專利名稱：一種利用轉大豆gtpchi和adcs基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，具體地，涉及一種利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法。
背景技術：
葉酸(folates)是四氫葉酸(THF)及其衍生物的總稱，是一類水溶性B族維生素，又稱為維生素B9、維生素BI I、維生素M，其化學結構如圖12所示。其中，THF由三部分組成一個喋啶環(2-氨基-4-羥基-6-甲基喋啶)，對氨基苯·甲酸pABA，和多聚谷氨酸(poly-Glu)(l-8fGluX連接)，又名喋酰谷氨酸。不同氧化狀態的一碳單位，例如甲基，亞甲基，次亞甲基，甲酰基，連接到喋啶環的N5、pABA的NlO或橋連兩者從而形成四氫葉酸(THF)、5_甲基THF、5-甲酰THF、5，10-亞甲基THF多種葉酸衍生物。THF及其衍生物作為一碳單位的供體和受體，是介導一碳單位轉移反應的重要因素。植物和微生物可以從頭合成葉酸從而滿足自身需求，而人類及動物則不能合成葉酸，只能通過飲食來獲取。食用植物中除菠菜、豆類和椰菜等其葉酸的含量相對較高外，其他食物如糧食作物、蔬菜水果等的葉酸含量都很低，遠不能滿足人體對葉酸的需求量。一般正常人葉酸的需要量為200 400 μ g/d，世界衛生組織建議成人至少為200 μ g/d，孕婦和乳母為400 μ g/d。葉酸是維持生物體正常生命過程所必需的一類有機物質，它對人體的重要營養作用早在1948年即已得到證實。人類(或其他動物)如缺乏葉酸可引起巨紅細胞性貧血以及白細胞減少癥，并會增加心血管疾病及癌癥的發病率；葉酸對孕婦尤為重要，如在懷孕頭3個月內缺乏葉酸，可導致胎兒神經管發育缺陷，從而增加脊柱裂、無腦畸形的發生率，在懷孕的前6周內若葉酸攝入不足，嬰兒患無腦及脊柱裂畸形的可能性會增加4倍，其次，孕婦經常補充葉酸，可防止新生兒體重過輕、早產以及嬰兒腭裂(兔唇)等先天性畸形；葉酸與維生素B12共同促進紅細胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質；而且葉酸在體內參與DNA、氨基酸、泛酸等的合成；葉酸可提供大量游離碳離子，供給制造神經末稍和構成傳遞神經沖動的重要化學物質原料，來保證人體神經系統的正常發育。臨床上還發現葉酸具有抗腫瘤、促進嬰幼兒的神經細胞與腦細胞發育及輔助治療精神分裂癥等作用。葉酸缺乏的現象在全球普遍存在，尤其在經濟水平和生活水平較低的發展中國家和不發達國家。據調查顯示，在發展中國家每年因葉酸缺乏而導致的嬰兒出生缺陷至少有20萬例，因葉酸缺乏而引起孕婦貧血的病例至少有1000萬。目前美國和一些西方國家采取在食品中添加人工合成葉酸制劑的政策來滿足人類需求，而這很難在食品加工業系統不健全、人口分布不平衡、經濟條件有限的發展中國家實行，同時長期服用人工合成的葉酸是否會對人體帶來不良副作用也很令人擔憂。隨著生物技術的日益發展，通過基因工程的手段改造葉酸合成代謝途徑來提高食物中葉酸含量具有很大的吸引力和極其重要的意義。
植物體內葉酸的生物合成已經研究的較為清楚，合成部位涉及到3個不同的亞細胞結構，即質體、線粒體和細胞質，分為三個分支，其分支圖如圖13所示。其中，蝶呤部分是在細胞質內以GTP為前體合成，對氨基苯甲酸的合成是以分支酸為前體在質體內合成，蝶呤和對氨基酸甲酸運輸到線粒體參與合成葉酸。在此過程中，有兩個關鍵酶，包括在蝶呤分支中，第一步反應中的GTP環化酶I (GTP cyclohydrolase I，GTPCHI)，能夠催化GTP形成二氫新蝶呤三磷酸(DHNTP)，以及在pABA合成途徑的第一步反應中的氨基脫氧分支酸合成酶(ADCS)。近年來的研究發現這兩種葉酸關鍵酶在植物中的共表達可以有效提高植物中的葉酸含量。Rocio I等(2007)在研究中發現擬南芥GTPCHI過表達的轉基因番茄中，葉酸含量高的果實中對氨基苯甲酸消耗殆盡，所以得出適當提高蝶呤的合成可增加組織中葉酸的含量。PABA的不足使得葉酸含量僅提高了 2倍，推測在轉GTPCHI基因的植株中補充PABA則能進一步提高葉酸含量。之后，他們將過量表達PABA和過 量表達蝶呤的植株雜交，使這兩個性狀結合后，其成熟果實中葉酸含量提高了約25倍。這說明在番茄中GTPCHI和ADCS的共同作用對葉酸的合成很重要。大豆中葉酸的含量較高，大豆的GTPCHI和ADCS對葉酸的合成是否存在協同增效還沒有報道。將大豆的GTPCHI和ADCS共表達，為進行作物蔬菜等的轉化，提高糧食作物蔬菜中葉酸的含量，從而滿足人類的日常需求，降低新生兒的出生缺陷，增強抵抗力，預防心血管疾病、癌癥的發生等具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法。根據本發明的一種利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，包括將上述兩種大豆基因=GmGTPCHI基因和GmADCS基因轉入植物并共表達的步驟，其中，大豆GmGTPCHI基因的⑶S序列如SEQ ID No. I所示，大豆GmADCS基因的⑶S序列如SEQ ID No. 2所示。根據本發明的利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其中，將大豆GTPCHI和ADCS基因共表達的方法如下方法(I)分別構建大豆GTPCHI和ADCS基因的表達載體，然后導入目的植物中，共表達；或方法(2)構建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯的共表達載體，然后導入目的植物中，共表達。具體地，對于方法(I)，可以將大豆的GmGTPCHI和GmADCS基因的⑶S分別構建到植物過表達載體，并分別侵染到植物中，其中，選用GmGTPCHI侵染的陽性轉基因植株做父本，GmADCS侵染的陽性轉基因植株做母本，進行雜交得到獨立的轉基因株系。根據本發明的實施例，用RT-PCR技術檢測了轉基因雜交植株中目的基因的表達水平，并測定這些植株中的葉酸含量，結果表明，比GmGTPCHI和GmADCS單獨侵染的植株均有明顯提高，比野生型提高了 2. 5 4. 5倍。或者，根據本發明的實施例，對于方法(2)，可以將大豆GmGTPCHI和GmADCS分別由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子驅動，串聯到pCAMBIA3301載體上，侵染植物，將收獲的種子在抗性培養基上篩選，獲得轉基因植株。用RT-PCR技術檢測了轉基因植物中目的基因的表達水平，并測定這些植株中的葉酸含量，發現比GmGTPCHI和GmADCS單獨侵染的植株均有明顯提高，比野生型提高了 3 4. 5倍。因此，根據本發明的技術方案，將大豆的葉酸合成關鍵酶GTPCHI和ADCS在其它植物中共表達，發現兩個酶共同作用可顯著提高擬南芥的葉酸含量，這為進行作物蔬菜水果等的轉化奠定了基礎，人類可通過飲食直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現象，并克服了長期服用葉酸片劑帶來的不良副作用。
圖I為雜交陽性轉基因植株的基因型鑒定。所示為PCR擴增的部分電泳圖，其中
4、5、6、7、8、10、11 為轉入 GmGTPCHI 基因的植株，1、2 、4、5、6、7、8、9、11、12 為轉入 GmADCS 基因的植株。圖2為雜交陽性轉基因植株中GmGTPCHI、GmADCS表達水平檢測。野生型擬南芥(WT)為陰性對照，在轉基因陽性植株中均檢測到目的基因的表達，表達量在不同植株中存
在差異。圖3為雜交植株葉酸含量分析。WT野生型為對照，GTPCHI為單獨轉入GmGTPCHI的植株，ADCS為單獨轉入GmADCS的植株，GA1-GA6為雜交株系。圖4為GmGTPCHI和GmADCS同時克隆到pCAMBIA1301的載體圖示。圖5為串聯載體侵染野生型擬南芥植株基因型鑒定。其中Cl、C2、C4、C6、C7、C8為陽性轉基因植株。圖6為串聯載體陽性轉基因植株基因GmGTPCHI、GmADCS表達水平分析。野生型擬南芥(WT)為陰性對照，在轉基因陽性植株中均檢測到目的基因的表達，且表達量在不同植株中存在差異。圖7為串聯載體陽性轉基因植株葉酸含量分析。圖8為轉GmGTPCHI基因植株基因型鑒定，1-13為GmGTPCHI侵染后的擬南芥植株，1、3、5-11、13為陽性轉基因植株。圖9為轉GmGTPCHI基因植株葉酸含量的測定結果，具體地，是測定兩種主要的葉酸存在形式5-甲基THF和5-甲酰THF的含量之和。圖10為轉基因植株基因型的鑒定，其中1_4、6、7、10-12為陽性轉基因植株。圖11為轉基因植株中pABA含量的測定，發現轉基因植株pABA含量比野生型有所提聞。
圖12為葉酸的化學結構。
圖13為植物體內葉酸的生物合成分支圖。
具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例I、GmGTPCHI基因的克隆及表達I、獲得大豆GTPCHI基因的EST序列
由于來源于不同物種的GTPCHI基因應該具有一定程度的同源性，或存在保守的結構域。為此，將擬南芥的GTPCHI基因的⑶S序列與大豆的EST序列在NCBI上進行比對，獲得大豆GTPCHI基因的EST序列。2、PCR擴增得到GmGTPCHI基因片段及其序列分析取大豆葉片lOOmg，采用Trizol法提取總RNA，經DNase I處理后，檢測RNA純度和濃度，取I U g用反轉錄試劑盒First strand cDNA systhesis (購自Fermentas)獲得cDNA。以大豆GTPCHI基因的EST序列為模板設計引物，以大豆cDNA為模板進行擴增。獲得約700bp條帶，測序為大豆GTPCHI的片段序列，分別將序列與5’端的EST和3’端EST序列在Vector NTI中進行組裝拼接。以GTPCHI-3FW、GTPCHI_7RV為引物分別進行PCR擴增(引物序列見表1)，得到1400bp左右的產物，將這些片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收，分別連到P-EASY-Tl載體(購自全式金公司)，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，藍白斑篩選和菌落PCR獲得陽性克隆。經測序分析，得到1380bp目的片段，命名為GmGTPCHI。3、5’和3’ RACE獲得GmGTPCHI基因的全長 以上述得到的序列GmGTPCHI為模板，分別設計5’ RACE和3’ RACE引物，分別命名為GmGTPCHI5’RACE，GmGTPCHI5’RACE nest,GmGTPCHI3JRACE,GmGTPCHI3JRACE nest (引物序列見表I)。采用Trizol法提取大豆葉片總RNA,根據geneRACE試劑盒(購自invitrogen)的說明書上的方法得到5’和3’ RACE的cDNA，以5’和3’ RACE的cDNA為模板，用上述的5’ RACE和3’ RACE引物，分別進行巢式PCR。將PCR獲得條帶回收并連接p_EASY_Tl載體進行測序，測序結果與網站公布的GmGTPCHI UTR序列一致。經序列分析得到大豆葉酸關鍵酶基因GmGTPCHI完整的CDS序列1380bp。表I大豆GTPCHI基因克隆引物序列
一引物名稱序列5’-3’
GTPCHI3-FWATGGAGCATTTGGGTCAGTATG
GTPCHI7RVTCAAAGAGATGTAGCATTTGG
GmGTPCHIS5RACECCTTCGC ACTTTGCTTGTAACCTC
GmGTPCHIS5RACE nest GTGGTGTCTTTATAATGCCTTCCCTG GmGTPCHD 5RACEGTGATAGTGGTGGTGGAAGC AAGTC
GmGTPCHD ;RACE nest GACCTTGCTGCAAGAACCTCGTTTC4、轉GmGTPCHI基因擬南芥葉酸含量的鑒定將大豆的GmGTPCHI的⑶S序列構建到植物表達載體pH2GW7上，由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子驅動，得到重組載體pH2GW7-GmGTPCHI。將載體電擊轉化入農桿菌LBA4404，挑取酶切鑒定正確的克隆，利用農桿菌介導的花沾法侵染野生型擬南芥，收獲的種子記為Ttl代。Ttl代種子首先在1/2MS+潮霉素B (25mg/L)的抗性培養基上篩選，獲得13株陽性綠苗(記為T1代)，并移入溫室中培養20天，分別取葉片提取DNA，PCR鑒定轉基因植株，其中1、3、5-11、13為陽性轉基因植株(如圖8所示)。利用高效液相色譜測定法檢測這些轉基因陽性植株中的葉酸含量，主要是檢測5-甲基THF和5-甲酰THF這兩種主要的葉酸衍生物含量，結果發現GmGTPCHI轉基因植株比野生型提高了 I. 6 2倍(如圖9所示)O
實施例2、GmADCS基因的克隆及表達I、獲得大豆ADCS基因的EST序列將擬南芥的ADCS基因的⑶S序列與大豆的EST序列在NCBI上進行比對，獲得大豆GTPCHI基因的EST序列。2、PCR擴增得到GmADCS基因片段及其序列分析取大豆葉片lOOmg，采用Trizol法提取總RNA，經DNase I處理后，檢測RNA純度和濃度，取I U g用反轉錄試劑盒First strand cDNA systhesis (購自Fermentas)獲得cDNA。以大豆ADCS基因的EST序列為模板設計引物，以大豆cDNA為模板進行擴增。獲得約1300bp條帶，片段回收后連p-EASY-Tl載體，挑取8個陽性克隆進行測序，與3’EST進行比對，發現其中6個克隆的測序結果一致且與3’ EST匹配，大小為1352bp。將獲得的1352bp序列與已經公布的大豆基因組序列比對，發現與大豆10號染色體的一段序列一致性很高，且其預測的⑶S序列2304bp，根據預測的⑶S序列設計引物ADCSMF和ADCSMR(引物序列見·表2)，PCR擴增得到GmADCS基因的大部分⑶S序列2296bp。3、5’和3’ RACE獲得GmADCS基因的全長Trizol法提取大豆葉片提取總RNA,經DNase I處理后，取5 μ g,根據geneRACE試劑盒(購自invitrogen)的方法獲得cDNA。根據已獲得序列5’端260bp處設計引物ADCS5’RACE，180bp處設計引物ADCS5, RACE nest (引物序列見表2)。之后做巢式PCR。電泳檢測得到SOObp左右的片段，片段回收后連p-EASY-Tl載體，經測序分析，在已知序列的基礎上獲得483bp的5’端序列和218bp5’ UTR序列。根據已獲得序列3’末端300bp處設計引物ADCS 3’RACE，159bp處設計引物ADCS 3’RACEnest (引物序列見表2)。之后做巢式PCR，電泳檢測得到400bp左右的片段，片段回收后連p-EASY-Tl載體，經測序分析，獲得252bp大豆的3’UTR序列。將獲得的序列進行拼接，經分析最終得到完整的GmADCS基因序列，根據克隆得到的序列設計克隆GmADCS基因CDS全長的引物ADCSIOFLFI和ADCSIORI (弓丨物序列見表2)，PCR并對產物測序，得到⑶S序列2784bp。表2GmADCS基因克隆引物序列
"引物名稱序列5’-3’
ADCSMF GCATTTGTCTTCAGCTGTTG ADCSMR CTAAGC AAAATGCATCACAG ADCS5，RACE CCTCTGTGTCATTC AACC ACTGTG ADCS5，RACE nest GACGGTTCGATTTCACACCACACTC ADCS 3，RACE CCTGGTGGTTCAATGACAGGTGCAC ADCS 3 5RACE nest CAGTCATTGTACACGAGGGTGAAG ADCS IOFLFI ATGAATTCGTCTCTGCGTTTG ADCS10R1_CTAAGC AAAATGCATCACAGC_4、轉GmADCS基因擬南芥的獲得及其葉酸合成前體pABA含量的測定將GmADCS的⑶S序列構建到植物過表達載體pCAMBIA1302的酶切位點Nco I和Pml I之間，由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子驅動得到重組表達載體pCAMBIA1302-GmADCS。將上述重組載體電擊轉化農桿菌LBA4404，挑取酶切鑒定正確的克隆，利用農桿菌介導的花沾法侵染野生型擬南芥，收獲的種子記為Ttl代。Ttl代種子首先在1/2MS+潮霉素B (25mg/L)的抗性培養基上篩選，獲得13株陽性綠苗(記為T1代)，并移入溫室中培養20天，分別取葉片提取DNA，PCR鑒定轉基因植株，侵染的植株中1-4、6.、7、10-12為轉基因陽性植株(如圖10所示)。利用高效液相色譜法(HPLC)檢測轉基因陽性植株中的葉酸合成前體pABA含量，發現比野生型提高I. 2 2倍(如圖11)。實施例3、雙基因雜交植株的獲得及其葉酸含量的測定將大豆的GmGTPCHI和GmADCS的⑶S序列分別構建到植物過表達載體，均由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子驅動。其中，大豆GmGTPCHI的⑶S序列通過Gateway系統重組到PH2GW7，大豆葉酸合成關鍵酶基因GmADCS的⑶S序列構建到植物過表達載體PCAMBIA1302的酶切位點Nco I和Pml I之間，得到重組表達載體pCAMBIA1302_GmADCS。利用農桿菌介導的花沾法侵染野生型擬南芥。將獲得的轉入GmGTPCHI的Ttl代陽性擬南芥植株GI-G4做父本，將獲得的轉入GmADCS的TO代陽性擬南芥植株A1-5做母本，進行了如下的雜交組合Glx Al，GlxA2, G2xA3, G2xA4，G3xA2，G4xA5，雜交后的種莢分別單獨收獲(見表3)。種子在溫室中培養20天，分別取葉片提取DNA。設計GmGTPCHI和GmADCS基因特異引物(表4)，以DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系如下
IOxTaq buffer2ul
dNTPs (2.5mM each) 2ul 引物 Fw (IOuM)Iul
引物 Rv (IOuM)Iul
DNA 模板(10ng/ul) 2ul Taq 酶(5U/ul)0.2ul
ddH20補足至 20ulPCR反應條件94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，Taq酶72°C擴增30s，35個循環，PCR產物I %瓊脂糖電泳檢測，得到400bp左右的片段為目的條帶。圖I所示為PCR擴增的部分電泳圖，其中4、5、6、7、8、10、11為轉入GmGTPCHI基因的植株，1、2、4、
5、6、7、8、9、11、12為轉入GmADCS基因的植株，因此，4、5、6、7、8、11為同時轉入兩個目的基因的植株。進一步用RNA Trizol法提取了上述同時轉入兩個目的基因植株的總RNA，經DNase I處理后,取I μ g，根據反轉錄試劑盒(Fermentas)的方法獲得cDNA作模板,用表4中所示的基因特異引物進行PCR擴增，檢測GmGTPCHI和GmADCS的基因表達水平，發現野生型里均檢測不到兩個基因的表達，而轉基因植株中可檢測到基因的顯著表達，且不同株系間基因的表達存在差異，圖2為部分檢測的電泳圖。分別把641、642、643、644、645、6八6的后代中鑒定為雙基因轉入的植株取生長30天的葉片，提取葉酸，用高效液相色譜法分析葉酸的含量，結果發現與野生型相比，單獨轉入GmGTPCHI的葉酸含量提高了 I. 5倍，單獨轉入GmADCS的植株葉酸含量沒有變化，雜交植株葉酸含量比野生型提高了 2. 5 4. 5倍(圖3)。
表3進行雜交獲得的獨立轉基因株系。
權利要求
1.一種利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括將含有大豆GTPCHI和ADCS基因的過表達載體共同導入目的植物中、通過兩種基因的共表達提高植物的葉酸含量的步驟， 其中，所述GTPCHI基因的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述ADCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據權利要求I所述的利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，將大豆GTPCHI和ADCS基因共表達的方法如下 方法⑴分別構建大豆GTPCHI和ADCS基因的表達載體，然后導入目的植物中，共表達；或 方法(2)構建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯的共表達載體，然后導入目的植物中，共表達。
3.根據權利要求2所述的利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，對于方法(I)，將大豆GTPCHI和ADCS基因分別構建植物表達載體并分別轉染到不同植株中，選用大豆GTPCHI基因侵染的陽性轉基因植株做父本，選用大豆ADCS基因侵染的陽性轉基因植株做母本，將父本與母本進行雜交獲得雙基因雜交植物。
4.根據權利要求2所述的利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，對于方法(2)，將大豆GTPCHI和ADCS基因串聯在表達載體PCAMBIA1301載體上，將載體轉染到植株，將收獲的種子在抗性培養基上進行篩選，獲得轉基因植物。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域，具體地，涉及利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法。根據本發明的大豆葉酸合成關鍵酶GTPCHI基因序列如SEQ ID No.1所示，ADCS基因序列如SEQ ID No.2所示。轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用能夠明顯提高轉基因植株中葉酸的含量，因此，本發明可以作為一種生產高含量葉酸轉基因植物的方法，人類可通過飲食這類植物直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現象，并克服了長期服用葉酸片劑帶來的不良副作用。
文檔編號A01H5/00GK102899349SQ20111021651
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者張春義, 梁秋菊, 范云六 申請人:中國農業科學院生物技術研究所