專利名稱：口杯法便捷外植體滅菌的方法
技術領域：
本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種口杯法便捷外植體滅菌的方法，該方法操作簡便、滅菌徹底、染菌率低并且對外植體的傷害較小。
背景技術：
用于植物組織培養操作的外植體大都是田間或室內培養的作物的一部分，這些外植體的表面常常會不同程度的附著微生物，而這些微生物如果在組織培養操作過程中進入培養基中就會造成培養基污染。所以一般的外植體都不能直接進行組織培養操作，必須先進行嚴格的滅菌操作，無菌外植體才能進行后續的組織培養操作。外植體滅菌的目的既要徹底殺死材料表面的全部微生物，又要盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。在此基礎上，操作要簡便不繁瑣，以免增加染菌的幾率。因此，在植物組織培養中，要根據不同的外植體材料，選用適當的殺菌劑、合適的濃度和處理時間，靈活掌握。常用的外植體殺菌劑有(1)乙醇，乙醇具有脫水作用和溶脂性，它能使蛋白質脫水、變性、沉淀及質膜破損，使微生物致死，是一種常用的外植體表面殺菌劑。乙醇滅菌時間不宜過長，約30s即可殺死外植體表面的絕大部分微生物，延長滅菌時間會增加外植體損傷程度。(2)次氯酸鹽，一種強氧化劑，因為在水中形成次氯酸，次氯酸分解后形成鹽酸和新生態氧，因此具有殺菌效果。( 升汞，Hg2+與帶負電的蛋白質結合，使菌體蛋白變性，酶失活。HgCl2是劇毒藥品，經過其滅菌的外植體需徹底除去殘留的Hg2+，以消除殘留升汞對外植體的傷害。此外，還經常用新潔爾滅、抗生素類等作為殺菌劑。然而，用上述這些方法對外植體滅菌會對外植體產生很大的傷害，尤其是用升汞滅菌外植體，不僅對外植體會有傷害， 如果在操作過程中不小心可能對操作人員身體也有一定的傷害。
發明內容
本發明的目的在于提供一種口杯法便捷外植體滅菌的方法，針對有干燥種皮或堅硬外殼包裹的外植體提出的一種節約成本、操作便捷、對外植體傷害小、滅菌較徹底的滅菌和手套的污染率，間接的提高了外植體的生長率，提高了經濟效益。本發明提供的口杯法便捷外植體滅菌的方法包括的步驟如下1)將需要滅菌的有干燥外表皮包裹的外植體放入口杯匹配的網兜中，再放入盛有次氯酸鈉溶液和鹽酸溶液的口杯中密閉；2)把口杯放到底部盛有水或堿性液體(用以吸收外漏的氯氣)的密閉的大容器內密閉；3)放置2-8小時后把口杯拿到滅菌的超凈臺中，打開口杯蓋，戴上無菌手套把網兜取出，把滅好菌的外植體倒入事先準備好的容器中，就得到了無菌的外植體。本發明提供了一種口杯法便捷外植體滅菌的方法，不采用傳統的滅菌方法，對于外表有干燥的種皮或者其他組織包被的外植體，比如用70-75%的酒精浸泡滅菌、用20%的次氯酸鈉浸泡滅菌或者用升汞滅菌等方法，而是確保外植體表面干燥后，把外植體放入口杯的網兜中，如果外植體很小，可以先把外植體用透氣的材料包裹再放入網兜中，然后在口杯中分別加入次氯酸鈉溶液和濃鹽酸溶液，反應生成氯氣，迅速把網兜放入口杯中使外植體處于氯氣中，放置適當時間后在超凈臺中取出外植體，這樣就得到了無菌的外植體。針對有干燥種皮或堅硬外殼包裹的外植體提出的一種節約成本、操作便捷、對外植體傷害小、 滅菌較徹底的滅菌和手套的污染率，間接的提高了外植體的生長率，提高了經濟效益。
圖1是實施例1使用的設備示意圖。圖2是是實施例2使用的設備示意圖。圖3是網兜放進口杯并蓋好口杯操作狀態示意圖。圖4是本發明操作狀態圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明詳細描述具體的操作步驟如下1、準備300ML的口杯(帶網兜)、量筒、移液槍、小三角瓶、一次性PE手套、次氯酸鈉溶液、濃鹽酸溶液、口罩。2、在口杯中倒入20ML質量濃度百分數為20%的次氯酸鈉，在小三角瓶中加入2ML 濃鹽酸，或者按次氯酸鈉濃鹽酸=10 1的比例(體積比)準備，把需要滅菌的有干燥外表皮包裹的外植體放在網兜內備用。外植體較小時，可先用透氣材料，如濾紙等包好再放進網兜。3、戴上口罩和手套在通風的地方將小三角瓶中的濃鹽酸迅速的倒入口杯中，把網兜放進口杯并蓋好口杯，然后把口杯放到底部盛有水或堿性液體(用以吸收外漏的氯氣) 的帶蓋的密閉大容器內，然后蓋好容器。4、放置適當的時間后把口杯拿到滅菌的超凈臺中，打開口杯蓋，戴上無菌手套把網兜取出，把滅好菌的外植體倒入事先準備好的容器中，就得到了無菌的外植體。 5、迅速把口杯放回到容器中并蓋好蓋子。6、把口杯放在一個帶蓋子的大容器中，容器底部放適量的水或堿性液體，以吸收外漏的氯氣。2-8小時后，可得到無菌的外植體。實施例1挑取種皮完整、無病斑且干燥的大豆種子(圖1，大豆顆粒大，可直接放入網兜)， 將其倒入與口杯配套的網兜中，然后準備好所需的口杯、三角瓶、口罩、手套、20%的次氯酸鈉溶液、濃鹽酸溶液。在通風的地方，將2ML的濃鹽酸加入盛有20ML的次氯酸鈉水溶液的口杯中，迅速把盛有大豆種子的網兜放入口杯并蓋好蓋子，再把口杯放進盛水的大容器中， 最后把容器蓋好。動作要快，以免太多氯氣泄漏到環境中。5小時后在無菌的超凈臺中取出大豆，放在無菌的容器中，這樣就得到無菌的大豆種子，并且種子的發芽率很高。滅完菌的大豆種子在密封的無菌容器中放置2周再進行組織培養操作仍可保持無菌狀態。設定滅菌時間的梯度為ai，3h，4h，5h，Mi，7h，ai七個梯度，每次滅菌大豆種子100粒，分不同批次進行。滅菌后將大豆種子接種于發芽培養基(MSB5+aiig/L 6-BA+15g/L蔗糖 +8g/L瓊脂，pH5. 6)，五天后測定污染率(污染的外植體數占總外植體數的百分數)和發芽率(發芽的外植體數占總外植體數的百分數)如下表1
權利要求
1.一種口杯法便捷外植體滅菌的方法，其特征在于包括的步驟1)將需要滅菌的有干燥外表皮包裹的外植體放入口杯匹配的網兜中，再放入盛有次氯酸鈉溶液和濃鹽酸溶液的口杯中密閉；2)把口杯放到底部盛有水或堿性液體的密閉的大容器內密閉；3)放置2-8小時后把口杯拿到滅菌的超凈臺中，打開口杯蓋，戴上無菌手套把網兜取出，把滅好菌的外植體倒入事先準備好的容器中，就得到了無菌的外植體。
2.如權利要求1所述的外植體滅菌的方法，其特征在于所述的次氯酸鈉溶液的質量百分比濃度為20%
3.如權利要求2所述的外植體滅菌的方法，其特征在于所述的20%的次氯酸鈉濃鹽酸=10 1，體積。
全文摘要
本發明提供的是一種簡便的用氯氣對外植體滅菌的方法。操作步驟是將有干燥外表皮包裹的外植體放在普通口杯的網兜中，口杯中先后倒入次氯酸鈉溶液和濃鹽酸溶液產生氯氣時，外植體便處在氯氣環境中進行滅菌且與次氯酸鈉溶液和濃鹽酸溶液是分隔開的，滅菌適當時間后就得到無菌的外植體。該方法的優勢為相比用次氯酸鈉或升汞等直接浸泡滅菌，該方法對外植體的傷害更小、滅菌更徹底；相比將氯氣和外植體放入干燥器中滅菌，該方法操作更簡便，避免了滅菌后的外植體從干燥器中拿到超凈臺時染菌。用該方法對外植體滅菌的整個過程只需普通口杯、次氯酸鈉溶液和濃鹽酸溶液，數小時后就可以達到理想的滅菌效果，操作簡便。
文檔編號A01H4/00GK102293155SQ201110202739
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者關春峰, 季靜, 王罡, 鄭麗紅 申請人:天津大學