專利名稱：紫紅笛鯛精子冷凍保存方法
技術領域：
本發明屬于精子冷凍技術領域，具體涉及紫紅笛鯛精子冷凍保存方法。
背景技術：
南海是世界第三大陸緣海，面積約350萬km2，其中我國管轄海域面積約201萬 km2。由于其海域遼闊、水質優良、海洋資源豐富，魚、蝦、貝、藻等海洋生物種類、品種眾多， 總計約有4168種，約占全國相應類群種類的52. 2%。隨著全球經濟的加快及南海周邊國家 競相發展海洋經濟，我國也加快南海區海洋資源的開發步伐。但是伴隨著海洋經濟的加快 發展，我國已出現了漁業種質資源衰退；海域污染情況日趨嚴重；赤潮頻頻；近海生態環境 惡化等問題，這些嚴重影響和制約我國海洋經濟的健康發展。因此，保護好海洋生態環境的 同時，我們也要注重保護原有野生資源、注重種質保存，為今后實現可持續發展提供途徑。精子冷凍保存是長期保存動物種質資源的有效途徑，在防止魚類物種滅絕、魚類 遺傳育種及苗種培育等方面都具有廣闊的應用前景。笛鯛科魚類及石斑魚類和鯛科魚類等 都有性轉化現象，例如石斑魚有“先雌后雄”，勒氏笛鯛有“先雄后雌”的性轉變過程，性逆轉 所需時間約2-5年，不同種類不同，巨石斑魚長達6年以上才能性轉變成功，這就增加了人 工繁殖的難度。那么魚類精子是否可以象家畜一樣通過人工擠壓成熟性腺來獲得濃的鮮精 呢。如果該方法獲得成功，那么通過采用超低溫冷凍保存精液技術把成熟雄魚的精液冷凍 保存，需要時拿出來進行人工授精，該方法不但就可以解決雄魚不足的問題，亦可解決雌、 雄親魚性成熟不同步配對時的難題。中國專利公開了一種魚類精子超低溫冷凍保存簡易方法，申請號 200710051591. 5，公開(公告)號CN101088511申請(專利權)人中國水產科學研究院 長江水產研究所，地址湖北省荊州市沙市區江漢北路41號，發明(設計)人柳凌；張潔 明；危起偉；郭峰；朱永久，摘要魚類精子超低溫冷凍保存簡易方法，它是將魚類精子取出 后，將精子與稀釋液按1 1 5的比例稀釋放入4°C冰箱內平衡20-30分鐘，再加入一定 濃度的抗凍劑，然后用0. 5毫升麥細管分裝后，放入泡沫箱內液氮面上厚2. 5 3厘米，寬 10厘米沫板上，20分鐘后，將泡沫板上的麥細管滑入液氮中，5分鐘后再將所有的麥細管轉 入溫度為-196°C的液氮罐中內冷凍保存。本發明能在離實驗室很遠的野外條件下，以及沒 有程序降溫儀或計算機控制程序降溫儀的情況下，實現對魚類精子快速、簡便、超低溫冷凍 保存，其操作簡便易行，冷凍效果好，成本低。
發明內容
本發明的目的旨在提供一種海水魚類精子冷凍液的配比比例，提高精子成活率， 尤其是針對紫紅笛鯛精子冷凍保存方法。為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現本紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，包括紫紅笛鯛精子采集、稀釋、降溫和冷 凍，其特征在于所述的冷凍保存是將紫紅笛鯛精子采集以后用稀釋液與抗凍劑對精子進行稀釋與平衡，再采用分段逐步降溫法進行冷凍保存；所述的激活方法是將解凍精液用海 水激活精子，最后進行精子質量檢測。以上所述的用稀釋液與抗凍劑對精子進行稀釋與平衡是將紫紅笛鯛精液與稀釋 液和抗凍劑配比按1 1 2的重量比例進行稀釋，所述的稀釋液和抗凍劑的重量比例是 6% 16%。以上所述的分段逐步降溫法進行冷凍保存是利用裝有液氮的容器，通過控制 樣品距離液氮面的高度來控制降溫速率，溫度由0°c開始，每次降10-20°c，依次分段降 至-80°C，最后平衡3 8分鐘，降溫完成后，將精子從程序降溫儀中取出，放入液氮罐中， 在-198°C中保存。以上所述的稀釋液是Hanks’、TS-2、TS-19和Cortland ；所述的抗凍劑是重量含量 為 6% -16%的二甲亞砜(DMSO)。Hanks，、TS-2、TS-19 和 Cortland 是以稀釋液以 ΚΗ2Ρ04、 MgSO4, NaCl, NaHC03、KCI、葡萄糖為主要成分的溶液，本技術領域的Hanks’、TS-2, TS-19 和Cortland的具體成分和含量參照陳松林主編的《魚類精子和胚胎冷凍保存理論與技術》 (中國農業出版社)。以上所述的精子質量檢測是利用計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動態 和靜態特征進行全面的量化分析，檢測精子的運動軌跡、運動速率、分布、精子外形(畸形 率)、精子數量、粘稠度、活力等，直觀揭示冷凍精子和新鮮精子質量的差異，找出冷凍保存 的稀釋液與抗凍劑最佳配比方法，從而對精子質量作出準確的評價，得到存活率高、活力強 的的紫紅笛鯛精子，使珍貴的野生資源和優異的生物種質能夠有效地儲存下來，并可以在 人們需要時隨時取用。本發明的有益效果是1、采用稀釋液抗凍劑對精子稀釋與平衡，與現有技術相比，本發明提供的方法利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA) 進行精子質量的計算機輔助檢測，通過現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子 的動態和靜態特征進行全面的量化分析，計算機自動化檢測精子的運動軌跡、運動速率、分 布、精子外形(畸形率)、精子數量、粘稠度、活力等，直觀揭示冷凍精子和新鮮精子質量的 差異，找出冷凍保存的稀釋液與抗凍劑最佳配比方法，從而對精子質量作出準確的評價，得 到存活率高、活力強的的紫紅笛鯛精子，使珍貴的野生資源和優異的生物種質能夠有效地 儲存下來，并可以在人們需要時隨時取用。
具體實施例方式本發明的技術方案如下(1)稀釋液的配制擬從4種稀釋液(Hanks，、TS-2、TS-19、C0rtland)篩選出適合 的稀釋液配方和劑量。(2)抗凍劑的篩選從6% 16%滲透性抗凍劑二甲亞砜(DMSO)篩選出適合的劑量。(3)降溫方法的選擇采用分段逐步降溫法，利用裝有液氮的容器，通過控制樣品 距離液氮面的高度來控制降溫速率。(4)精子質量檢測利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的
4計算機輔助檢測，通過現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進 行全面的量化分析，計算機自動化檢測精子的運動軌跡、運動速率、分布、精子外形(畸形 率)、精子數量、粘稠度、活力等，直觀揭示冷凍精子和新鮮精子質量的差異，從而準確評價 冷凍保存的效果。實施例1(1)挑選體重4. 5kg的紫紅笛鯛，背肌注射150IU/kg的人絨毛膜促性腺激素 (HCG)，期間觀察雄魚精液量的變化；(2)抗凍劑的配比抗凍劑是Hank’ s、TS_2、TS_19和Cortland4種基液分別與重 量含量6、8、10、12、14和16% DMSO進行配比，將配比好的液體放置于4°C冰箱待用，按1 2 的比例將精液和抗凍劑配比；(3)程序降溫儀進行降溫打開電腦和液氮泵、開起程序降溫儀，使降溫倉溫度在 15 20分鐘內降至0°C，等待加樣，將4種基液與不同濃度的DMSO混合液與精子1 1混合 放入凍存管中，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中；降溫程 序為0°C開始，以；3°C /分鐘的速度從0°C降至-5°C，以5°C /分鐘的速度從-5°C降至-15°C， 以10°C /分鐘速度從-15°C降至_25°C，再以20°C /分鐘速度從_25°C降至-80°C，最后平 衡5分鐘，降溫完成后，直接將精子從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-198°C中 保存。(4)解凍精液先將冷凍倉提到液氮液面上，平衡3-5分鐘，用鑷子取出1個凍存 管，然后迅速放置于事先準備好的42°C水浴中解凍；(5)解凍后用海水激活精子，置于精子質量分析系統中連接的顯微鏡下觀察；(6)精子質量檢測利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的 計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進 行全面的量化分析。檢測分析結果表明保存效果依次為Hank’ s+10%DMS0(解凍精子活 力為 94. 718% ) ,TS-2+8% DMSO(解凍精子活力為 93. 812% ) ,TS-19+10% DMSO(解凍精子 活力為 88. 620% ),Cortland+10% DMSO(解凍精子活力為 82. 527% ) 實施例2(1)挑選體重4. 5kg的紫紅笛鯛，背肌注射150IU/kg的人絨毛膜促性腺激素 (HCG)，期間觀察雄魚精液量的變化；(2)抗凍劑的配比抗凍劑是Hank’ s、TS-2和CortlancM種基液分別與重量含量 6、8、10、12、14和16% DMSO進行配比，將配比好的液體放置于4°C冰箱待用，按1 1. 5的 重量比例將精液和抗凍劑配比；(3)程序降溫儀進行降溫打開電腦和液氮泵、開起程序降溫儀，使降溫倉溫度在 15 20分鐘內降至0°C，等待加樣，將4種基液與不同濃度的DMSO混合液與精子1 1混合 放入凍存管中，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中；降溫程 序為0°C開始，以；3°C /分鐘的速度從0°C降至-5°C，以5°C /分鐘的速度從-5°C降至-15°C， 以10°C /分鐘速度從-15°C降至_25°C，再以20°C /分鐘速度從_25°C降至-80°C，最后平 衡5分鐘，降溫完成后，直接將精子從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-198°C中 保存。(4)解凍精液先將冷凍倉提到液氮液面上，平衡3-5分鐘，用鑷子取出1個凍存
5管，然后迅速放置于事先準備好的42°C水浴中解凍；(5)解凍后用海水激活精子，置于精子質量分析系統中連接的顯微鏡下觀察；(6)精子質量檢測利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的 計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進 行全面的量化分析。檢測分析結果表明保存效果依次為Hank’ s+10%DMS0(解凍精子活 力為 94. 718% ) ,TS-2+8% DMSO(解凍精子活力為 93. 812% ) ,TS-19+10% DMSO(解凍精子 活力為 88. 620% ),Cortland+10% DMSO(解凍精子活力為 82. 527% ) 實施例3(1)挑選體重4. 5kg的紫紅笛鯛，背肌注射150IU/kg的人絨毛膜促性腺激素 (HCG)，期間觀察雄魚精液量的變化；(2)抗凍劑的配比抗凍劑是Hank’ s和CortlancM種基液分別與重量含量6、8、 10、12、14和16% DMSO進行配比，將配比好的液體放置于4°C冰箱待用，按1 1. 5的重量 比例將精液和抗凍劑配比；(3)程序降溫儀進行降溫打開電腦和液氮泵、開起程序降溫儀，使降溫倉溫度在 15 20分鐘內降至0°C，等待加樣，將4種基液與不同濃度的DMSO混合液與精子1 1混合 放入凍存管中，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中；降溫程 序為0°C開始，以；3°C /分鐘的速度從0°C降至-5°C，以5°C /分鐘的速度從-5°C降至-15°C， 以10°C /分鐘速度從-15°C降至_25°C，再以20°C /分鐘速度從_25°C降至-80°C，最后平 衡5分鐘，降溫完成后，直接將精子從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-198°C中 保存。(4)解凍精液先將冷凍倉提到液氮液面上，平衡3-5分鐘，用鑷子取出1個凍存 管，然后迅速放置于事先準備好的42°C水浴中解凍；(5)解凍后用海水激活精子，置于精子質量分析系統中連接的顯微鏡下觀察；(6)精子質量檢測利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的 計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進 行全面的量化分析。檢測分析結果表明保存效果依次為Hank’ s+10%DMS0(解凍精子活 力為 94. 718% ) ,TS-2+8% DMSO(解凍精子活力為 93. 812% ) ,TS-19+10% DMSO(解凍精子 活力為 88. 620% ),Cortland+10% DMSO(解凍精子活力為 82. 527% ) 以上所述實施方式是本發明應用于紫紅笛鯛魚的較佳實例之一，其方法也可以拓 展到其它魚類精子的冷凍保存方法。
權利要求
一種紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，包括紫紅笛鯛精子采集、稀釋、降溫和冷凍，其特征在于所述的冷凍保存是將紫紅笛鯛精子采集以后用稀釋液與抗凍劑對精子進行稀釋與平衡，再采用分段逐步降溫法進行冷凍保存；所述的激活方法是將解凍精液用海水激活精子，最后進行精子質量檢測。
2.根據權利要求1所述的紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，其特征在于用稀釋 液與抗凍劑對精子進行稀釋與平衡是將紫紅笛鯛精液與稀釋液和抗凍劑配比按11 2 的重量比例進行稀釋。
3.根據權利要求1所述的紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，其特征在于分段逐 步降溫法進行冷凍保存是利用裝有液氮的容器，通過控制樣品距離液氮面的高度來控制降 溫速率，溫度由0°C開始，每次降10-20°c，依次分段降至-80°c，最后平衡3 8分鐘，降溫 完成后，將精子從程序降溫儀中取出，放入液氮罐中，在-198°C中保存。
4.根據權利要求2所述的紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，其特征在于所述的 稀釋液是HankS’、TS-2、TS-19和Cortland ；所述的抗凍劑是重量含量為2% 20%的二甲 亞砜(DMSO)。
5.根據權利要求1所述的紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，其特征在于所述的 精子質量檢測是利用計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動態和靜態特征進行全面 的量化分析，檢測精子的運動軌跡、運動速率、分布、精子外形、精子數量、粘稠度和活力。
全文摘要
本發明涉及一種涉及紫紅笛鯛精子冷凍保存以及激活方法，包括紫紅笛鯛精子采集、稀釋、降溫和冷凍，其特征在于所述的冷凍保存是將紫紅笛鯛精子采集以后用稀釋液與抗凍劑對精子進行稀釋與平衡，再采用分段逐步降溫法進行冷凍保存；所述的激活方法是將解凍精液用海水激活精子，最后進行精子質量檢測，對精子的動態和靜態特征進行全面的量化分析，從而對精子質量作出準確的評價，得到存活率高、活力強的紫紅笛鯛精子，使珍貴的野生資源和優異的生物種質能夠有效地儲存下來，并可以在人們需要時隨時取用。
文檔編號A01K61/00GK101965828SQ201010267789
公開日2011年2月9日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者彭敏, 李詠梅, 楊春玲, 蔣偉明, 陳秀荔 申請人:廣西壯族自治區水產研究所