本發明屬于植物細胞培養基技術領域，具體涉及一種用于培養巖黃連細胞的培養基及其制備方法。
背景技術：
巖黃連，為紫堇科紫堇屬多年生草本植物，是一種名貴的中藥材，有近似黃連的功效，且生長于巖縫中或巖石旁，故得此名。巖黃連味苦性寒，具有清熱解毒、抗炎利濕、止痛止血的功效，是民間作為治療乙肝的特效藥。巖黃連中的活性成分為巖黃連總堿，主要包括脫氫卡維、小聚堿、卡維丁等多種生物堿成分，其中脫氫卡維丁含量最高，為主要活性成分。
中國專利申請CN1422948A公開了一種植物細胞培養基及使用培養基培養植物細胞的方法，該培養基應用水培技術，含有1.0mM-6.0mM鈣鹽，1.0nM-6.0mM硝酸鹽和1.0ng-5.0ng/L磷酸鹽；優選的鈣鹽為CaCl2·2H2O，硝酸鹽為NaNO3，磷酸鹽為Ca3(P04)2。中國專利申請CN103548695A公開了一種巖黃連的組織培養快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)取巖黃連側芽作為外植體進行消毒；(2)將消毒后的外植體置于MS基本培養基中誘導得到叢生芽；(3)將所述叢生芽置于MS壯苗培養基中進行壯苗培養得到健壯植株；(4)將所述健壯植株置于MS生根培養基中培養得到完整的帶根苗；(5)取完整的帶根苗進行煉苗后移植于沙土壤生長一個半月，再移栽至大田。
巖黃連主要分布于貴州，云南，四川等省，在廣西多見于桂西及桂西北等地，以東蘭，巴馬，都安，靖西，德保較多。巖黃連對環境條件要求十分苛刻，野生狀態下只生長在石灰巖地區陰濕的巖洞口，氣溫在15-25℃之間，局限于石灰巖山區，屬石山特有種，產量極低，列入中國南部瀕危植物名錄。由于生長環境條件惡劣，其自然繁殖率很低，種群發展困難，資源蘊藏量十分有限。因此，研制出一種用于培養巖黃連細胞的培養基迫在眉睫。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種用于培養巖黃連細胞的培養基及其制備方法。本發明提供的用于培養巖黃連細胞的培養基，能提供細胞生長增殖所需的充足營養與良好環境，成分明確且價格較低，繁殖率高，可明顯縮短巖黃連的生長繁殖周期。
本發明的技術方案是：
一種用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇20-40mg/L，谷胱甘肽15-25μg/L，6-芐基腺嘌呤10-13mg/L，硝酸鈉1.5-2.5mM，活性炭0.05-0.15g/L，綠原酸28-36μg/L，尿嘧啶2-5mg/L，氯化鈣2-3mg/L，L-谷氨酰胺0.02-0.08mg/L，甘油酸12-20mg/L和果糖10-18g/L。
一種用于培養巖黃連細胞的培養基，優選的方案是，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-芐基腺嘌呤12mg/L，硝酸鈉2.2mM，活性炭0.09g/L，綠原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化鈣2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
優選地，所述基礎培養基為MS培養基或White培養基。
另外，本發明還提供了所述用于培養巖黃連細胞的培養基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎培養基中加入肌醇、硝酸鈉、尿嘧啶、氯化鈣和果糖，攪拌18-25分鐘，加入谷胱甘肽、6-芐基腺嘌呤、活性炭、綠原酸和L-谷氨酰胺，繼續攪拌15-23分鐘，加入甘油酸，攪拌12分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至5.2-5.5，滅菌溫度為118℃，滅菌時間為18-25分鐘，即得。
優選地，所述步驟S1攪拌23分鐘。
優選地，所述步驟S1繼續攪拌17分鐘。
優選地，所述步驟S2調節步驟S1所得混合物的pH至5.3。
優選地，所述步驟S2滅菌時間為23分鐘。
本發明所用主要原料的作用：
肌醇：肌醇是一種水溶性維生素；維生素B族中的一種，肌醇和膽堿一樣是親脂肪性的維生素，分子式(CHOH)6。又稱為環己六醇，白色晶體粉末(無結晶水)，風化性結晶(含二分子結晶水)。有9種立體異構體，其中有醫用價值的內消旋體，可促進細胞新陳代謝、助長發育、增進食欲，可由玉米浸泡液中提取。主要用于治療肝硬變、肝炎、脂肪肝、血中膽固醇過高等癥。肌醇廣泛分布在動物和植物體內，是動物、微生物的生長因子。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命體內的作用機理和四大生理功能：1、清除人體細胞內的自由基，是細胞內最主要的抗氧化劑。2、與人體內的有毒物質結合并排出體外，是人體內重要的解毒劑。3、激活和保護免疫細胞，增強人體免疫功能，是重要的免疫增強劑。4、影響皮膚細胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮膚色斑的產生。
6-芐基腺嘌呤：CAS號：1214-39-7，分子式：C12H11N5，分子量：225.25。6-芐基腺嘌呤，中文別名為2-芐氨基嘌呤，N-芐基腺苷，丙烯酸正丁酯，白色或類白色晶體，難溶于水，微溶于乙醇，在酸、堿中穩定，屬廣譜性植物生長調節劑，可促進植物細胞生長，抑制植物葉綠素的降解，提高氨基酸的含量，延緩葉片衰老等。
活性炭：活性炭可以降低組織培養物的有害代謝物濃度，對細胞生長有利。活性炭為木炭粉碎經加工形成的粉末結構，它結構疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培養物分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糖醛及激素等。
綠原酸：CAS號：327-97-9，分子式：C16H18O9，分子量：354.31。綠原酸具有廣泛的生物活性，現代科學對綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、醫藥和日用化工等多個領域。綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經系統等作用。
尿嘧啶：CAS號：66-22-8，分子式：C4H4N2O2，分子量：112.09。白色或淺黃色針狀結晶。尿嘧啶是RNA特有的堿基，相當于DNA中的胸腺嘧啶(T)，是組成RNA四種構成的堿基之一。
L-谷氨酰胺：白色結晶或晶性粉末，能溶于水，不溶于甲醇、乙醇、醚、苯、丙酮、氯仿和乙醇乙酯，無臭，稍有甜味。在中性溶液中不穩定，在醇、堿或熱水中易分解成谷氨醇或丙酯化為吡咯羧醇，無臭，有微甜味。分子式：C5H10N2O3，分子量：146.15。L-谷氨酰胺是蛋白質合成中的編碼氨基酸，哺乳動物非必需氨基酸，在體內可以由葡萄糖轉變而來。
本發明提供的用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，添加的添加劑包括肌醇、谷胱甘肽、6-芐基腺嘌呤和綠原酸等。在本發明的各種培養基的成分中，基礎培養基能夠提供巖黃連的生存和最低的生理活動。在本發明培養基中使用的肌醇，能夠提供巖黃連細胞所需營養素，促進巖黃連細胞的發育。在本發明培養基中使用的谷胱甘肽，能夠誘導細胞的增殖，避免過氧化物對巖黃連細胞的損害。在本發明培養基中使用的6-芐基腺嘌呤，可促進巖黃連細胞生長，提高氨基酸的含量，延緩葉片衰老。在本發明培養基中使用的活性炭，能夠吸附巖黃連生長中代謝的有毒物質，但是，活性炭在吸附培養基中的有害物質的同時，也能吸附生長調節物質和其它培養基中的成分，發明人在使用活性炭時，考慮到活性炭的兩面性，經大量實驗，得到合適的活性炭與培養基中生長調節物質的配比，使其都能更好的發揮作用。在本發明培養基中使用的尿嘧啶，對巖黃連細胞的分裂起促進作用。在本發明培養基中使用的L-谷氨酰胺，作為巖黃連細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。發明人意外發現，在本發明培養基中使用綠原酸，能夠與其它成分協同作用，促進巖黃連細胞生長增殖。在本發明培養基中使用的甘油酸和果糖，起到提供碳源的作用。本發明用于培養巖黃連細胞的培養基搭配合理，各成分間協同作用，能提供巖黃連細胞生長增殖所需的充足營養與良好環境，促進巖黃連細胞的增殖。
與現有技術相比，本發明提供的用于培養巖黃連細胞的培養基具有以下優勢：
(1)本發明提供的用于培養巖黃連細胞的培養基，能提供巖黃連細胞生長增殖所需的充足營養與良好環境。
(2)本發明提供的用于培養巖黃連細胞的培養基，成分明確且價格較低。
(3)本發明提供的用于培養巖黃連細胞的培養基，繁殖率高，可明顯縮短巖黃連的生長繁殖周期。
具體實施方式
以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
本發明MS培養基可購自上海研生生化試劑有限公司；White培養基可購自青島海博生物技術有限公司。
實施例1、一種用于培養巖黃連細胞的培養基
所述用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇20mg/L，谷胱甘肽15μg/L，6-芐基腺嘌呤10mg/L，硝酸鈉1.5mM，活性炭0.05g/L，綠原酸28μg/L，尿嘧啶2mg/L，氯化鈣2mg/L，L-谷氨酰胺0.02mg/L，甘油酸12mg/L和果糖10g/L。
所述基礎培養基為MS培養基。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入肌醇、硝酸鈉、尿嘧啶、氯化鈣和果糖，攪拌18分鐘，加入谷胱甘肽、6-芐基腺嘌呤、活性炭、綠原酸和L-谷氨酰胺，繼續攪拌15分鐘，加入甘油酸，攪拌12分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至5.7，滅菌溫度為118℃，滅菌時間為18分鐘，即得。
實施例2、一種用于培養巖黃連細胞的培養基
所述用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇40mg/L，谷胱甘肽25μg/L，6-芐基腺嘌呤13mg/L，硝酸鈉2.5mM，活性炭0.15g/L，綠原酸36μg/L，尿嘧啶5mg/L，氯化鈣3mg/L，L-谷氨酰胺0.08mg/L，甘油酸20mg/L和果糖18g/L。
所述基礎培養基為White培養基。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入肌醇、硝酸鈉、尿嘧啶、氯化鈣和果糖，攪拌25分鐘，加入谷胱甘肽、6-芐基腺嘌呤、活性炭、綠原酸和L-谷氨酰胺，繼續攪拌23分鐘，加入甘油酸，攪拌12分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至5.9，滅菌溫度為118℃，滅菌時間為25分鐘，即得。
實施例3、一種用于培養巖黃連細胞的培養基
所述用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-芐基腺嘌呤12mg/L，硝酸鈉2.2mM，活性炭0.09g/L，綠原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化鈣2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
所述基礎培養基為White培養基。
制備方法：
S1向基礎培養基中加入肌醇、硝酸鈉、尿嘧啶、氯化鈣和果糖，攪拌23分鐘，加入谷胱甘肽、6-芐基腺嘌呤、活性炭、綠原酸和L-谷氨酰胺，繼續攪拌17分鐘，加入甘油酸，攪拌12分鐘，得混合物；
S2調節步驟S1所得混合物的pH至5.8，滅菌溫度為118℃，滅菌時間為23分鐘，即得。
對比例1、一種用于培養巖黃連細胞的培養基
所述用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-芐基腺嘌呤12mg/L，硝酸鈉2.2mM，活性炭0.09g/L，綠原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化鈣2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L和果糖15.017g/L。
所述基礎培養基為White培養基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在于，沒有添加甘油酸，增加果糖的濃度。
對比例2、一種用于培養巖黃連細胞的培養基
所述用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-芐基腺嘌呤12mg/L，硝酸鈉2.2mM，活性炭0.09g/L，異綠原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化鈣2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
所述基礎培養基為White培養基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在于，將綠原酸替換為異綠原酸。
對比例3、一種用于培養巖黃連細胞的培養基
所述用于培養巖黃連細胞的培養基，包括基礎培養基和添加在所述基礎培養基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：肌醇32mg/L，谷胱甘肽18μg/L，6-芐基腺嘌呤0.051g/L，硝酸鈉2.2mM，活性炭0.051g/L，異綠原酸30μg/L，尿嘧啶4mg/L，氯化鈣2.6mg/L，L-谷氨酰胺0.06mg/L，甘油酸17mg/L和果糖15g/L。
所述基礎培養基為White培養基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區別在于，將6-芐基腺嘌呤和活性炭的終濃度均調整為0.051g/L。
試驗例一、本發明用于培養巖黃連細胞的培養基對巖黃連細胞的培養效果
1、試驗對象：本發明實施例1-3所得用于培養巖黃連細胞的培養基，以及對比例1-3所得用于培養巖黃連細胞的培養基。
2、試驗方法：
將經愈傷組織誘導得到的穩定快速生長的巖黃連細胞系進行繼代培養，接種8g鮮重細胞到250mL三角瓶中，分別以本發明實施例1-3所得用于培養巖黃連細胞的培養基，以及對比例1-3所得用于培養巖黃連細胞的培養基為繼代培養基，進行培養，每瓶盛100mL培養基。置于搖床中進行懸浮培養，搖床轉速120r/min，培養溫度25℃，每天連續光照16h，光照強度為2000Lx。培養兩周后，進行生物量測定。
測定生物量方法：培養物經布式漏斗抽濾，得到細胞鮮重，然后將所得細胞置50℃烘箱干燥至恒重，稱重得到細胞干重。結果如表1所示。
表1：不同培養基所得細胞鮮重和干重比較
由表1可以看出，在相同的培養時間內，生長在本發明實施例1-3制備的培養基中所得細胞的鮮重和干重，明顯高于生長在對比例1-3制備的培養基中所得細胞鮮重和干重。這說明，本發明實施例1-3制備的用于培養巖黃連細胞的培養基，更有利于巖黃連細胞的生長增殖。