專利名稱：改進的大范圍核酸酶重組系統的制作方法
改進的大范圍核酸酶重組系統本發明涉及一組試劑，其允許將DNA序列引入靶細胞基因組中的特定位點。特別地，該DNA序列編碼基因，并通過誘導型同源重組(homologous recombination,HR)事件被引入靶細胞中。本發明還涉及ー組遺傳構建體，其包含與大范圍核酸酶基因組靶位點側翼的部分具有同源性的至少兩個部分和陽性選擇標記及陰性選擇標記；以及涉及將DNA序列引入靶細胞基因組的改進方法。自超過25年前酵母中的首個基因祀向實驗(Hinnen等，1978 ;Rothstein, 1983)以來，已在多種細胞中采用同源重組(HR)來插入、替換和缺失基因組序列(Thomas和Capecchi, 1987 ；Capecchi, 2001 ；Smithies, 2001) 哺乳動物細胞中革巴向事件的發生頻率非常低，使得對天然HR的利用變得不切實際。可以通過基因座處的特定DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strand break, DSB)來顯著提高同源重組的頻率(Rouet 等，1994 ;Choulika 等，1995) ο該DSB可以由大范圍核酸酶(meganuclease)誘導,所述大范圍核酸酶是識別大DNA識別靶位點(12至30bp)的序列特異性內切核酸酶。
大范圍核酸酶對其DNA靶標表現出高特異性，這些蛋白質可切割獨特的染色體序列，因此不影響全基因組完整性。天然大范圍核酸酶主要以歸巢內切核酸酶(homingendonuclease)為代表,所述歸巢內切核酸酶是見于真核細胞、細菌和古細菌(archae)中的一類廣泛分布的蛋白質(Chevalier和Stoddard, 2001)。對Ι-Scel和HO歸巢內切核酸酶的早期研究已闡明了可如何將這些蛋白質的切割活性用于啟動活細胞中的HR事件，并且已證明了 染色體 DSB 致重組特性(recombinogenic property) (Dujon 等，1986 ；Haber,1995)。從那時起，大范圍核酸酶誘導的同源重組已成功地在細菌(Posfai等，1999)、哺乳動物細胞(Sargent 等，1997 ；Donoho 等，1998 ；Cohen-Tannoudji 等，1998)、小鼠(Gouble等，2006)和植物(Puchta等，1996 ;Siebert和Puchta，2002)中用于基因組工程目的。最近，已改造TAL效應子內切核酸酶(TAL effector endonuclease, TALEN)以高特異性地識別和切割DNA靶標。這些TALEN包含與核酸酶結構域(例如，FokI)融合的TAL (轉錄激活因子樣)效應子DNA結構域(Christian等,2010)。另ー類核酸酶也可用于切割基因組靶并因此誘導DSB，該另ー類核酸酶被稱為鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN),并且是通過將鋅指DNA結合結構域與DNA切割結構域融合產生的人造限制酶。可以以與TAL類似的方式改造鋅指結構域以靶向任意DNA序列(Kim 等，1996)。雖然可獲得可在靶細胞基因組中特定位點處誘導DSB的材料在増加，但是還未開發出常規可重復地轉化靶細胞群的方法和材料。所存在的多種原因包括原核生物基因組或更特別是真核生物基因組固有的復雜性。工作人員越來越多地發現基因組具有卓越的抗損傷能力，這恰是DSB的本質所在。此外，在產生轉化方法中，對所有轉化方法而言都存在的技術限制(即從背景未轉化細胞群中常規地鑒別出稀少轉化體的能力)繼續表現出問題。提供了利用HR在將目的序列引入靶細胞或生物體的基因組中任意位點的潛能的方法，從而允許可能比以往任何時候更細致地進行基因組操作。本發明的發明人現在已開發出一組新的遺傳構建體，其包含
a)由核酸分子編碼的構建體(i)，其至少包含以下組分(N) n-H0M01-P-M-H0M02- (N)m(i)其中，η和m是整數并且代表O或I,前提是η = I時，m = 0而當η = 0時，m =I ;因此組分N可設置在H0M01之前或N0M02之后，并且，組分P和M在H0M01與H0M02之間的順序可設置為P-M或M-P ；其中N 包含組分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含組分(PR0M2) - (POS) - (TERM2)并且 M 包含組分(PR0M3)-(MCS)-(TERM3);以及其中PROMl是第一轉錄啟動序列；NEG是陰性選擇標記；TERM1是第一轉錄終止序列；H0M01是與核酸酶DNA靶序列之前的基因組部分具有同源性的一部分；PR0M2是第二轉錄啟動序列；P0S是陽性選擇標記；TERM2是第二轉錄終止序列；PR0M3是第三轉錄啟動序列；MCS是多克隆位點，其中可以插入目的基因(gene of interest, GOI) ;TERM3是第三轉 錄終止序列；H0M02是與大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的所述DNA靶序列之后的基因組部分具有同源性的部分；b)至少ー種選自包括構建體(ii)或(iii)組成的組的構建體,所述構建體(ii)或(iii)由至少包含ー種以下組分的核酸分子編碼PR0M4-NUCl(ii)；NUC2(iii);或該組還包含序列(iv)，其為至少包含以下組分的分離或重組蛋白質NUC3 (iv)；其中PR0M4是第四轉錄啟動序列；NUC1是大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的開放讀碼框(ORF) ；NUC2是所述大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的信使RNA(mRNA)形式；NUC3是所述大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的分離或重組蛋白質；其中來自構建體(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN識別并切割所述DNA靶序列；并且其中構建體(ii)或(iii)或者序列(iv)設置成與構建體(i)共轉染到至少ー種靶細胞中。更一般地，任何能夠特異性地切割基因組靶并因此誘導DSB并且具有12至45bp雙鏈DNA靶序列的核酸酶均可用于本發明中。本發明所包含的核酸酶的非限制性實例有大范圍核酸酶、TALEN、ZFN，但本發明也可以與定義為任意融合蛋白的嵌合內切核酸酶并用，所述融合蛋白至少包含一種能夠切割基因組靶并因此誘導DSB并且具有12至45bp雙鏈DNA靶序列的內切核酸酶。除了可在特定基因組靶標處誘導DSB的核酸酶以外，本發明還包括可在12至45bp的特定基因組祀序列處誘導單鏈斷裂(single strand break, SSB)之核酸酶的用途。SSB還稱為缺ロ(nick)并且這種缺ロ核酸酶明確地包括在本發明中。在圖I中以非限制性方式示出本發明的構建體，整合基質[構建體(i)]和核酸酶表達質粒[構建體(ii)]被共轉染到細胞中。基于共轉染，經改造的核酸酶被表達，識別其內源識別位點，與其結合并在該特定位點誘導DNA雙鏈斷裂。細胞感知DNA損傷并觸發同源重組以對其進行修復，采用經共轉染的整合基質作為DNA修復基質，因它包含與周圍斷裂DNA同源的區域。在該重組事件期間，克隆到整合基質的同源區之間的陽性選擇標記(POS)和GOI在大范圍核酸酶識別位點被整合。于是，可以選擇穩定的靶細胞克隆用于藥物抗性和目的重組蛋白的表達。
下文中提供了可用于本發明構建體之遺傳元件類型的實例。這些實例僅為示例性的并且不應被以任何方式理解為限制本發明的范圍。如下表I中提供了陽性和陰性選擇標記基因的列表。表I
權利要求
1.一組遺傳構建體，其包含 a)構建體(i)，其由至少包含以下組分的核酸分子所編碼(N) n-H0M01-P-M-H0M02-(N)m(i) 其中,η和m為整數并且代表O或I,前提是當η = I時m = 0而當η = 0時m = I;因此組分N可被設置在HOMOl之前或H0M02之后，并且組分P和M可按順序P-M或M-P設置； 其中 N 包含組分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含組分(PR0M2) - (POS) - (TERM2);并且M 包含組分(PR0M3) - (MCS) - (TERM3);以及 其中PROMl為第一轉錄啟動序列；NEG為陰性選擇標記；TERM1為第一轉錄終止序列；H0M01為與核酸酶DNA靶序列之前的基因組部分同源的部分；PR0M2為第二轉錄啟動序列；POS為陽性選擇標記；TERM2為第二轉錄終止序列；PR0M3為第三轉錄啟動序列；MCS為多克隆位點；TERM3為第三轉錄終止序列；H0M02為與所述核酸酶DNA靶序列之后的基因組部分同源的部分； b)至少一種選自包括構建體(ii)或(iii)在內的組的構建體，所述構建體(ii)或(iii)由至少包含以下組分的核酸分子所編碼PR0M4-NUCl(ii)； NUC2(iii);或 所述組還包含序列(iv)，其為至少包含以下組分的分離或重組蛋白質NUC3 (iv)； 其中PR0M4為第四轉錄啟動序列；NUC1為大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的開放讀碼框(ORF) ；MEGA2為所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的信使RNA(mRNA)形式；MEGA3為所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的分離或重組蛋白質；其中來自構建體(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN識別并切割所述核酸酶DNA靶序列；并且其中構建體(ii)或(iii)或者序列(iv)被設置成與構建體⑴共轉染到至少一種靶細胞中。
2.權利要求I的構建體組，其中來自構建體(i)的所述組分H0M01和H0M02包含與所述核酸酶DNA靶序列側翼的靶細胞基因組部分具有同源性的至少200bp并且不多于6000bp的序列。
3.權利要求I或2的構建體組，其中來自構建體(i)的所述組分H0M01和H0M02包含與所述核酸酶DNA靶序列側翼的靶細胞基因組部分具有同源性的至少IOOObp并且不多于2000bp的序列ο
4.權利要求1、2或3的構建體組，其中所述組分(POS)選自新霉素磷酸轉移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3)、潮霉素磷酸轉移酶抗性基因hph (SEQ ID NO 4)、嘌呤霉素N-乙酰轉移酶基因pac(SEQ ID N05)、殺稻瘟素S脫氨酶抗性基因bsr (SEQ ID NO 6)、博來霉素抗性基因 sh ble(SEQ ID NO 7)。
5.權利要求I至4中任一項的構建體組，其中所述組分(NEG)選自缺失CpG島的單純皰疹病毒的胸苷激酶基因HSV TK DelCpG(SEQID NO 8)、與缺失CpG島的尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶基因偶聯的胞嘧啶脫氨酶CD :UPRT DelCpG (SEQ ID NO 9)。
6.權利要求I至5中任一項的構建體組，其中所述元件PROMl、PR0M2、PR0M3和PR0M4選自巨細胞病毒的立即早期啟動子PCMV(SEQ ID NO 10);猿病毒40啟動子pSV40 (SEQID NO 11);人延伸因子la啟動子phEFla (SEQ ID NO 12);人磷酸甘油酸激酶啟動子phPGK (SEQ ID NO 13);小鼠磷酸甘油酸激酶啟動子pmPGK (SEQ ID NO 14);人多聚泛素啟動子phUbc (SEQ ID NO 15);來自人單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子pHSV_TK (SEQ ID NO16);人生長抑制特異性5啟動子phGAS5(SEQ ID NO 17);四環素響應元件pTRE(SEQ IDN018);來自腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點(IRES)序列IRES EMCV(SEQ ID NO 19)；來自口蹄疫病毒的 IRES 序列 IRES FMDV(SEQ IDNO 20)，SV40。
7.權利要求I至6中任一項的構建體組，其中所述元件TERM1、TERM2、TERM3和TERM4選自聚腺苷化信號SV40pA(SEQ ID N021)、牛生長激素聚腺苷化信號BGH pA(SEQ ID NO22)。
8.權利要求I至7中任一項的構建體組，其中所述元件MCS在其5’端或3’端包含框內肽標簽,其中所述肽標簽選自FLAG (SEQ ID NO 23)、FLASH/REASH(SEQ ID NO 24), IQ (SEQID NO 25)、組氨酸(SEQID NO 26) ,STREP (SEQ ID NO 27)、鏈霉親和素 結合蛋白 SBP (SEQIDNO 28)、鈣調素結合蛋白 CBP (SEQ ID NO 29)、血凝素 HA (SEQ IDNO 30)、c-myc (SEQ ID NO31)、V5標簽序列(SEQ ID NO 32)、來自核質蛋白的核定位信號(NLS) (SEQ ID NO 33)、來自 SV40 的 NLS (SEQID NO 34)、NLS 共有序列(SEQ ID NO 35)、凝血酶切割位點(SEQ ID NO36)、P2A 切割位點(SEQ ID NO 37)、T2A 切割位點(SEQ ID NO 38)、E2A 切割位點(SEQ IDNO 39)。
9.權利要求I至8中任一項的構建體組，其中所述元件MCS包含報告基因，所述報告基因選自螢火蟲螢光素酶基因(SEQ ID NO 40)、海腎螢光素酶基因(SEQ ID NO 41)、β-半乳糖苷酶酶基因LacZ (SEQ IDNO 42)、人分泌型堿性磷酸酶基因hSEAP (SEQ ID NO 43)、鼠分泌型堿性磷酸酶基因mSEAP(SEQ ID NO 44)。
10.權利要求I至9中任一項的遺傳構建體組，其中構建體⑴包含SEQID NO 45或SEQ ID NO 46o
11.一種將編碼GOI的序列引入至少一種細胞中的試劑盒，其包含根據權利要求I至10中任一項的遺傳構建體組；以及使用所述遺傳構建體組產生轉化細胞的說明。
12.權利要求11的試劑盒，其還至少包含一種靶細胞，所述靶細胞選自=CHO-Kl細胞、ΗΕΚ293 細胞、Caco2 細胞、U2-0S 細胞、NIH 3T3 細胞、NSO 細胞、SP2 細胞、CH0-S 細胞、DG44細胞。
13.一種通過同源重組轉化至少一種細胞的方法，其包括以下步驟 a)將編碼目的基因的序列克隆到權利要求I至9中任一項的構建體(i)的位置MCS中； b)用步驟b)中的所述構建體(i)與權利要求I至9中任一項的構建體(ii)、(iii)或序列(iv)中至少一種共轉染靶細胞； c)基于以下條件從所述靶細胞中選擇至少一種細胞存在組分(POS)以及不存在組分(NEG)。
14.權利要求13的方法，其中根據(POS)和(NEG)編碼的基因產物的活性依次進行步驟c)中的選擇。
15.權利要求13的方法，其中根據(POS)和(NEG)編碼的基因產物的活性同時進行步驟c)中的選擇。
全文摘要
本發明涉及一組遺傳構建體，其至少包含第一致重組構建體(i)和第二構建體(ii、iii或iv)，所述第一致重組構建體(i)具有至少兩個與位點特異性內切核酸酶的DNA靶標位點之前和之后的基因組區域同源的部分，并且還包含插入所述同源部分的陰性選擇標記和陽性選擇標記以及其中可將目的序列克隆到鄰近陽性選擇標記的區域；所述第二構建體(ii、iii或iv)包含大范圍核酸酶。本發明還涉及包含這些構建體的試劑盒以及使用該組構建體將目的序列引入到靶細胞、組織或生物體之基因組中的方法。
文檔編號C12N9/22GK102858966SQ201180014623
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月18日 優先權日2010年2月18日
發明者克里斯托夫·德朗達, 讓-皮埃爾·卡巴尼奧爾斯 申請人:賽萊克蒂斯公司