專利名稱：一種保濕跳蟲培養基質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及跳蟲培養基質及其制備方法。
背景技術：
跳蟲為彈尾綱(Collembola)的俗稱，是土壤中最豐富的節肢動物之一，具有重要的生態功能。白符跳蟲(Folsomia Candida)為等節跳科(Isotomidae)，為跳蟲群落的優勢種群，廣泛分布于土壤和凋落物中，被國內外長期用作土壤生態風險評價的指示物種；因其易于培養和擴殖，生物學特征和生態學特性比較清楚，而廣泛用作環境污染模擬的毒理學模式生物。跳蟲的培養是其進行模擬試驗的基礎和必要條件。目前，普遍使用的跳蟲培養基質為一定比例的石膏、活性炭組成的基質。水分是跳蟲生存的限制因子，生存介質過干或環境濕度過低都會導致跳蟲死亡。 利用跳蟲作為模式生物進行室內模擬研究，要求具備水分恒定的培養基質；而毒性脅迫試驗，又要求具備無雜菌干擾可進行純性培養的培養基質。此外，毒理學模擬試驗要求可在模式生物的生存介質中均勻添加染毒物質。目前，普遍應用的石膏、活性炭培養基質培養跳蟲具有許多不足。首先，石膏、活性炭培養基質需要定時補水以保證跳蟲生存濕度，濕度不穩定會影響跳蟲的發育、繁殖與應激能力，向培養基質補充水分的過程會干擾跳蟲，甚至使跳蟲從培養基質中逃逸；其次，石膏、活性炭培養基質無法進行充分滅菌消毒，使得如白符跳蟲(Folsomia Candida)這類模式生物不能進行純性培養，無法保證毒理試驗的質量控制，也不能進行后繼的生化指標檢測；此外，使用普通培養皿配制的石膏、活性炭培養基質，跳蟲常常從培養皿內逃逸，在跳蟲培養管理或試驗控制方面帶來很多不便，而使用特殊培養器會增加實驗負擔，增高研究成本。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有跳蟲培養基質無法進行毒物添加實驗、純性培養以及跳蟲培養管理或試驗控制方面不能得到有效保證的問題，而提供一種保濕跳蟲培養基質及制備方法。一種保濕跳蟲培養基質由1 3g的瓊脂粉、2 3mL的磷酸鹽緩沖液和97 98mL 的蒸餾水組成；其中磷酸鹽緩沖液由2 20g的KH2PO4和1 3g的KOH加入蒸餾水定容至 IOOmL制成；其中磷酸鹽緩沖液pH = 6. 0。保濕跳蟲培養基質制備方法如下一、稱取2 20g的KH2PO4和1 3g的Κ0Η，加入蒸餾水，調節磷酸鹽緩沖液PH值至6. 0后，定容至IOOmL,配制成磷酸鹽緩沖液；二、稱取 1 3g瓊脂粉于燒杯中，加入2 3mL步驟一制備的磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至IOOmL ； 三、將燒杯用封口膜密封，放入高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌20min ；四、滅菌后降溫至50 60°C，在超凈工作臺中將步驟三制得的培養基質倒入培養皿，培養基質厚0. 4 0. 6cm ；五、 將步驟四的培養皿靜置于實驗臺上待培養基質冷卻凝固后，即得保濕跳蟲培養基質。
步驟一中用lmol/L鹽酸溶液調節磷酸鹽緩沖液的pH。本發明保濕跳蟲培養基質的瓊脂粉購買自上海根生生物科技有限公司。本發明的保濕跳蟲培養基質解決了傳統的跳蟲培養方法中濕度降低、加濕不均衡、加水干擾跳蟲、雜物和雜菌污染、跳蟲逃逸出培養皿、跳蟲在培養皿爬壁和爬蓋的問題。 本發明中的保濕跳蟲培養基質在跳蟲培養過程濕度穩定均衡，不需要補充水分，經過滅菌和超凈操作，保證跳蟲生存介質無雜物雜菌干擾，可對跳蟲進行純性培養，由于該培養基基底較軟且濕度適宜，跳蟲無逃逸和爬壁爬蓋現象。本發明保濕跳蟲培養基質中瓊脂粉比例恰當，合適的水分濕度和基底硬度與實際土壤相仿，適宜跳蟲生長和繁殖。無菌的純性培養，使得作為跳蟲食物的酵母無影響存活， 保證跳蟲的繼代培養并可進行生化指標的檢測。由于瓊脂粉的凝點和熔點差異很大，在配制培養基質溶液時可任意添加化學物質，使得利用培養基模擬土壤污染進行跳蟲毒理實驗成為可行。
圖1是石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C對跳蟲爬壁、爬蓋對照試驗結果；圖2是石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C的對跳蟲逃逸對照試驗結果；圖3是石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C的雜菌菌群數對照試驗結果；圖4是石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C的培養基
質濕度對照結果；其中fl，為石膏活性炭培養基質； ，為實驗組A f，為實驗組B _，為實
驗組C。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式一種保濕跳蟲培養基質由1 3g的瓊脂粉、2 3mL 的磷酸鹽緩沖液和97 98mL的蒸餾水組成；其中磷酸鹽緩沖液由2 20g的KH2PO4和1 3g的KOH加入蒸餾水定容至IOOmL制成；其中磷酸鹽緩沖液pH = 6. 0。本實施方式的保濕跳蟲培養基質在跳蟲培養過程濕度穩定均衡，不需要補充水分，經過滅菌和超凈操作，保證跳蟲生存介質無雜物、雜菌干擾，可對跳蟲進行純性培養，由于該培養基基底較軟且濕度適宜，跳蟲無逃逸和爬壁爬蓋現象。本實施方式的保濕跳蟲培養基質中瓊脂粉比例恰當，合適的水分濕度和基底硬度與實際土壤相仿，適宜跳蟲生長和繁殖。無菌的純性培養，使得作為跳蟲食物的酵母無影響存活，保證跳蟲的繼代培養并可進行生化指標的檢測。由于瓊脂粉的凝點和熔點差異很大， 在配制培養基質溶液時可任意添加化學物質，使得利用培養基質模擬土壤污染進行跳蟲毒理實驗成為可行。
具體實施方式
二 本實施方式的保濕跳蟲培養基質制備方法如下一、稱取2 20g的KH2POJP 1 3g的Κ0Η，加入蒸餾水，調節磷酸鹽緩沖液pH值至6. 0后，定容至IOOmL, 配制成磷酸鹽緩沖液；二、稱取1 3g瓊脂粉于燒杯中，加入2 3mL步驟一制備的磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至IOOmL ；三、將燒杯用封口膜密封，放入高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌20min ；四、滅菌后降溫至50 60°C，在超凈工作臺中將步驟三制得的培養基質倒入培養皿，培養基質厚0. 4 0. 6cm ；五、將步驟四的培養皿靜置于實驗臺上待培養基質冷卻凝固后，即得保濕跳蟲培養基質。步驟一所述的調節磷酸鹽緩沖液是用lmol/L鹽酸溶液進行調節。采用本實施方式制得的培養基質培養的白符跳蟲與石膏、活性炭培養基質培養的白符跳蟲在壽命、行為及繁殖率等方面沒有差異。而本實施方式制得的培養基質具有濕度適宜且保濕性好，不需外加水分；無雜菌生長，無雜物污染；未見跳蟲爬壁、爬蓋和爬出培養皿；可進行跳蟲的繼代和純性培養的優點。采用如下試驗驗證本發明的效果，于恒溫恒濕箱中，選擇個體年齡差異不超過3d 的跳蟲，在溫度為20°C，濕度為65%，12h光照/12h黑暗循環的方式下進行對比試驗。對照組稱取8g熟石膏、Ig活性炭和6mL蒸餾水混合后，倒于培養皿中，培養基質厚度為0. 5cm，每3d向培養基質內加入ImL蒸餾水保持培養基質濕潤。實驗組實驗組A —、配制磷酸鹽緩沖液稱取13. 6g KH2PO4U. 8g Κ0Η，加蒸餾水，調節pH 值為6. 0后，定容至IOOmL ；二、稱取Ig瓊脂粉于250mL燒杯中，加入2mL磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至IOOmL ；三、將燒杯封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌20min ；四、待溫度降至60°C，于超凈工作臺無菌環境下趁熱倒入培養皿，培養皿厚0. 5cm ；五、靜置于平坦實驗臺上待培養基質冷卻凝固，待用。實驗組B —、配制磷酸鹽緩沖液稱取13. 6g KH2PO4U. 8g Κ0Η，加蒸餾水，調節pH 值為6. 0后，定容至IOOmL ；二、稱取2. 5g瓊脂粉于250mL燒杯中，加入2. 8mL磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至IOOmL;三、將燒杯封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌20min ；四、 待溫度降至60°C，于超凈工作臺無菌環境下趁熱倒入培養皿，培養皿厚0. 5cm ；五、靜置于平坦實驗臺上待培養基質冷卻凝固，待用。實驗組C 一、配制磷酸鹽緩沖液稱取13. 6g KH2PO4U. 8g Κ0Η，加蒸餾水，調節pH 值為6. 0后，定容至IOOmL ；二、稱取3g瓊脂粉于250mL燒杯中，加入3mL磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至IOOmL ；三、將燒杯封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌20min ；四、待溫度降至60°C，于超凈工作臺無菌環境下趁熱倒入培養皿，培養皿厚0. 5cm ；五、靜置于平坦實驗臺上待培養基質冷卻凝固，待用。對比實驗結果如下石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C對跳蟲爬壁、爬蓋對照試驗結果如圖1所示，通過對照試驗，可知，在本發明制備的保濕跳蟲培養基質培養的跳蟲無爬壁現象，而傳統的石膏、活性炭培養基質有30%左右的爬壁現象，可見本發明制備的保濕跳蟲培養基質效果明顯好于傳統的石膏、活性炭培養基質，能夠很好的進行跳蟲培養管理或試驗控制。石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C的對跳蟲逃逸對照試驗結果如圖2所示，通過對照試驗，可知，在本發明制備的保濕跳蟲培養基質培養的跳蟲無逃逸現象，而傳統的石膏、活性炭培養基質有20%左右的爬壁現象，可見本發明制備的保濕跳蟲培養基質效果明顯好于傳統的石膏、活性炭培養基質，能夠很好的進行跳蟲培養管理或試驗控制。石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C的雜菌菌群數對照試驗結果如圖3所示，與傳統的石膏、活性炭培養基質存在7個雜菌菌群數相比較，本發明制備的保濕跳蟲培養基質無雜菌生長，無雜物污染。本發明制備的保濕跳蟲培養基質能夠進行純性培養，保證毒理試驗的質量，并能保證后繼的生化指標檢測。 石膏、活性炭培養基質與實驗組A、實驗組B和實驗組C的培養基質濕度對照結果如圖4所示，通過對比試驗可知，本發明制備的保濕跳蟲培養基質，在經過200天的驗證試驗后，培養基濕度仍然能夠達到65%左右，而傳統的石膏、活性炭培養基質在200天后培養基濕度幾乎為0。本發明制備的保濕跳蟲培養基質水分恒定，更適于跳蟲作行室內模擬研
5 ιο
權利要求
1.一種保濕跳蟲培養基質，其特征在于培養基質由1 3g的瓊脂粉、2 3mL的磷酸鹽緩沖液和97 98mL的蒸餾水組成；其中磷酸鹽緩沖液由2 20g的KH2PO4和1 3g的 KOH加入蒸餾水定容至IOOmL制成；其中磷酸鹽緩沖液pH = 6. 0。
2.根據權利要求1所述的一種保濕跳蟲培養基質，其特征在于培養基質由2.5g瓊脂粉、2. 5mL的緩沖液和97. 5mL的蒸餾水組成。
3.根據權利要求1所述的一種保濕跳蟲培養基質，其特征在于磷酸鹽緩沖液由12g的 KH2PO4和2g的KOH加入蒸餾水定容至IOOmL制成。
4.制備如權利要求1所述的一種保濕跳蟲培養基質，其特征在于保濕跳蟲培養基質制備方法如下一、稱取2 20g的KH2PO4和1 3g的Κ0Η，加入蒸餾水，調節磷酸鹽緩沖液 PH值至6. 0后，定容至IOOmL,配制成磷酸鹽緩沖液；二、稱取1 3g瓊脂粉于燒杯中，加入 2 3mL步驟一制備的磷酸鹽緩沖液，用蒸餾水定容至IOOmL ；三、將燒杯用封口膜密封，放入高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌20min;四、滅菌后降溫至50 60°C，在超凈工作臺中將步驟三制得的培養基質倒入培養皿，培養基質厚0. 4 0. 6cm ；五、將步驟四的培養皿靜置于實驗臺上待培養基質冷卻凝固后，即得保濕跳蟲培養基質。
5.根據權利要求4所述的保濕跳蟲培養基質的制備方法，其特征在于步驟一中用 lmol/L鹽酸溶液調節磷酸鹽緩沖液pH值。
全文摘要
一種保濕跳蟲培養基質及其制備方法，它涉及跳蟲培養基質及其制備方法。它要解決現有跳蟲培養基質無法進行毒物添加實驗、純性培養以及跳蟲培養管理或試驗控制方面不能得到有效保證的問題。保濕跳蟲培養基質由瓊脂粉、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水組成。配制方法一、配制磷酸鹽緩沖液；二、將瓊脂粉和磷酸鹽緩沖液混合；三、高溫、高壓滅菌；四、在無菌環境下倒入培養皿；五、靜置待培養基質冷卻凝固。本發明的培養基質，保濕效果顯著，高溫滅菌保證無雜物和雜菌干擾，跳蟲無逃逸出培養皿和爬壁現象，可保證跳蟲的繼代培養和毒理試驗的進行。本發明可進行生化指標的檢測，并可利用此培養基質模擬土壤污染進行跳蟲毒理實驗。
文檔編號A01K67/033GK102415358SQ201110271750
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者劉晶, 吳東輝, 常亮, 王云彪, 閆修民 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所