誘導的精子膜膽固醇和磷脂外流。但是，LDL用于精子冷凍保 存的探索研究主要集中在牛上，而且通常所獲得的豬精子冷凍解凍后豬精子DNA的完整性 不高，此外凍解凍后豬精子體外受精(IVF)率也不高。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種冷凍保存豬精子的方法。為了實現上目的，本發明采 取如下技術方案一種冷凍保存豬精子的方法，包括如下步驟采集豬精子，除去精清；加入冷凍基礎液，在冰箱中進行預凍；然后在液氮中進行冷凍其特征在于所述的冷凍基礎液中包含9% (w/v)低密度脂蛋白。在其中一個實施方式中，所述低密度脂蛋白提取自新鮮雞蛋。
在其中一個實施方式中，所采集的精子活力大于80%和/或頂體完整率超過70% 的精液。在其中一個實施方式中，所述的冷凍稀釋液每IOOmL包括Tris2. 42g，檸檬酸 1.48g，葡萄糖1. 10g，9% (ν/ν)的甘油，LDL添加比例為9%。在其中一個實施方式中，在于在精液中加入冷凍稀釋液時使得甘油的最終濃度為 3%，精子密度為1. 5 2X109spz/mL。本發明還涉及上述方法所冷凍保存以及解凍所得到的豬精子。出人意料的，本發明人發現，使用含有9% (w/v)低密度脂蛋白進行冷凍時能顯 著提高冷凍解凍后豬精子DNA的完整性；也能顯著改善冷凍解凍后豬精子體外受精(IVF)
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。1. ILDL 的提取從一群飼養標準及日糧組成相同的養雞場收集新鮮雞蛋，經75%的酒精消毒蛋 殼，手工打破后將卵黃和蛋清分離。將卵黃小心地在潔凈的濾紙上滾動，以便去除卵黃系 帶和卵黃膜上黏附的少量蛋清，然后用手術刀片劃破卵黃膜，將卵黃收集于經過冰塊預處 理的燒杯中。新鮮卵黃收集后，依據。Moussa等[1]介紹的方法提取LDL先用等滲鹽溶液 (0. 17mol/LNaCI, W/V)將卵黃稀釋2_3倍，并不斷攪拌lh，然后在4°C下10 OOOXg離心 45min后，將上清液與沉淀物分離。為避免蛋黃中所含有的小顆粒物的干擾，同樣條件下再 次離心。將2次離心后收集的上清液與40%的硫酸銨溶液混合，在4°C下充分攪拌Ih后， 混合物離心45min(10 000Xg，4°C )，使溶液分層，以沉淀卵黃蛋白。離心后，棄去沉淀物， 將上清液(漂浮物)用蒸餾水透析12h，以除去溶液中的硫酸銨。在硫酸銨從溶液中完全去 除后，再次將溶液離心45min(10 000 X g，4°C )，離心后上清液的漂浮物即為LDL。1.2精液采集采用人工手握采精法，精液樣品來自6頭成年杜洛克公豬的精液。采用標準的實驗 室方法，利用顯微鏡評價精液特性。測定富含精子部分的精液樣品的體積、精子密度和活動 精子的比例，只有精子活力大于80%，頂體完整率超過70%的精液用于實驗。1.3溶液的配置BTS 由 205mmol/L。葡萄糖、20. 39mmol/L。氯化鈉、54mmol/L 氯化鉀、15. Olmmol/ L碳酸氫鈉、3. 35mmol/LEDTA和50 μ g/ml.硫酸卡那霉素構成。冷凍基礎液是TCG(Tris-citric acid-glucose) [4]。TCG基礎液的組成(g/100mL 三蒸水)是Tris2. 42，檸檬酸1.48，葡萄糖1. 10 ；冷凍稀釋液由冷凍基礎液加上9% (ν/ν) 的甘油組成。為了尋找稀釋液中LDL添加的最佳比例，本試驗設置7^^8^^9%和10%共 4個梯度水平。精子低滲液果糖0. 6756g(75mmol/L)，二水檸檬酸鈉 0. 3676g (25mmol/L)，溶于 50mL 4次蒸餾水中。成熟培養液TCM199+10% PFF+半胱氨酸+雙抗(65mg/L青霉素，50mg/L鏈霉素)。1. 4精液的冷凍
采集精液之后，在室溫靜止半個小時后，置預運轉的離心機內離心(500Xg， lOmin)，棄全部精清，按1 1或者是1 2的比例，在加入等量等溫的常溫保存液重懸， 12-15層紗布包裹使其緩慢降至室溫后，再次進行離心(800Xg，10min)，棄上清液。然后將 經過離心后濃縮的精液用冷凍基礎液作2 1稀釋(使甘油的最終濃度為3%，調整精子密 度為1.5 2X109spz/mL)將稀釋以后的精液輕輕混勻后，將試管用12 15層無菌紗布 包裹后放入冰箱，使其緩慢降溫至5°C，平衡1. 5 池。1.5精液的品質檢查細管法冷凍解凍程序用專用注射器將稀釋、平衡后的精液迅速裝入0. 25mL細管 中，水平放置在一鋁制薄板上，5°C冰箱平衡2 池。取細管支架放到液氮面以上5厘米， 蓋上容器平衡10分鐘。然后水平擺好放在支架上蓋好蓋，在液氮面上熏蒸10分鐘，之后迅 速將細管凍精浸入液氮內保存。解凍將細管從液氮中取出，迅速投入37°C的水浴中，解凍 45s，待其解凍后，擦干細管上的水珠，剪斷封口粉的一端，然后檢測精液的質量。1.5. 1精子活率的測定37°C，4 水浴解凍，然后用等溫的解凍液(95%相應的常溫保存液+5 %相應的 冷凍基礎液)作1 10稀釋后，37°C水浴孵育5min，取10 μ L精液于載玻片上，加蓋玻片 后，在顯微鏡下評定精子活率(直線運動精子百分率)。1.5.2精子頂體完整性的測定將精液滴于載玻片一端，用另一個載玻片推片，要求薄而均勻，風干5min。用滴管 吸固定液，使載玻片一端稍抬高，將固定液緩緩向下流，直至鋪滿整個載玻片，然后平放靜 止15min后，將固定液棄去，用流水沖洗后，待干。姬姆薩染液染色90min后將染色液棄去， 流水沖洗后待干，干后用1000倍油鏡檢查5個不同視野計數200個精子。頂體完整率=頂 體完整精子數/所計精子數。1. 5. 3精子質膜完整性的低滲膨脹測定細管解凍后，精液用精子低滲液(37°C)稀釋調整密度至1X106 2X106個/ mL,并孵育30 60min，混勻，取IOL精子懸浮滴于血細胞計數板上，在顯微鏡下觀察，計算 彎尾精子百分率(認為質膜完整的精子在低滲液中孵育后由于質膜的通透選擇性，尾部會 吸水膨脹而呈現不同程度的彎曲)。每次計算至少200個精子。1.5.4精子的其他指標測定包括精子的平均路徑速度(VAP)、運動的線速度(LIN)、平均側擺幅度(ALH)和 平均鞭打頻率(BCF)的測定，采用計算機輔助精液分析法(computer-assisted semen analyzer, CASA)。1. 6體外胚胎生產體外胚胎生產采用的是Roca等[5]的試驗方法。1. 7統計分析通過SPSS統計軟件，利用t檢驗和方差分析進行數據處理。2結果與分析2. 1不同離心速度提取的LDL添加不同濃度后對凍融豬精液質量參數的影響2. 1. 1 8000轉/分離心速度離心的LDL對凍融豬精液質量參數的影響從表1可以看出，以8 000r/min離心速度離心的LDL最佳濃度為9% (P < 0. 05)，精子活率達到40. 44%，精子活率、頂體完整率得到提高(P < 0. 05)，而低滲膨脹率卻顯著 下降(P > 0. 05)，但運動學參數顯著升高(P < 0. 05)。表1 :LDL(8000r/min)離心速度離心后，添加不同濃度LDL對凍融豬精液質量參數 的影響
權利要求
1.一種冷凍保存豬精子的方法，包括如下步驟 采集豬精子，除去精清；加入冷凍基礎液，在冰箱中進行預凍； 然后在液氮中進行冷凍其特征在于所述的冷凍基礎液中包含9% (w/v)低密度脂蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述低密度脂蛋白提取自新鮮雞蛋。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所采集的精子活力大于80%和/或頂體 完整率超過70%的精液。
4.權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于所述的冷凍稀釋液每IOOmL包括Tris 2.42g，檸檬酸1.48g，葡萄糖1. 10g，9% (ν/ν)的甘油，LDL添加比例為9%。
5.權利要求4所述的方法，其特征在于在精液中加入冷凍稀釋液時使得甘油的最終濃 度為3%，精子密度為1. 5 2X109spz/mL。
6.權利要求1-5任意一項所述方法冷凍保存得到的豬精子。
7.權利要求1-5任意一項所述方法得到豬精子的解凍豬精子。
全文摘要
本發明公開了一種冷凍保存豬精子的方法，出人意料的，在冷凍過程中使用9(w/v)％的低密度白蛋白進行處理能顯著提高冷凍解凍后豬精子DNA的完整性；也能顯著改善冷凍解凍后豬精子體外受精(IVF)率。
文檔編號A01N1/02GK102138552SQ201010606110
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者尹熙俊, 徐妲, 方南洙, 樸光一, 王曉明, 金 一 申請人:金 一