多粘芽孢桿菌固體發酵產孢的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵領域，具體地說，涉及多粘芽孢桿菌固體發酵產孢的方法。
【背景技術】
[0002]多粘芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，是芽抱桿菌科(Bacillace-ae)類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的革蘭氏陽性細菌，多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)的細胞呈直桿狀，菌落多呈淺黃色或白色，隆起，粘稠狀，表面濕潤光滑。利用周生鞭毛運動，在膨大孢子囊中產生橢圓型芽孢；最適生長pH值為7.0，最適溫度為28-30°C，兼性厭氧，分解葡萄糖和其他糖類產酸，有時產氣，在營養瓊脂上無可溶性色素。
[0003]多粘芽孢桿菌是被美國環境保護署列為可商業應用的微生物種類之一，目前報道該菌廣泛用于農業、醫藥、工業等方面。在工業方面主要應用于酶制劑的生產，在農業中的應用主要有兩個方面:其中最主要的一方面是它可以防治多種由卵菌、真菌、細菌、線蟲引起的植物病害，另一方面是它可以促進植物生長。據目前研究來看，多粘芽孢桿菌能夠防治玉米葉斑病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、黃瓜灰霉病菌等19種病原真菌和番茄青枯病菌、大白菜軟腐病菌等兩種病原細菌的生長。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供多粘芽孢桿菌固體發酵產孢的方法。
[0005]為了實現本發明目的，本發明提供的多粘芽孢桿菌固體發酵產孢的方法，包括多粘芽孢桿菌菌種活化、一級液體種子液的制備、二級液體種子液的制備以及固體發酵的步驟。
[0006]其中，用于固體發酵生產多粘芽孢桿菌孢子的固體發酵培養基，包括如下重量份的各組分:玉米秸桿粉2-4.5、豆柏粉2-4.5和0.5%氯化鈉溶液4_6。所述玉米秸桿粉的細度為20目。
[0007]液體補料培養基為:蔗糖5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸錳5g/L、硫酸錳5g/L。以水配制。
[0008]優選地，用于固體發酵生產多粘芽孢桿菌孢子的固體發酵培養基，包括如下重量份的各組分:玉米秸桿粉2.5、豆柏粉2.5和0.5%氯化鈉溶液5。
[0009]固體發酵的方法為:
[0010]將二級液體種子液按15% -20%的接種量接種至固體發酵培養基中，于淺盤發酵設備中35°C，通氣量2.5L/min，相對濕度85%以上的條件下，培養1.5-2.5天，然后進行培養基補充，即向固體發酵培養基上噴灑液體補料培養基，繼續培養，待產孢量達到85 %以上時，提高培養溫度至45°C，繼續培養6h后取出培養物。
[0011]優選地，進行培養基補充時，向固體發酵培養基上噴灑液體補料培養基，補料的比例為1:4干物質量計(即向固體發酵培養基上噴灑相當于其質量25%的液體補料培養基)，繼續培養2-2.5天，待產孢量達到85%以上時，提高培養溫度至45°C，繼續培養6h后取出培養物，干燥至水分含量為8%以下。
[0012]前述方法中，一級液體種子液的制備方法為:將活化后的多粘芽孢桿菌挑2-3環菌種接種至肉湯培養基中(1000ml三角瓶，裝液量為400ml，121 °C高壓滅菌15min)，于35°C，200r/min的條件下發酵20h，發酵過程中控制pH值7.0，即得一級液體種子液。
[0013]前述方法中，二級液體種子液的制備方法為:將一級液體種子液按10 %的接種量接種至肉湯培養基中，于發酵罐中，35°C，180r/min，通氣量3L/min條件下，發酵培養18h，即得二級液體種子液。
[0014]本發明還提供一種制備多粘芽孢桿菌孢子粉的方法，按照上述多粘芽孢桿菌孢子的生產方法，固體發酵培養結束后，將發酵基質干燥(例如50°C )后粉碎，即得多粘芽孢桿菌孢子粉。
[0015]本發明中用于發酵生產多粘芽孢桿菌孢子的多粘芽孢桿菌菌株購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，保藏編號為10122。
[0016]本發明提供了一種多粘芽孢桿菌固體發酵產孢的方法，多粘芽孢桿菌經菌種活化，一級液體種子液的制備和二級液體種子液的制備，再采用固體發酵方法發酵產生孢子。所述固體發酵使用的固體發酵培養基由玉米秸桿粉、豆柏粉和無機鹽(氯化鈉)組成，固體發酵過程中向培養基上噴灑補料培養基。采用本發明提供的多粘芽孢桿菌固體發酵產孢的方法，可產生大量的孢子，基質孢子量最高可達279 X 108cfu/g,發酵單位高，生產過程不產生廢料，環保無污染。發酵所獲得的孢子-基質混合物經干燥后可直接用于農作物的生防。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0018]本發明中涉及到的百分號“ ，若未特別說明，是指質量百分比；但溶液的百分比，除另有規定外，是指100mL溶液中含有溶質的克數。
[0019]以下實施例中培養基配方涉及的“份”是指重量份。液體補料培養基為:鹿糖5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸錳5g/L、硫酸錳5g/L，以水配制。
[0020]實施例1固體發酵生產多粘芽孢桿菌孢子
[0021]包括以下步驟:
[0022]1、斜面種子的制備
[0023]將購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)的保藏編號為10122的多粘芽孢桿菌菌種在營養瓊脂試管斜面上活化。
[0024]2、一級液體種子液的制備
[0025]將活化后的多粘芽孢桿菌挑2-3環菌種接種至肉湯培養基中(1000ml三角瓶，裝液量為400ml，121°C高壓滅菌15min)，于35°C，200r/min的條件下發酵20h，發酵過程中控制pH值7.0，即得一級液體種子液。
[0026]3、二級液體種子液的制備
[0027]將一級液體種子液按10% (v/v)的接種量接種至肉湯培養基中，于35°C，180r/min，通氣量3L/min條件下，發酵培養18h，得到二級液體種子液。
[0028]4、固體發酵
[0029]將二級液體種子液按20% (種子液/固體培養基)的接種量接種至固體發酵培養基中，于淺盤發酵設備中35°C，培養期間通入無菌空氣，通氣量2.5L/min，相對濕度85%以上的條件下，培養2天后用滅菌的噴灑壺向固體發酵培養基上噴灑補加經滅菌的液體補料培養基，補料的比例為1:4干物質量計。繼續培養2.5天，鏡檢產孢量達到85%以上，提高培養箱溫度至45°C，繼續培養6小時后取出培養物，干燥至水分含量為8%以下。
[0030]每天對發酵盤取樣鏡檢，如有雜菌感染則取出滅菌后丟棄。
[0031]用于固體發酵生產多粘芽孢桿菌孢子的固體發酵培養基配方為:玉米秸桿粉(細度為20目)2.5份、豆柏粉2.5份和0.5%氯化鈉溶液5份。將配制好