專利名稱：一種甜葉菊多倍體離體誘導技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種甜葉菊染色體加倍的技術，屬于農業生物技術領域或植物細胞工程領域。
背景技術：
甜葉菊(stevia rebaudiana bertoni)是菊科多年生草本植物,原產南美巴拉圭，現世界各地引種栽培均獲得成功。甜葉菊葉片中含有的甜菊糖甙甜度是蔗糖的25(Γ300倍，但所含熱量僅是蔗糖的1/300，是目前已知最甜的天然甜味劑，已經替代糖精在食品、醫藥等工業中得到廣泛應用，并對肥胖癥、低血糖、糖尿病、小兒齲齒、高血壓、心臟病等具有·一定的防治效果和輔助治療作用，是繼甘蔗糖、甜菜糖之外有開發價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三健康糖源”。多倍體育種是對植物進行高產優質種質改造的重要手段，植物染色體數目加倍后，往往表現出植物器官的巨大性，適應性、抗逆性增強，營養生長階段延長，開花期推遲，次生代謝產物增加等特點。這些對于以葉片為收獲物并用以提取甜菊糖的甜葉菊來說，更是意義重大。利用秋水仙素進行化學誘變獲得多倍體是園藝植株育種中的重要方法之一，將化學誘變技術與組織培養技術結合進行誘變育種具有其獨特優勢。國內外有關甜葉菊組培快繁已經有較多的研究和應用，但有關利用秋水仙素進行甜葉菊多倍體離體誘變研究未見報道。本發明的目的是通過將兩項科技手段結合應用于甜葉菊，建立起一種高效的甜葉菊多倍體誘導技術體系。
發明內容
I.在超凈工作臺上將甜葉菊試管苗去頂除葉，將切下的莖段接種于再生苗培養基上。培養基為 MS+BA1.0 mg/L+NAAO. 2 mg/L。2.向莖段滴加濃度為O. 1% -O. 4%秋水仙素溶液，確保秋水仙素溶液浸潤每個莖段。3.在組培室內培養1-3天后，用無菌水漂洗3次。4.將莖段轉移至新的再生培養基上繼續培養30天，長成芽苗。5.將芽苗接種于生根培養基中生根培養20天。培養基為1/2MS +ΙΒΑ0. 5 mg/L。6.試管苗根長至1-2 cm時，取根用常規細胞壓片技術進行染色體檢測；撕取突變苗及對照苗葉片下表皮觀察組織細胞及氣孔結構特征。7.染色體檢測的染色方法為0.002 mol/L 8_羥基喹啉預處理2 h、卡諾氏固定液固定24 h、l mol/L鹽酸及無水乙醇I : I解離液解離30 min、改良苯酚品紅染液染色10min。8.整個組織培養期間培養室溫度為25± 1°C，光照強度約30 μ mo I · m_2 · s—1 (光源為40 W日光燈)，光照時間12 h/d。本發明所述的甜葉菊多倍體誘導方法，與傳統秋水仙素處理莖尖生長點不同，傳統方法是用秋水仙素點滴涂抹莖尖生長點，但由于甜葉菊的頂端新葉叢生，誘變劑難以完全浸潤到生長點，影響誘變的效果。本發明采用試管苗莖段側芽作為外植體且在其再生植株過程中進行誘導處理，由于試管苗側芽體較小，有利于秋水仙素的有效滲入側芽所有細胞產生誘變效應，因而可能是獲得較高比例的多倍體植株的原因之一，也使得嵌合體很少。本發明的將二倍體甜葉菊轉變為四倍體后，染色體數目由2n=2x=22轉變為2n=4x=44 (圖1)，多倍體甜葉菊的誘導率(誘導率=多倍體植株數/處理的甜葉菊株數X 100)最高達到43. 6%。四倍體甜葉菊的外形也發生了明顯的改變，表現在，氣孔增大(圖2)，葉片明顯變大，葉片變寬，葉形由長披針形變成橢圓形(圖3)。
參見附圖
圖I為甜葉菊染色體加倍前(A)后(B)染色體數目的變化。圖2為甜葉菊染色體加倍前(A)后(B)葉片氣孔大小的變化。
圖3為甜葉菊染色體加倍前(A)后(B)葉片形態及大小的變化。
具體實施例方式實施例I :
I.在超凈工作臺上將甜葉菊試管苗去除葉片，切成帶一側芽，長約I. O cm的莖段。將切下的莖段接種于再生苗培養基上。培養基為MS+BA1.0 mg/L+NAAO. 2 mg/L。每瓶接種4個莖段，每處理接種10瓶，置于培養室培養。2.向莖段滴加濃度為O. 1%秋水仙素溶液，確保秋水仙素溶液浸潤每個莖段。3.在組培室內培養3天后，用無菌水漂洗3次。將莖段轉移至新的再生培養基上繼續培養30天，長成芽苗。將芽苗接種于生根培養基中生根培養20天，培養基為MS +ΝΑΑ0. 5mg/L ο5.試管苗根長至1-2 cm時，取根用常規細胞壓片技術進行染色體檢測，撕取突變苗及對照苗葉片下表皮觀察組織細胞及氣孔結構特征。6.上述染色體檢測的染色方法為0.002 mol/L 8_羥基喹啉預處理2 h、卡諾氏固定液固定24 h、l mol/L鹽酸及無水乙醇I : I解離液解離30 min、改良苯酚品紅染液染色10 min。7.在個過程中的組培室的培養條件為溫度25± I °C，光照強度約30μ mo I · m_2 · s—1 (光源為40 W日光燈),光照時間12 h/d。效果經檢測染色體加倍的甜葉菊植株，葉片變圓，變大，變厚，氣孔增大，染色體數目由2n=2x=22轉變為2n=4x=44，多倍體甜葉菊誘導率達到42. 3%。實施例2
具體方法如實施例1，其中滴加O. 4%秋水仙素濃度后培養3天，多倍體甜葉菊誘導率達到 43. 6%ο實施例3
具體方法如實施例1，其中滴加O. 2%秋水仙素濃度后培養3天，多倍體甜葉菊誘導率達到 41. 1%。
權利要求
1.在超凈工作臺上將甜葉菊試管苗去除葉片，切成帶一側芽，長約l.oCm的莖段。
2.將切下的莖段接種于再生苗培養基上。
3.向莖段滴加濃度為O.1%-0. 4%秋水仙素溶液,確保秋水仙素溶液浸潤每個莖段。
4.在組培室內培養1-3天后，用無菌水漂洗3次。
5.將莖段轉移至新的再生培養基上繼續培養30天，長成芽苗。
6.將芽苗接種于生根培養基中生根培養20天。
7.試管苗根長至1-2cm時，取根用常規細胞壓片技術進行染色體檢測，并撕取突變苗葉片下表皮觀察組織細胞及氣孔結構特征。
8.根據權利要求2和權利要求5所述的再生苗培養基，其特征在于，培養基為MS+BA1.Omg/L+NAAO. 2 mg/L。
9.根據權利要求6所述的生根培養基，其特征在于，培養基為1/2MS+ΙΒΑ0. 5 mg/L。
10.根據權利要求7所述的染色體檢測方法，其特征在于，染色方法為0.002mo I/L8-羥基喹啉預處理2 h、卡諾氏固定液固定24 h、l mol/L鹽酸及無水乙醇I : I解離液解離30 min、改良苯酚品紅染液染色10 min。
11.根據權利要求4、權利要求5和權利要求6所述的培養條件，其特征在于，培養室溫度25±1°C，光照強度約30 μ mo I · m_2 · s—1 (光源為40 W日光燈)，光照時間12 h/d。
全文摘要
采用離體培養與化學誘變技術相結合誘導甜葉菊多倍體。將甜葉菊試管苗切頂除葉，切成帶一側芽的莖段，插于再生苗培養基上，用秋水仙堿滴加浸潤莖段。培養1-3天后清洗，再培養30天長成芽苗，轉接于生根培養基上生根。經細胞組織學鑒定，多倍體誘導成功，多倍體比率可達43.6%。
文檔編號A01H4/00GK102893860SQ201110317740
公開日2013年1月30日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者崔廣榮, 何克勤, 胡能兵, 張子學, 林平, 王波 申請人:崔廣榮