一種批量冷凍石斑魚精子的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及魚類繁殖與育種學領域，具體涉及一種批量快速保存石斑魚精子的方 法。
【背景技術】
[0002] 魚類精液超低溫保存在水產養殖、遺傳育種及種質資源保存中具有很重要意義： 魚類精液的超低溫冷凍保存，不僅可以實現種質材料的長距離運輸，有利于不同區域魚類 的雜交、選育、獲得優良性狀及基因多樣性保護；還可以為水產養殖業和實驗生物學研宄長 期穩定地提供材料。魚類精子低溫冷凍保存研宄開始于20世紀50年代初期。英國學者 Blaxter使用干冰直接冷凍保存太平洋鯡魚（Clupea pallasi)精巢，獲得80%的受精率。 之后，國內外學者們對魚類精子冷凍保存開展了大量研宄。目前已建立200多種淡水魚類 和40多種海水魚類，包括花鱸、牙鲆、大菱鲆、大黃魚、真鯛、四大家魚、鯽魚、鯉魚、團頭魴、 大口鲇、鱖、舞魚、石斑魚及虹鱒等重要經濟魚類的精子超低溫保存方法。
[0003] 低溫生物學研宄表明，生物體的一切生化活動，雖大多數由酶所催化而表現多種 特殊形式，但仍然服從于共同的生物學規律。其共同的規律是，酶的催化活性是受溫度影響 的，大多數酶都有其特定的最佳反應溫度，但隨著溫度的降低，酶的活性逐漸下降，當溫度 降到一定程度，各種酶都會失去活性，不能發揮催化作用，因此，生物體的所有生化活動基 本停止，進入一種低能耗、低新陳代謝的休眠狀態。
[0004] 精子低溫保存是一項需要控制非常精細的技術，處理條件應用得當時低溫可以長 期保存精子；處理條件應用不當會嚴重損傷精子，一般使用液氮低溫保存精子所產生的損 傷包括（1)滲透壓損傷、（2)冰晶損傷、（3)冷休克損傷、（4)抗冷凍劑毒性、（5)pH損傷、 (6)復溫過程的冷凍的逆過程。一般通過篩選合適的精子稀釋劑和抗凍劑來減少凍存對精 子的傷害，而精子的低溫冷凍步驟對于精子活性的保存也具有重要作用。采用合適的降溫 速率是減少滲透壓損傷和冰晶損傷的重要環節，是保證魚類精子超低溫冷凍保存成功的關 鍵之一。由于在魚類精子凍存的研宄報道中，基本上是采用實驗室條件下的單管或少量多 管保存，少量保存實驗可以利用精密的程序降溫設備快速摸索最佳凍存條件，然而這種少 量凍存程序卻較難在漁業生產中得到大規模的應用。這是因為在單管條件下，精子樣品本 身的散熱較少，可以準確地遵循降溫程序達到預定的溫度條件。而在批量條件下，如果采用 單管凍存則非常費時費力；如果采用多管同時凍存，由于樣品的散熱較大，除非采用大型的 程序降溫儀，否則通常不能達到預定的溫度條件，從而導致精子在降溫過程中損傷。魚類人 工繁殖生產所需要的精子量較大，采用合適的包裝方式和降溫程序來批量保存精子才能滿 足產業規模化生產的需要。
[0005] 石斑魚在我國海水增養殖業中的重要經濟地位，目前雜交石斑魚是南方海水養殖 的重要發展方向，雜交石斑魚技術需要用到較大量的異源精子，采用批量精子保存技術才 能夠滿足石斑魚雜交生產的迫切需要。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供了一種快速批量保存石斑魚精子的方法，解決了現有石斑魚 精子超低溫保存方法效率較低、量小、操作復雜等問題。
[0007] 為了實現上述目的，本發明的技術方案為：提供一種批量冷凍石斑魚精子的方法， 包括以下步驟：
[0008] 1)精子取材
[0009] 在石斑魚進入繁殖盛期的第1、2周內選擇健康成熟石斑魚雄魚進行采精，采精前 擦干魚體并排除尿液和糞便，將乳白色濃度適中且精子活力旺盛的精樣置于50ml EP管中 密封、閉光、冰浴保存；顯微鏡鏡檢激活觀察，室溫下80%精子在5min內保持運動狀態為合 格樣品；
[0010] 2)精子的稀釋
[0011] 選取步驟1)的合格精子，采用常規Ts-2為精子稀釋液，DMSO為抗凍劑，按照精子： 稀釋液：DMSO = 4. 5:4. 5:1的體積比例均勻混合精子和試劑；
[0012] 3)樣品的分裝
[0013] 將混合好的精子樣品分裝到2. 5ml體積的凍存管中，每管Iml精子樣品；將已分裝 的凍存管裝入樣品保存盒中，凍存管放置的位置為單數標號位置，一個樣品盒放置13管精 子樣品；
[0014] 4)樣品盒的安放
[0015] 將裝盒的精子樣品置于冰浴平衡30min ;將樣品盒放入樣品架從下往上的第1層、 3層、5層，樣品相鄰層之間的垂直間距為6cm ;
[0016] 5)降溫操作
[0017] 將樣品架第1層置于液氮面上方6cm處lOmin，然后將第1層降到液氮面放置 5min，然后將第1層浸入液氮中；此時正好保持第3層距離液氮面6cm放置5min，然后將第 3層降到液氮面放置5min，再將第3層完全浸入液氮中；此時第5層剛好距離液氮面6cm放 置5min，然后將第5層降到液氮面放置5min，最后將第5層完全浸入液氮中；
[0018] 6)復溫操作
[0019] 將樣品架整個取出，迅速將樣品盒置于42°C水浴中，并充分在水浴中搖晃解凍，鏡 檢活力后使用。
[0020] 本發明具有以下優點：
[0021] 1)本發明保存石斑魚精子的效率較高，采用分隔放置凍存管的方法有效避免相鄰 樣品管降溫過程中散熱對精子的損傷，大大提高多管凍存精子復溫后的活力。
[0022] 2)本發明采用液氮樣品架保存精子，相鄰層樣品垂直間距6cm，此設計一方面保 證每層精子樣品都能按照三步法程序降溫，一方面相鄰層的樣品受前一層樣品液氮沸騰的 影響大大降低。
[0023] 3)本發明可以節約冷凍操作的時間，使用本發明方法35min即可完成39ml精子的 超低溫冷凍操作，減少了人工操作的工作量。本方法單個液氮罐可凍存234ml的精子，可滿 足20kg受精卵生產的需要，大大減少了精子凍存操作時間、儲存和運輸成本。
[0024] 4)本發明方法在于保證受精率的同時提供了保存工作的效率、提高單液氮罐保存 量。一次繁殖通常要生產幾十公斤的受精卵，用常規方法的話起碼要攜帶5-6個大液氮罐， 而且受精率低，用本發明方法1個液氮罐就可以滿足一個繁殖周期的量。