專利名稱：一種規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法
技術領域：
本發明屬于植物的栽培技術領域，具體涉及一種繁殖鐵皮石斛試管苗的方法。
背景技術：
鐵皮石斛是我國藥典中記載的一種極為珍稀名貴中藥材，素有“中華仙草”、“藥中黃金”之美稱，被國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”，現已成為國家二級保護植物，隨著野生資源的枯竭，而不斷攀升的市場需求，促進了人工栽培產業的發展，而產業發展中優質種苗繁育環節越來越成為產業發展的瓶頸。現有的種苗快繁過程中，通常整個生產階段采取了種子播種到固體培養基中，繼代轉接，壯苗生根等階段，從播種到壯苗生根整個生產階段完全由日光燈作為光源，導致生產周期長、種子萌發率低、種苗玻璃化及變異率大、能耗高， 生產成本大、移栽成活率低等問題，試管苗整個生產階段耗時長達8 10個月，成苗后還需要經歷練苗階段才能轉移到大棚栽培種植。
發明內容
本發明所要解決的技術問題，是提供一種規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下一種規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，該方法包括以下步驟(1)將鐵皮石斛蒴果先用酒精浸泡45 60s，再放置于氯化汞水溶液中浸泡12 15min，再用無菌水反復漂洗3 4次，將消毒后的蒴果切開，取種子備用；(2)將步驟(1)得到的鐵皮石斛種子播種于液體培養基中，在22 25°C、轉速 120 150r/min、光照度300 1000勒克斯、光照時間11 l!3h/d的條件下，振蕩培養50 60d，種子萌發形成原球莖并進一步形成小芽，取小芽備用；其中，所述的液體培養基組成為6-芐基嘌呤0. 2 0. %ig/L+萘乙酸0. 1 0. 3mg/L+ 土豆汁60 80g/L+蔗糖25 30g/L+l/4MS培養基+pH 5. 4 5. 6 ；通過液體振蕩培養，種子萌發率可達90%以上。(3)將步驟(2)得到的小芽置于壯苗培養基中，在25 ^°C、光照度1000 2000 勒克斯、光照時間11 nh/d的條件下培養2 2. 5個月，小芽變成具有2 3片葉并帶有 1 2條幼根的小苗；其中，所述的壯苗培養基組成為萘乙酸0.8 1.0mg/L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+改良的N6培養基+瓊脂4. 5 6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的 N6培養基是將N6培養基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調整為3000mg/L和 200mg/L，其余的成分不變；通過改良原有的N6基礎培養基，更利于鐵皮石斛幼苗的生長。(4)將步驟(3)中得到的小苗轉移到壯苗生根培養基中，并將組培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床上，溫度控制在25 30°C，利用太陽光或自然光作為光源進行培養，培養2 3個月得到成苗；其中，所述的壯苗生根培養基組成為奈乙酸1. 0 1. 5mg/L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+活性炭為0. 5 0. 8g/L+改良的N6培養基+瓊脂4. 5-6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的N6培養基是將N6培養基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調整為3000mg/L和200mg/L，其余的成分不變；通過改良原有的N6 基礎培養基，更利于鐵皮石斛幼苗的生長。將組培苗的培養環境從相對潔凈培養室中轉移至有外遮蔭的大棚溫室條件下，利用太陽光或自然光作為光源，用濕水簾和風機降溫，不僅符合低碳高效原則，而且也能促進種苗生長健壯，適應性強，省去了組培苗的練苗環節，大大提高了移栽后成活率，一般可達96%以上。(5)將步驟(4)得到的成苗從瓶內取出用清水沖洗去除培養基后，用高錳酸鉀溶液浸泡3 5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到溫室大棚內的栽培基質中，培養M 30個月，即可采收；所述的栽培基質為碎石子與碎松樹皮按體積(1 1.幻(3 4. 5)組成的混合物。步驟(1)中，所述的酒精，體積百分濃度為體積百分濃度為70% 75%。步驟(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的質量百分含量為0.1% 0.15%。步驟⑵中，所述的液體培養基優選組成為6-芐基嘌呤0. ang/L+萘乙酸0. 2mg/ L+ 土豆汁 80g/L+ 蔗糖 25g/L+l/4MS 培養基 +pH 5. 4步驟C3)中，所述的壯苗培養基優選組成為萘乙酸0. 8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖 25g/L+改良的N6培養基+瓊脂5g/L+pH 5. 6。步驟(4)中，所述的壯苗生根培養基優選組成為奈乙酸1. 5mg/L+香蕉汁80g/L+ 蔗糖30g/L+活性炭為0. 5g/L+改良的N6培養基+瓊脂5g/L+pH 5. 8。步驟(4)中，所述的封口膜為聚四氟乙烯(PTFE)細菌濾膜，封口膜層數為一層。加一層封口膜可以防止室外環境造成組培苗的污染。步驟(5)中，高錳酸鉀溶液的濃度為0. 1 0. 15g/L。步驟(5)中，碎石子的粒徑為1 3cm，碎松樹皮的長和寬分別為1 3cm。有益效果本發明與現有技術相比，具有如下優點1、鐵皮石斛蒴果消毒后，將種子播散到步驟O)中的液體培養基中，進行液體振蕩培養，與現有的種子萌發培養方式相比，該方法種子養分吸收更加充分，萌發時間大大縮短20 25d，并且萌發率高達90%以上，變異率小于1 %，出芽整齊。2、步驟C3)所述的壯苗培養基中，將N6基礎培養基進行改良，將其中的大量元素 KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調整為3000mg/L和200mg/L，并配以適當的激素和天然添加物組合，與傳統的壯苗培養基相比，該方法能更好更快的促進小芽的生長和生根，平均2 2. 5個月，可得到3 5cm長的小苗。3、步驟中適當的調整生長素的濃度，添加少量的活性碳配成壯苗生根培養基，并將培養環境從室內移至溫室大棚中，利用太陽光或自然光進行培養，能充分利用太陽光光譜廣、光譜段能量分布均勻等優勢促進小苗的生長，與常規的方法相比，該方法可以提高小苗的生長速度、健壯度，并減少能耗，成苗后，移栽適應性好，成活率高98 %以上，是一種低碳高效的培養模式。
圖1為三種不同培養基處理種子萌發和生長情況。圖2為實施例3中處理①和處理④播種50天后得出的試驗結果。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 (1)在接種室超凈工作臺上，將未開裂的鐵皮石斛蒴果，放置于廣口瓶中，往瓶內倒入70% (ν/ν)酒精，浸泡50s左右，將酒精濾出，再用0.1% (w/w)的氯化汞水溶液浸泡約12 15min，浸泡過程中反復水平振蕩，使蒴果表面消毒徹底，再用無菌水反復漂洗3 4次，將消毒后的蒴果切開，取種子備用。(2)將鐵皮石斛種子播種于1/4MS培養基+6-芐基嘌呤0. 2mg/L+萘乙酸0. 2mg/ L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L，pH 5. 4的液體培養基中；并放入恒溫振蕩培養箱中進行振蕩培養，振蕩培養箱培養條件設置為溫度25°C、轉速120 150r/min、光照度300 1000勒克斯、光照時間12h/d，振蕩培養50 60d，種子萌發先形成原球莖并進一步形成帶一片葉的小芽，取小芽備用。(3)將得到的小芽轉接到改良的N6培養基+萘乙酸0. 8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖 25g/L+瓊脂5g/L，pH 5. 6的壯苗培養基中；所述改良的N6培養基是將N6培養基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調整為3000mg/L和200mg/L，其余的成分不變，以下相同；培養室環境設置為溫度25 ^°C、光照度1000 1200勒克斯、光照時間12h/d的條件下，培養2 2. 5個月，小芽變成具有2 3片葉并帶有1 2條幼根的小苗。(4)將得到的小苗轉移到改良的N6培養基+奈乙酸1. 5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖 30g/L+活性炭為0. 5g/L++瓊脂5g/L+pH 5. 8壯苗生根培養基中，并將組培瓶瓶口多加一層PTFE細菌濾膜，能有效的降低組培苗在溫室大棚外界環境下污染的問題，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床，溫度控制在25 30°C，利用太陽光或自然光作為光源進行培養，培養2個月左右得到成苗。(5)將得到的成苗從瓶內取出用清水沖洗去除培養基后，用0. 1 0. 15g/L高錳酸鉀溶液浸泡3 5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到溫室大棚內的栽培基質中，即進入栽培種植環節，24 30個月，即可采收入藥；上述的栽培基質為碎石子與碎松樹皮按體積(1 1.5) (3 4. 5)混勻而成。實施例2 除實施例1中步驟( 種子播種于液體培養基振蕩培養改為固體培養基萌發、步驟(5)溫室大棚自然光和太陽光培養改為培養室日光燈培養外，其它同實施例1 ；步驟(2)、 步驟(3)、步驟(4)中種子萌發、壯苗培養、壯苗生根培養三個階段分別以表1所列培養基組合進行篩選，以優選最適培養基組合配方。表1說明①培養基配方優化主要是設計不同的基礎培養基、激素濃度、天然添加物、活性炭濃度等對培養基進行了優化設計，本實例中均設計成固體培養基，每種配方中瓊脂濃度均為5g/L，蔗糖為25g/L，培養環境為溫度25V、 光照度1000 2000勒克斯、光照時間iai/d培養室內。②針對生產，不同的培養階段設計了三組培養基配方，種子播種階段主要觀察種子萌發的快慢、長勢、顏色(翠綠為佳)、原球莖是否增殖(越少越好)等指標判斷配方是否合理；壯苗培養階段，主要通關觀察苗的生長勢、粗度、玻璃化程度(越低越好)、顏色以及整齊度等指標來判斷配方的好壞；壯苗生根階段，主要通關觀察苗的健壯度、根系發達程度、苗的長勢、顏色以及整齊度等指標來判斷配方的好壞。通過觀察和各項指標的測定，并用“★”和“☆”的多少代表配方的好壞，★越多表示越好，☆比★要低一個等次。
表1培養基配方篩選
權利要求
1.一種規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將鐵皮石斛蒴果先用酒精浸泡45 60s，再放置于氯化汞水溶液中浸泡12 15min，再用無菌水反復漂洗3 4次，將消毒后的蒴果切開，取種子備用；(2)將步驟(1)得到的鐵皮石斛種子播種于液體培養基中，在22 25°C、轉速120 150r/min、光照度300 1000勒克斯、光照時間11 l!3h/d的條件下，振蕩培養50 60d， 種子萌發形成原球莖并進一步形成小芽，取小芽備用；其中，所述的液體培養基組成為 6-芐基嘌呤0. 2 0. 4mg/L+萘乙酸0. 1 0. 3mg/L+ 土豆汁60 80g/L+蔗糖25 30g/ L+1/4MS 培養基 +pH 5. 4 5. 6 ；(3)將步驟(2)得到的小芽置于壯苗培養基中，在25 ^°C、光照度1000 2000勒克斯、光照時間11 13h/d的條件下培養2 2. 5個月，小芽變成具有2 3片葉并帶有 1 2條幼根的小苗；其中，所述的壯苗培養基組成為萘乙酸0. 8 1. Omg/L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+改良的N6培養基+瓊脂4. 5 6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的N6培養基是將N6培養基中的大量元素中KNO3和(NH4)2SO4的濃度分別調整為3000mg/L 和200mg/L，其余的成分不變；(4)將步驟(3)中得到的小苗轉移到壯苗生根培養基中，并將組培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床上，溫度控制在25 30°C，利用太陽光或自然光作為光源進行培養，培養2 3個月得到成苗；其中，所述的壯苗生根培養基組成為奈乙酸1. 0 1. 5mg/ L+香蕉汁80 100g/L+蔗糖25 30g/L+活性炭為0. 5 0. 8g/L+改良的N6培養基+瓊脂4. 5-6g/L+pH 5. 6 5. 8，所述改良的N6培養基是將N6培養基中的大量元素中KNO3和 (NH4)2SO4的濃度分別調整為3000mg/L和200mg/L，其余的成分不變；(5)將步驟(4)得到的成苗從瓶內取出用清水沖洗去除培養基后，用高錳酸鉀溶液浸泡3 5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到溫室大棚內的栽培基質中，培養M 30個月，即可采收；所述的栽培基質為碎石子與碎松樹皮按體積(1 1.幻(3 4. 5)組成的混合物。
2.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(1)中，所述的酒精，體積百分濃度為70% 75%。
3.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的質量百分含量為0. 0. 15%。
4.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟( 中，所述的液體培養基組成為6-芐基嘌呤0. ang/L+萘乙酸0. ang/L+土豆汁80g/ L+ 蔗糖 25g/L+l/4MS 培養基 +pH 5. 4。
5.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(3)中，所述的壯苗培養基組成為萘乙酸0. 8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖25g/L+改良的N6培養基+瓊脂5g/L+pH 5. 6。
6.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟中，所述的壯苗生根培養基組成為奈乙酸1.5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖30g/L+ 活性炭為0. 5g/L+改良的N6培養基+瓊脂5g/L+pH 5. 8。
7.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于，步驟中，所述的封口膜為聚四氟乙烯細菌濾膜，封口膜層數為一層。
8.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(5)中，高錳酸鉀溶液的濃度為0. 1 0. 15g/L。
9.根據權利要求1所述的規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法，其特征在于， 步驟(5)中，碎石子的粒徑為1 3cm，碎松樹皮的長和寬分別為1 3cm。
全文摘要
本發明公開了一種規模化高效快速繁殖鐵皮石斛試管苗的方法將鐵皮石斛蒴果消毒，漂洗，切開，取種子；將種子播種于液體培養基中振蕩培養50～60d，種子萌發形成原球莖并進一步形成小芽；將小芽置于壯苗培養基中培養2～2.5個月，小芽變成具有2～3片葉并帶有1～2條幼根的小苗；將小苗轉移到壯苗生根培養基中，并將組培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮蔭的大棚溫室苗床上，給予太陽光或自然光，培養2～3個月得到成苗；將成苗從瓶內取出洗凈，消毒，晾干，移栽到溫室大棚內的栽培基質中，培養24～30個月，即可。本發明工藝可直接用于工廠化規模化的種苗生產，具有污染少，種子萌發率高，變異率低，種苗健壯，生產成本低，移栽成活率高等優勢。
文檔編號A01H4/00GK102301953SQ20111020334
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者史俊, 席剛俊, 徐超, 楊鶴同, 趙桂華 申請人:江蘇農林職業技術學院