專利名稱：一種內生多粘類芽孢桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，更具體的說是涉及一種內生多粘類芽孢桿菌。
背景技術：
胡椒(Piper nigrum L.)是胡椒科胡椒屬多年生常綠攀緣藤本植物，是世界重要的熱帶特色香辛料作物，為人們最常用、最喜愛的調味品之一，在食品、醫療保健等領域用途廣泛。胡椒瘟病是一種氣候依賴性病害，常在雨季時發生，它是由疫霉菌感染而引起的一種傳染力很強的土傳性病害。自引種胡椒以來，胡椒瘟病就一直是危害我國胡椒生產的首要病害，病情嚴重時胡椒園損失達90%以上，甚至全園毀滅，給我國胡椒種植業帶來不可估量的損失，為此我國對胡椒瘟病的防治技術進行了較為深入的研究。目前，對胡椒瘟病的防治主要依賴化學防治技術，如噴施甲霜靈霜 霉威WP。雖然化學防治能夠達到較好的防治效果，但長期使用化學農藥不僅會產生農藥殘留，降低胡椒品質，而且還會隨著化學農藥的長期頻繁使用引起胡椒瘟病病菌的抗藥性，致使胡椒瘟病近年來有逐年加重之勢。因此，有效、安全、生態地防治胡椒瘟病就成為胡椒種植業的首要目標。生物防治是現階段提出的一種防治胡椒瘟病的技術手段，它以胡椒瘟病菌株為指示菌，從土壤中中篩選出能夠抑制胡椒瘟病菌株的微生物進行生物防治，這種方法有效避免了利用化學防治技術所帶來的抗藥性以及環境污染問題。然而，胡椒瘟病菌株的組成類群十分復雜，而現有篩選時以典型或單一的胡椒瘟病菌株為指示菌，故篩選出的微生物具有一定局限性，其防治效果遠不如化學防治效果。此外，現有篩選出的微生物隨著傳代次數的增加，其對胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性逐漸降低，遺傳穩定性較差。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種內生多粘類芽孢桿菌，使得該菌株防治胡椒溫病的效果與化學防治胡椒瘟病的效果無明顯差別，且具有較高的遺傳穩定性。為實現上述目的，本發明提供一種從胡椒葉片中分離得到的內生菌，命名為菌株 S，菌株S在PDA平板表面生長的菌落為圓形，表面中間突起，有光澤，并且生長物粘稠；革蘭氏染色為陰性；芽孢染色為陽性，芽孢一般在菌體中間；莢膜染色為陽性(有莢膜形成)； 鞭毛染色為陽性，鞭毛為兩端生，運動能力不強；菌體形態為桿狀，單生。接觸酶、V.P.反應、淀粉水解、硝酸鹽還原反應、明膠液化均為陽性。檸檬酸鹽利用、脲酶試驗、甲基紅反應均為陰性。菌體在PH5. 7的培養基上生長良好，不能在含有7 % NaCl的培養基上生長。此外， 經16S DNA檢測分析，與菌株S同源性高的50個菌株均是類芽孢桿菌，同源性高達99 %，結合生理生化特征，鑒定其為內生多粘類芽孢桿菌。本發明所述內生多粘類芽孢桿菌已于2011年5月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4843。本發明所述內生多粘類芽孢桿菌傳代培養的第1代、第10代、第20代、第30代、 第40代對胡椒瘟病病菌孢子的抑制試驗顯示，所述內生多粘類芽孢桿菌從第1代至第40 代抑制胡椒瘟病病菌孢子萌發的EC5tl無顯著差異，且均在5. 13%以下，表明本發明所述內生多粘類芽孢桿菌具有較好的抑制效果，且遺傳穩定性較高，不會隨傳代次數的增加而降低對胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性。本發明所述內生多粘類芽孢桿菌與甲霜靈霜·霉威WP對胡椒瘟病防效試驗結果顯示，兩者的防效相當，無明顯差異。表明本發明所述內生多粘類芽孢桿菌防效較高，達到化學防治的效果，能夠應用在防治胡椒瘟病以及制備防治胡椒瘟病制劑中。本發明還提供一種生防制劑，包括保藏編號為CGMCC No. 4843的內生多粘類芽孢桿菌。本發明所述生防制劑可以在胡椒移栽前噴霧使用，也可以做成堆肥使用，或者稀釋后在移栽時灌根使用。本發明所述所述生防制劑的制備方法如下將保藏編號為CGMCC No. 4843的內生多粘類芽孢桿菌于PDA培養液中培養，然后過濾并調節菌液孢子數為IO8-IOki個/mL，即得生防制劑成品。其中，所述培養的溫度優選為^5-3(TC，更優選為^°C，所述培養的天數優選為 4-6d，更優選為5d。由以上技術方案可知，本發明所述內生多粘類芽孢桿菌傳代至40代仍然具有較高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性，具有較高的遺傳穩定性，同時其防治胡椒瘟病的效果達到化學防治的效果，且不污染環境，生態、安全，能夠廣泛應用在胡椒瘟病的防治以及制備防治胡椒瘟病制劑中。生物保藏說明分類命名多粘類芽孢桿菌，Paenikicillus polymyxa.于2011年5月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 4843。
具體實施例方式本發明公開了一種內生多粘類芽孢桿菌，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述內生多粘類芽孢桿菌已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例1 本發明所述內生多粘類芽孢桿菌的分離方法從胡椒瘟病發病重區采回生長健康的葉片，用無菌手術刀切成約2cmX2cm規格的組織塊，無菌水沖洗數次，在75%的酒精中浸泡lmin，滅菌水沖洗3次，將組織塊置于無菌研缽中，用剪刀剪碎后加無菌水研磨，靜置30min，稀釋成IO-1UO-2UOl個梯度，分別移取最后1次沖洗液和研磨液各0. 3mL，涂抹于PDA培養基平板上，最后1次沖洗液作為CK， 于下培養，逐日觀察。選擇CK中無菌落，而研磨液中長出菌落的菌株，并根據菌落形態、顏色等特征挑取單菌落，純化編號后，在平皿內對峙培養檢測其對胡椒瘟病病菌的抑制作用，選擇形成抑菌帶的菌株，命名為菌株S。實施例2 本發明所述內生多粘類芽孢桿菌生理生化以及16S DNA序列的測定1、生理生化檢測檢測菌株S在PDA平板上的生長情況、菌落形態與顏色、革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等，方法參照方仲達主編的《植病研究方法》182頁的方法進行。檢測菌株S的的生理生化特性，包括石蕊牛奶、接觸酶、V. P.反應、淀粉水解、硝酸鹽還原反應、明膠液化反應、氧化酶、M. R、苯丙氨酸脫氨酶、檸檬酸鹽利用、脲酶試驗、丙酸鹽的利用、是否可以在含NaCl和pH5. 7的培養基上生長等試驗，方法參照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細菌系統鑒定手冊》353-385頁的方法。檢測結果如下在PDA平板表面生長的菌落為圓形，表面中間突起，有光澤，并且生長物粘稠；革蘭氏染色為陰性；芽孢染色為陽性，芽孢一般在菌體中間；莢膜染色為陽性(有莢膜形成)； 鞭毛染色為陽性，鞭毛為兩端生，運動能力不強；菌體形態為桿狀，單生。接觸酶、V.P.反應、淀粉水解、硝酸鹽還原反應、明膠液化均為陽性。檸檬酸鹽利用、脲酶試驗、甲基紅反應均為陰性。菌體在PH5. 7的培養基上生長良好，不能在含有7% NaCl的培養基上生長。2、16S DNA序列的測定參照Ausubel的細菌基因組DNA制備方法，用細菌通用引物27F和1492R進行PCR 擴增。PCR 反應體系為 25μ1，其中 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，Primer27F 和 Primerl492R(25pmoL) # 1 μ 1, dNTP Mixture 0.5 μ 1, Taq DNA Polymerase (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 17. 5 μ 1，DNA 模板 2 μ 1。PCR 擴增反應條件95°C 4min ；95°C lmin，55°C 40s, 72°C 2min，共 30 個循環； 然后 72°C保持 7min。PCR 產物用 EZ-10 SpinColum DNA Gel Extraction Kit 回收試劑盒進行回收，并委托寶生物工程(大連)有限公司進行測序。測得的基因序列用BLAST軟件進行序列比對分析，并與GenBank中已知的16S rDNA進行同源性比較。檢測結果如下將該PCR擴增產物在GenBank中(登錄號JF747221)進行BLAST比對。結果表明，與S菌株同源性高的50個菌株均是類芽孢桿菌屬(Paenikicillus sp.)，其同源性達 99%，其中表1所示為與菌株S的16S rDNA同源性最高的10個菌株，由此可推斷菌株S屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)。表1 16S rDNA同源性比較
權利要求
1.一種內生多粘類芽孢桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC No. 4843。
2.權利要求1所述內生多粘類芽孢桿菌在防治胡椒瘟病中的應用。
3.權利要求1所述內生多粘類芽孢桿菌在制備防治胡椒瘟病制劑中的應用。
4.一種生防制劑，其特征在于，包括保藏編號為CGMCC No. 4843的內生多粘類芽孢桿菌。
5.權利要求4所述生防制劑在防治胡椒瘟病中的應用。
6.一種生防制劑的制備方法，其特征在于，將保藏編號為CGMCC No. 4843的內生多粘類芽孢桿菌于PDA培養液中培養，然后過濾并調節菌液孢子數為IO8-IOki個/mL，即得生防制劑成品。
7.根據權利要求6所述制備方法，其特征在于，所述培養的溫度為26-30°C。
8.根據權利要求7所述制備方法，其特征在于，所述培養的溫度為^°C。
9.根據權利要求6所述制備方法，其特征在于，所述培養的天數為4-6d。
10.根據權利要求9所述制備方法，其特征在于，所述培養的天數為5d。
全文摘要
本發明涉及微生物領域，具體公開了一種內生多粘類芽孢桿菌。本發明所述內生多粘類芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4843。本發明所述內生多粘類芽孢桿菌傳代至40代仍然具有較高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性，具有較高的遺傳穩定性，同時其防治胡椒瘟病的效果達到化學防治的效果，且不污染環境，生態、安全，能夠廣泛應用在胡椒瘟病的防治以及制備防治胡椒瘟病制劑中。
文檔編號A01P3/00GK102250815SQ20111020521
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月21日 優先權日2011年7月21日
發明者劉愛勤, 桑利偉, 茍亞峰, 譚樂和, 鄔華松 申請人:中國熱帶農業科學院香料飲料研究所