專利名稱：一種由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法和該鋅指核酸酶及其表達載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法和該鋅指核酸酶及其表達載體。
背景技術：
傳統的基因靶向修飾依賴于細胞內自然發生的同源染色體的隨機交換，特異性不高，效率也非常低，通常為10_6級，增加了實際操作中的工作量，限制了這些技術的應用。由于在人體細胞內同源重組的效率特別低，通過單純的同源重組實現人類基因組的永久修復是不切實際的，這也嚴重阻礙了生物醫學的研究和安全有效的基因治療的進展。鋅指核酸酶(ZFNs)技術是新近發展起來的一種可用于動植物轉基因、人類遺傳疾病基因治療以及微生物基因組改造的新興技術。鋅指核酸酶是一種人工合成酶，此酶含有兩個功能性結構域鋅指蛋白構成的DNA結合域和非特異性核酸酶構成(Fok I)催化域。 這種核酸酶就像一把剪刀，可識別特異的DNA位點并切割DNA，通過細胞內固有的DNA雙鏈斷裂修復機制，在導入引入外源基因的前提下，達到在該位點插入外源基因，或者將該位點的基因敲除的目的。目前該技術以其高效性和特異性受到高度重視。近幾年來，已經有多篇研究成果在NATURE、SCIENCE等雜志上發表。這一技術的特異性和高效性已經在果蠅、植物細胞和人類細胞中得到驗證。哺乳動物細胞對鋅指核酸酶產生的DNA雙鏈切口(DSB)具有自我修復功能，修復的方法有同源重組(HR)和非同源重組末端連接(NHEJ)兩種。應用同源重組(HR)修復機制的情況下，可以在該位點插入一個外源基因，產生轉基因細胞(KNOCK-IN)；應用細胞固有的非同源重組末端鏈接(NHEJ)機制的情況下，細胞在修復斷裂的DNA雙鏈時，需要去掉斷口處幾個核苷酸，從而導致該基因閱讀框的改變，從而實現該基因定向敲除(KNOCK-OUT)。目前對鋅指核酸酶轉基因技術的研究主要集中在國外，國內尚未見相關報道。 2006年，Kelly Beumer等利用鋅指核酸酶對果蠅的生殖細胞基因組的y和ry位點定向打靶，發現誘導后的生殖細胞形成的親本幾乎都發生了突變，而且這些親本的后代有25%的新突變體，大部分的新突變體都有通過同源重組插入的帶有標記基因的目的基因。這表明鋅指核酸酶在果蠅生殖細胞定向打靶中具有高效性和特異性。2008年Yarmick Doyon在斑馬魚ntl基因敲除的研究中，將鋅指核酸酶的mRNA注入斑馬魚的單細胞胚胎，成體后在鋅指核酸酶的識別位點上發生了高效率的突變，且出現了預期的特定性狀消失現象，ntl基因的平均突變率為20%。利用鋅指核酸酶對斑馬魚基因敲除的高效性和特異性說明，這種方法可以應用于斑馬魚或其他生物基因組任何位點的敲除，前提是將鋅指核酸酶的mRNA注入生物體的受精卵中，且能穩定表達。通過不斷的探索和改進，目前鋅指核酸酶技術已經成功應用于各種動植物的基因敲除或轉基因研究中。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有技術中由于常規轉基因過程中位置效應和插入失活等原因導致的動物轉基因技術的瓶頸問題一內源基因無法定向敲除和外源基因無法高效定向導入的問題提供了一種由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法和該鋅指核酸酶及其表達載體。。本發明的技術方案如下一種由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法，包括下述步驟(1)、內源基因靶位點的選擇根據內源基因序列特異性選擇二聚體ZFN(鋅指核酸酶)識別并結合的靶位點；(2)、構建穿梭載體 pAdTrack-CMV-T2A ；(3)、將步驟⑴中的二聚體ZFN插入步驟⑵中構建的ZFN腺病毒表達載體 pAdTrack-CMV-T2A中，得到目的質粒pAdTrack-CMV-T2A_ZFN ；取Pme I內切酶線性化的該質粒和腺病毒骨架載體pAD-ea sy共轉化到大腸桿菌BJ5183感受態中同源重組，得到重組 ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN ；(4)、腺病毒包裝，得到ZFN腺病毒；(5)、步驟(4)得到的ZFN腺病毒轉染哺乳動物細胞。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法， 其中，所述步驟(1)中二聚體ZFN包含左邊ZFN編碼序列和右邊ZFN編碼序列，其中左邊ZFN 編碼的序列如SEQ ID NO. 1所示，右邊ZFN編碼的序列如SEQ ID NO. 2所示；二聚體ZFN識別并結合的靴位點序列為 SEQ ID NO. 3 所示的 5，-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGG-3， ，其互補鏈序列為 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法， 其中，所述步驟O)中穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A的構建是通過在pAdTrack_CMV系統的多克隆位點Mil和》ιοΙ之間插入T2A剪切肽，使得多克隆位點區變為Acc65I、KpnI, Seal、Sail、T2A 剪切肽、ClaI、MLuI、BstBI、XhoI 和 Bgl II，所述 pAdTrack-CMV 系統的序列如SEQ ID NO. 7所示，所述T2A剪切肽的序列如SEQ ID NO. 5所示，所述穿梭載體 pAdTrack-CMV-T2A 的序列如 SEQ ID N0. 4。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法， 其中，所述步驟(3)中重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN的制備是將SEQ ID NO. 1所示的左邊ZFN編碼序列插入到SEQ ID N0. 4所示的穿梭載體pA(Trrack-CMV-T2A的KpnI和MlI兩酶切位點之間，將SEQ ID N0. 2所示的右邊ZFN編碼序列插入到SEQ ID N0. 4所示的穿梭載體 pAdTrack-CMV-T2A 的 ClaI 和 XhoI 兩酶切位點，得到目的質粒 pAdTrack-CMV-T2A_ZFN ； 取Pme I線性化的該質粒和腺病毒骨架載體pAD-easy共轉化到大腸桿菌BJ5183感受態中重組，于LB+30y g/mL kanamycin的固體培養基上37°C培養過夜，提取質粒，Pac I酶切鑒定，得到序列如SEQ ID N0. 6所示的重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A_ZFN。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法， 其中，步驟(4)所述的腺病毒包裝是指重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN經用I^c I內切酶處理后，用脂質體2000將I^c I內切酶線性化的質粒pAd-T2A-ZFN轉染293細胞，進行腺病毒包裝，得到重組ZFN腺病毒。
上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法， 其中，步驟( 所述的腺病毒轉染哺乳動物細胞是指用ZFN腺病毒感染Hela229，得到細胞株 Hela229-ZFN。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法中所采用的二聚體ZFN，其中，所述二聚體ZFN包含左邊ZFN編碼序列和右邊ZFN編碼序列， 其中左邊ZFN編碼的序列如SEQ IDN0. 1所示，右邊ZFN編碼的序列如SEQ ID NO. 2所示， 所述二聚體ZFN識別并結合的靶位點序列為SEQ ID NO. 3所示的5，-GGTCATCCTCATCCTGAT AAACTGCAAAAGG-3，，其互補鏈序列為 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法所采用的穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A，其特征在于所述穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A的序列如SEQ ID NO. 4所示。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法中所采用的重組ZFN腺病毒表達載體pAd-T2A-ZFN，其中，所述重組ZFN腺病毒表達載體 pAd-T2A-ZFN 的序列如 SEQ ID NO. 6 所示。上述技術方案中所述的pA(Trrack-CMV-T2A-ZFN是指在SEQ ID NO. 4所示的ZFN 腺病毒表達載體pAdTrack-CMV-T2A的KpnI和MlI兩酶切位點之間含有SEQ ID NO. 1所示的左邊ZFN編碼序列，在ClaI和BioI兩酶切位點含有SEQ ID N0. 2所示的右邊ZFN編碼序列。上述技術方案中所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法中所采用的ZFN腺病毒，其中，所述ZFN腺病毒是由重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A_ZFN經用 Pac I內切酶處理后，用脂質體2000將I^c I內切酶處理過的目的質粒pAd_ZFN轉染四3 細胞，進行腺病毒包裝，得到的重組ZFN腺病毒。本發明所述的方法具有以下有益效果1、本專利用腺病毒介導ZFN的導入，也可以用其他的病毒轉染或其他的導入ZFN 的表達序列方式；2、利用ZFN技術，動物哺乳細胞基因突變效率達到13%，在有供體DNA片段存在的前提下，5%的動物哺乳細胞該基因發生了同源重組。大大提高了內源基因的定向敲除和外源基因高效定向導入效率。
1、圖1為ZFN腺病毒表達載體pAdTrack-CMV_T2A圖譜；2、圖2為2%瓊脂糖膠檢測T7核酸內切酶I與異源二聚體DNA反應結果。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體實施方式
對本發明作進一步的說明。實施例一、由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法一、內源基因靶位點的選擇根據內源基因序列特異性和具體的需要選擇二聚體ZFN識別并結合的靶位點，所述二聚體ZFN包含左邊ZFN編碼序列和右邊ZFN編碼序列，其中左邊ZFN編碼序列的如SEQID NO. 1所示，右邊ZFN編碼序列的序列如SEQ ID NO. 2所示；二聚體ZFN識別并結合的靶位點序列為 SEQ ID NO. 3 所示 5，-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGG-3，，其互補鏈序列為 3' -CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5'；二、構建穿梭載體 pA(Trrack-CMV-T2A 對穿梭載體pAdTrack-CMV進行改造，在其多克隆位點處Mil和BioI之間插入 Τ2Α 剪切肽，序列為TTCGAAACGCGTATCGATGGCTCCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGA CGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA,如 SEQ ID NO. 5 所示，使得 pAdTrack-CMV_T2A 系統多克隆位點區變為 Acc65 I,Kpn I,Sca I.Sal I、T2A 剪切肽、Cla I,Mlu I,Bst BI,Xho I 和 Bgl II, 其圖譜如圖1所示。三、重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A_ZFN的制備將SEQ ID NO. 1所示的左邊ZFN編碼序列插入到SEQ ID N0. 4所示的穿梭載體pAcWrack-CMV-TZA的KpnI和MlI兩酶切位點之間，將SEQ ID N0. 2所示右邊 ZFN編碼序列插入到SEQ I D N0. 4所示的穿梭載體pAcWrack-CMV-TZA的Cla I和 Xho I兩酶切位點。得到目的質粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN;用Riie I內切酶線性化質粒 pAdTrack-CMV-T2A-ZFN約1 μ g (酶切體系如下表)，按Takara核酸共沉劑操作說明純化線性化的質粒，溶于8 μ L ddH20,約IOOng/ μ L0取1 μ L Rne I線性化的該質粒和1 μ L腺病毒骨架載體pAD-easy (lOOng/ μ L)共轉化到大腸桿菌BJ5183感受態中重組，于LB+30 μ g/ mL kanamycin的固體培養基上37°C培養過夜，提取質粒，Pac I酶切鑒定，陽性質粒被切割為301Λ大片段和3. O或4. 5kb的小片段。得到ZFN腺病毒載體pAd-T2A_ZFN。
權利要求
1.一種由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法，包括下述步驟(1)、內源基因靶位點的選擇根據內源基因序列特異性選擇二聚體ZFN識別并結合的靶位點；(2)、構建穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A ；(3)、將步驟⑴中的二聚體ZFN插入步驟⑵中構建的ZFN腺病毒表達載體 pAdTrack-CMV-T2A中，得到目的質粒pAdTrack-CMV-T2A_ZFN ；取Pme I內切酶線性化的該質粒和腺病毒骨架載體pAD-easy共轉化到大腸桿菌BJ5183感受態中同源重組，得到重組 ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN ；(4)、腺病毒包裝，得到ZFN腺病毒；(5)、步驟(4)得到的ZFN腺病毒轉染哺乳動物細胞。
2.根據權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法，其特征在于所述步驟(1)中二聚體ZFN包含左邊ZFN編碼序列和右邊ZFN編碼序列，其中左邊ZFN編碼的序列如SEQ ID NO. 1所示，右邊ZFN編碼的序列如SEQ ID NO. 2所示；二聚體 ZFN識別并結合的靶位點序列為SEQ ID NO. 3所示的5，-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAA GG-3，，其互補鏈序列為 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。
3.根據權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法， 其特征在于所述步驟O)中穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A的構建是通過在pAdTrack-CMV 系統的多克隆位點Mil和》ιοΙ之間插入T2A剪切肽，使得多克隆位點區變為Acc 651、 KpnI、Seal, Sail、T2A 剪切肽、ClaI、MluI、BstBI、XhoI 和 Bgl II，所述 pAdTrack-CMV 系統的序列如SEQ ID NO. 7所示，所述T2A剪切肽的序列如SEQ ID NO. 5所示，所述穿梭載體 pAdTrack-CMV-T2A 的序列如 SEQ ID NO. 4。
4.根據權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法，其特征在于所述步驟(3)中重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN的制備是將SEQ ID NO. 1所示的左邊ZFN編碼序列插入到SEQ ID NO. 4所示的穿梭載體pAdTrack-CMV_T2A 的KpnI和Mil兩酶切位點之間，將SEQ ID NO. 2所示的右邊ZFN編碼序列插入到SEQ ID NO. 4所示的穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A的ClaI和BioI兩酶切位點，得到目的質粒 pAdTrack-CMV-T2A-ZFN ；取Rne I線性化的該質粒和腺病毒骨架載體pAD-easy共轉化到大腸桿菌BJ5183感受態中重組，于LB+30y g/mL kanamycin的固體培養基上37°C培養過夜，提取質粒，Pac I酶切鑒定，得到序列如SEQ ID NO. 6所示的重組ZFN腺病毒載體 pAd-T2A-ZFN。
5.根據權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法，其特征在于步驟(4)所述的腺病毒包裝是指重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN經用I^c I 內切酶處理后，用脂質體2000將I^c I內切酶線性化的質粒pAd-T2A-ZFN轉染293細胞， 進行腺病毒包裝，得到重組ZFN腺病毒。
6.根據權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法，其特征在于步驟( 所述的腺病毒轉染哺乳動物細胞是指用ZFN腺病毒感染Hela229，得到細胞株 Hela2^-ZFN。
7.權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法所采用的二聚體ZFN，其特征在于所述二聚體ZFN包含左邊ZFN編碼序列和右邊ZFN編碼序列，其中左邊ZFN編碼的序列如SEQ ID NO. 1所示，右邊ZFN編碼的序列如SEQ ID NO. 2所示， 所述二聚體ZFN識別并結合的靶位點序列為SEQ ID NO. 3所示的5，-GGTCATCCTCATCCTGAT AAACTGCAAAAGG-3，，其互補鏈序列為 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。
8.權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法所采用的穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A，其特征在于所述穿梭載體pAdTrack-CMV_T2A的序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
9.權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法所采用的重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN，其特征在于所述重組ZFN腺病毒表達載體 pAd-T2A-ZFN 的序列如 SEQ ID NO. 6 所示。
10.權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法所采用的ZFN腺病毒，其特征在于所述ZFN腺病毒是由重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A_ZFN經用 Pac I內切酶處理后，用脂質體2000將I^c I內切酶處理過的目的質粒pAd_ZFN轉染293 細胞，進行腺病毒包裝，得到的重組ZFN腺病毒。
11.權利要求1所述的由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法所采用的目的質粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN是指在SEQ ID N0. 4所示的ZFN腺病毒表達載體 pAdTrack-CMV-T2A的KpnI和MlI兩酶切位點之間含有SEQ ID NO. 1所示的左邊ZFN編碼序列，在ClaI和BioI兩酶切位點含有SEQ ID N0. 2所示的右邊ZFN編碼序列。
全文摘要
本發明一種由鋅指核酸酶介導的哺乳動物內源基因定向敲除的方法和該鋅指核酸酶及其表達載體，屬于基因工程技術領域。其中所述的方法包括(1)內源基因靶位點的選擇；(2)構建穿梭載體pAdTrack-CMV-T2A；(3)制備重組ZFN腺病毒載體pAd-T2A-ZFN；(4)腺病毒包裝，得到ZFN腺病毒；(5)步驟(4)得到的ZFN腺病毒轉染哺乳動物細胞。本發明利用ZFN技術，使動物哺乳細胞基因突變效率達到13％，大大提高了內源基因的定向敲除效率。
文檔編號A01K67/027GK102174576SQ20111002736
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者任剛, 張婷婷, 張存芳, 張智英, 李亞明, 李戰偉, 楊涵江, 王令, 王瑞, 雷潔, 麻麗霞 申請人:西北農林科技大學