專利名稱：一種快速誘導棗同質多倍體的方法
技術領域：
本發明涉及一種組培條件下快速獲得棗同質多倍體的方法。
背景技術：
人工創造多倍體為育種工作開辟了新的途徑。果樹多倍體一般具有生長健壯、枝 粗、葉厚、果大、少籽或無籽、產量高、適應性和抗逆性強等優點，且這些優點可通過無性繁 殖得到保持。因此，具有周期短、見效快、省工省力等突出優點的多倍體育種成為許多育種 學家的首選。近年來，利用秋水仙素誘導多倍體發展迅速，但由于多采用莖尖等為誘變材 料，獲得的多倍體大多為嵌合體，容易發生回復突變，在繁殖過程中必須不斷的鑒定、選擇、 純化，使多倍體細胞比例加大以達到純化的目的，這一過程耗時費力，嚴重制約著多倍體的 育種進程。因此，如能簡化甚至省去嵌合體分離純化步驟，將會大大加快多倍體育種速度。隨著植物組織培養技術日趨成熟，將組織培養與誘變技術有機的結合起來進行離 體誘導多倍體，顯著提高了誘變效率，成為多倍體育種的發展方向。我國科學工作者已利用 此方法獲得了蘋果、獼猴桃、草莓、棗等多種果樹的多倍體材料，但也多為器官發生途徑獲 得多倍體，同樣存在嵌合體問題。而體細胞胚胎(胚狀體)發生相對于器官發生來說，具有 結構完整、數量多、成苗速度快等特點，特別是體細胞胚胎具有單細胞起源的特點。通過體 細胞胚胎途徑進行秋水仙素誘導，可一步獲得同質多倍體，而不需要繁復的純化過程，大幅 度提高多倍體育種進程，應用前景十分廣闊。棗是原產我國的特色優勢果樹，近年來發展很快，生產上對新品種需求很大。但由 于花小、去雄授粉困難和胚敗育嚴重等問題，棗樹雜交育種困難很大，使得多倍體育種在棗 樹上更加重要。利用幼嫩莖尖通過器官發生途徑進行棗的秋水仙素誘導已取得成功，而通 過體細胞胚胎途徑進行棗的秋水仙素誘導尚未見報道。本發明專利是利用棗體細胞胚胎單 細胞起源的特點進行多倍體誘導，即在體細胞胚胎單細胞階段誘發其發生變異，由該變異 單細胞發育而成的體細胞胚苗即為同質多倍體，該途徑避免了嵌合體的出現，可省去嵌合 體多次分離步驟，達到快速獲得同質多倍體的目的，對棗的多倍體育種和種質創新重大意 義。
發明內容
本發明利用棗離體葉片體細胞胚胎發生體系進行多倍體誘導，能夠省去嵌合體分 離步驟，一步獲得同質多倍體。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是首先采用合適的離體葉片剪切方 法，再對葉片進行體細胞胚胎的誘導同時進行倍性誘導，再生胚狀體發育成熟后，經檢測鑒 定出同質多倍體。本發明的具體內容，即快速獲得棗同質多倍體的方法如下外植體剪切選取苗齡為20 30d的棗組培苗葉片，在超靜工作臺上用已滅菌過的 剪刀垂直葉脈剪切5 8刀，然后正面向上接種于誘導培養基上。
誘導培養將剪切好的葉片接種到MS+麥芽糖15 25g/L+瓊脂3. 0 5. Og/ L+TDZ5. 0 10. 0mg/L+AgN03l. 0 2. Omg/L的固體培養基上，培養基中同時附加秋水仙素 15 20mg/L，暗培養40 50天。離體葉片上陸續誘導出愈傷組織，隨后愈傷組織分化出 胚狀體。成熟培養將由棗葉片愈傷組織分化出的胚狀體轉接到MS+蔗糖40g/L+水解酪蛋 白500mg/L的無激素培養基上，光照培養，使其發育成體胚苗。染色體倍性檢測將再生的體細胞胚苗經過染色體或流式細胞儀檢測即可篩選出 同質四倍體。培養條件培養基pH值5. O 6. 0，培養溫度25 30°C。本發明專利的有益效果是，利用棗體細胞胚胎的單細胞起源特點進行多倍體誘 導，即在葉片體細胞胚胎發生過程中同時進行秋水仙素誘變，目的是在單細胞體細胞胚胎 階段使其加倍，則由該變異單細胞發育而來的植株即為同質多倍體。該多倍體誘變途徑避 免了嵌合體的出現，省去了嵌合體多次純化步驟，縮短了誘變時間，大大節省了人力物力， 為多倍體誘導提供了新思路。因此，該方法在棗的多倍體育種和種質創新中具有重要應用 價值。
圖1 棗離體葉片胚狀體發生圖2 棗離體葉片胚狀體發生圖3:二倍體體胚苗圖4:四倍體體胚苗
具體實施例方式選取苗齡20天的棗組培苗葉片，在無菌操作臺上用已滅菌過的剪刀垂直葉脈剪 切5 8刀，然后正面向上接種于胚狀體誘導培養基(MS+麥芽糖15 25g/L+瓊脂3. O 5. 0g/L+TDZ5. O 10. 0mg/L+AgN03l. O 2. Omg/L)上，培養基中同時附加秋水仙素15 20mg/L，暗培養40 50天，從棗葉片愈傷組織上分化出胚狀體；將分化出的胚狀體轉接到 MS+蔗糖40g/L+水解酪蛋白500mg/L的無激素培養基上，光照培養，胚狀體發育成體胚苗； 體胚苗經染色體倍數檢測，篩選出同質四倍體。培養基的pH值5. O 6. 0，培養溫度25 30°C。
權利要求
一種快速誘導棗同質多倍體的方法，其特征是在棗離體葉片體細胞胚胎發生過程中進行秋水仙素誘變，體細胞胚再生后直接獲得同質四倍體。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征包括以下培養步驟(1)選取生長健壯的棗組培苗葉片，用滅菌過的剪刀垂直葉脈剪切5-8刀，將其正面 向上接種于胚狀體誘導培養基MS+麥芽糖15 25g/L+瓊脂3. 0 5. Og/L+TDZ 5. 0 10. 0mg/L+AgN03l. 0 2. Omg/L上，培養基中附加秋水仙素15 20mg/L,暗培養40 50 天，分化出胚狀體。(2)經步驟(1)獲得的胚狀體，轉接到MS+蔗糖40g/L+水解酪蛋白500mg/L的無激素 培養基上，光照培養，使其發育成體細胞胚苗。(3)經步驟(2)獲得的體細胞胚苗，經顯微鏡或流式細胞儀檢測，篩選出同質四倍體。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于培養基pH為5.0 6. 0，溫度控制在 25 士 5°C。
全文摘要
一種快速誘導棗同質多倍體的方法，即在棗離體葉片體細胞胚胎發生過程中同時進行秋水仙素誘變，使單細胞胚胎染色體得到加倍而發育成同質四倍體。該方法包括體細胞胚胎誘導和染色體加倍、胚狀體發育成熟及同質四倍體的檢測篩選。選取生長健壯、苗齡20～30d的棗組培苗葉片，用滅菌過的剪刀垂直葉脈剪切5～8刀。然后正面向上接種于誘導培養基MS+麥芽糖15～25g/L+瓊脂3.0～5.0g/L+TDZ5.0～10.0mg/L+AgNO31.0～2.0mg/L上，培養基中同時附加秋水仙素15～20mg/L，暗培養40～50天。將棗葉片愈傷組織分化出的胚狀體轉接到MS+蔗糖40g/L+水解酪蛋白500mg/L的無激素培養基上光照培養，使其發育成體細胞胚苗。體細胞胚苗經過染色體或流式細胞儀檢測即可篩選出同質四倍體。以上培養基的pH為5.0～6.0，培養溫度25～30℃。該方法避免了嵌合體的出現，省略了分離純化步驟，可快速獲得同質多倍體，對加快棗的多倍體育種進程有重要應用價值。
文檔編號A01H4/00GK101926283SQ20091022792
公開日2010年12月29日 申請日期2009年12月3日 優先權日2009年12月3日
發明者劉孟軍, 王娜 申請人:河北農業大學