專利名稱：超旱生植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子EsDREB及編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種超旱生植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子EsDREB及編碼基因，利用該基因在提高酵母抗旱、耐低溫及高溫脅迫等抗逆性方面的應用，屬于植物基因工程技術領域。
背景技術：
干旱是限制植物生長發育和作物產量的主要因素，每年導致作物減產達50%以上。植物耐旱性大多屬于多基因控制的數量性狀，利用常規育種方法改良作物的抗旱性受到周期長、優異種質資源缺乏的限制。近年來的轉錄組學、蛋白組學和基因表達調控的研究初步揭示了植物干旱脅迫的作用分子機理。目前，利用干旱脅迫相關基因提高植物的抗旱能力，已經成為植物抗逆分子生物學的研究熱點和植物抗逆基因工程重要的研究方向。DREB 轉錄因子(Dehydration Responsive Element Binding protein)，艮口干旱應答元件結合蛋白，屬于AP2/EREBP類基因家族，特異存在于植物中。DREB與抗逆基因啟動子區域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)順式作用元件結合，其核心序 TACCGACAT，啟動下游一系列的有DRE順式作用元件的抗逆基因的表達，廣泛參與干旱、高鹽，熱等脅迫應答反應，從而能從整體上提高植物的抗逆性。自1994年Yamaguchi-Siinozaki從擬南芥中首次檢測到DRE作用的蛋白因子并命名為DREBl到1997年Mockinger等首次從擬南芥cDNA文庫中克隆到AtCBFl以來， DREB/CBF轉錄因子基因的克隆一直是植物分子生物學的熱點。目前已從擬南芥、水稻、玉米、小麥、黑麥、大豆、西紅菜，棉花，蘆薈等幾十種植物中分離并鑒定出調控干早、高鹽及低溫耐性的DREB基因，并利用這些基因得到了抗逆性增強的擬南芥、煙草、油菜、西紅柿、小麥等轉基因植株。但目前關于DREB的研究主要集中于草本植物領域，對于木本植物研究較少。由于木本植物生命周期長，并且其抵御外界不良環境侵害的因素會多于草本植物，注定其分子機制更為復雜。對木本植物DREB的研究主要以楊樹為主，包括:Wang等Q008)從河北楊中分離出2個CBF，其功能待進一步研究；Chen等Q009)利用35S啟動子驅動的胡楊PeDREB2基因轉入煙草內，發現轉基因株的抗寒性明顯增加；陳金煥等Q010)從胡楊中分離出2個編碼DREB2類蛋白基因，酵母單雜交試驗證明這兩個基因具有轉錄活性；^lou 和Li (2010)利用RT-PCR手段克隆得到1個毛白楊CBF基因，研究證明該基因在植物適應寒冷和干旱的過程中可能有著重要作用。另外，有關DREB/CBF類抗逆境轉錄因子DREB的功能及轉錄調控的研究大部分來自模式植物擬南芥及經濟作物水稻，小麥等，而對自然界天然存在的抗逆能力極強的植物資源卻嘗試較少，近幾年來，一些學者開始在一些天然的抗逆植物資源中挖掘基因資源， 并取得了一些綜合抗逆能力很強的DREB類轉錄因子，如鹽生植物二色補血草(Qiaoying Ban，2011)，海篷子(Kapil Gupta，2010)，荒漠旱生植物資源如檸條錦雞兒(Xuemin Wang， 2010)及苔蘚類植物小立碗蘚(Ning Liu，2007)，其中從二色補血草中克隆的LbDREB基因除了常見的抗鹽等抗性外，還表現出了很強的抗重金屬能力。綜上，植物中還存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其從極端抗旱的超旱生木本資源植物中克隆DREB基因并進行抗逆育種尚鮮見報道。而從本土抗逆植物資源中克隆抗逆相關基因并改良農作物不失為一種新的嘗試。因此，從本土超旱生荒漠植物中尋找新的DREB轉錄因子，在基因工程水平上培育抗旱，耐低溫，耐高鹽等新的作物品種具有重要意義。準噶爾無葉豆(Eremosparton songoricum(Litv. ) Vass.)系豆科無葉豆屬超旱生無葉灌木，僅片斷化分布于新疆古爾班通古特沙漠流動沙丘上，是典型的流沙先鋒植物。該種是我國的單屬種植物類群，西北荒漠植被中的標志性種，稀有種。由于長期生活在極端惡劣的流動沙丘環境中，沙漠干旱、少雨、大風、沙埋等環境塑造了準噶爾無葉豆抗旱的形態學及生理學特性，表現在該種為小半灌木，葉極端退化，以營養枝執行光合作用，故稱“無葉豆”;具有超強的根吸水能力以及細胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，長期的環境壓力使得該種具有抗旱，抗高溫，抗風蝕沙埋等抵抗多種非生物脅迫的能力，其體內必定蘊含著豐富的抗逆基因資源。準噶爾無葉豆作為天然抗逆性極強的典型荒漠沙生植物，開展該種的抗旱相關DREB轉錄因子基因的克隆，對于深入理解該種的耐旱機理及開發利用抗逆基因資源，定向培育植物新品種均有重要價值。
發明內容
本發明的第一個目的在于為了解決目前可利用的DREB轉錄因子比較少的問題， 提供一種超旱生沙漠植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子&DREB基因，其氨基酸序列由SEQ ID NO 3 所示。本發明的第二個目的在于提供一種編碼準噶爾無葉豆DREB轉錄因子EsDREB的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明的第三個目的在于，所述準噶爾無葉豆DREB轉錄因子基因在培育抗逆生物，尤其是抗非生物脅迫生物品種中的應用。本發明所述的一種超旱生植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子EsDREB，它具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其中轉錄因子&DREB為207個氨基酸。所述的準噶爾無葉豆DREB轉錄因子EsDREB的基因，該基因為核苷酸序列SEQ ID NO 2所示，其中基因編碼區長為624bp。將所示的核苷酸序列按常規方法進行酵母表達載體構建，酵母表達載體導入宿主，其中宿主為酵母菌株INV&1，得到具備抗逆能力的轉EsDREB基因的轉化體的功能測
試ο該基因在制備植物抗逆性育種和改良的用途。本發明為植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子EsDREB的基因，具體方法為取光照培養箱中培養的兩周大準噶爾無葉豆幼苗，以20%聚乙二醇6000處理4h 后取樣，提取總RNA;用總RNA進行逆轉錄得到cDNA，以cDNA為模板PCR擴增得到DRra轉錄因子基因， 命名為&DREB ；構建&DREB酵母表達載體pbridge，轉化酵母菌株AH109，利用該系統驗證該轉錄因子基因的轉錄激活活性；構建EsDREB植物表達載體pBI221，瞬時轉化洋蔥表皮細胞，觀察該轉錄因子基因的亞細胞定位情況；構建&DREB酵母表達載體PYES2，轉化酵母菌株INVkl，用酵母體系驗證該轉錄因子基因的功能。本發明以超旱生沙漠植物準噶爾無葉豆為材料，克隆了一種DREB轉錄因子基因 EsDREB，并對該基因的轉錄激活活性和亞細胞定位進行了研究。同時，利用酵母表達體系驗證了該轉錄因子基因具有抗旱，低溫和高溫脅迫的能力。本發明所述的植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子&DREB的基因為SEQ ID NO 1 EsDREB基因的AP2保守域的核苷酸序列TGAAACACTGGCAAAATGGATAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATCGGGTAATGAAGCCGAGAAGCCGGT TAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACT ACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGG TTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCATATGACGAAGCTGCTATGGCTATGTATGGSEQ ID NO 2 EsDREB基因的核苷酸序列TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATMATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACA AGTTTCCAATTTCTCTCA GCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAA ACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCAT GAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCATSEQ ID NO 3 EsDREB基因編碼的轉錄因子的氨基酸序列MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGEGDSGSGTSSSDPSLS
圖1為本發明準噶爾無葉豆DREB基因RT-PCR擴增電泳圖，其中泳道1 :cDNA為模板的擴增；泳道2 =DNA為模板的擴增；泳道M 分子量MakerDL2000圖2為本發明EsDREB轉錄因子基因序列分析圖，其中AP2保守結構域用下劃線標注，保守的第14位的纈氨(V14)和第19位的谷氨酰胺(E19)位點用方框標出。圖3為本發明EsDREB轉錄因子轉錄激活活性實驗的染色結果圖，其中a示意圖中 1,2,3分別代表未連接基因的pYES2空載，帶目的片段EsDREB基因的pYES2_EsDREB和帶有擬南芥AtDREB基因的pYES2-AtDREB重組載體；b是以上三種質粒轉化酵母感受態細胞 INVScl菌株并涂布在色氨酸、組氨酸缺陷型(SD/His-Trp)培養基上的篩選情況；c是以上三種質粒轉化酵母感受態細胞INVScl菌株后，陽性菌落經β -半乳糖苷酶顯色分析結果； d是以上三種質粒轉化酵母感受態細胞INVScl菌株后，菌液經半乳糖苷酶顯色分析結^ ο圖4為本發明EsDREB轉錄因子在植物細胞內的亞細胞定位分析的激光共聚焦顯微鏡觀察圖，其中a，b，c分別為暗視野觀察，亮視野觀察和疊加效果，且圖的上半部分為帶 EsDREB基因的pBI221-EsDREB重組載體在洋蔥表皮細胞的瞬時表達結果，圖的下半部分表示pBI221空載在洋蔥表皮細胞的瞬時表達結果。圖5為本發明重組載體pYES2_EsDREB轉化酵母菌株INVkl的菌液PCR圖，其中 M泳道為分子量Maker DL2000,泳道1為PCR的NTC陰性對照，泳道2為pYES2空載，泳道 3-6是帶檢測的轉化子，泳道7為帶EsDREB目的片段的陽性質粒。圖6為本發明INVk 1-pYES2_EsDREB重組酵母質粒成功構建的雙酶切圖，其中 1為陽性質粒，2-5為以上四個經菌液PCR鑒定為陽性的酵母轉化子，M為分子量Maker DL2000。圖7為本發明轉EsDREB轉錄因子基因的酵母菌在無脅迫條件和干旱脅迫下的生長實驗結果圖，其中a為無脅迫條件下的空載質粒PYES2 (上)和帶目的片段的重組載體 pYES2-EsDREB (下)的生長情況；b是2M山梨醇模擬干旱脅迫條件下兩者的生長情況。圖8為本發明轉&DREB轉錄因子基因的酵母菌在低溫，高溫脅迫下的生長實驗結果圖，其中a為低溫脅迫)，b為高溫脅迫(42°C )
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步闡述。下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規實驗操作進行，如《精編分子生物學實驗指南》(F. M奧斯伯，R.E.金斯頓，J. G塞德曼主編，馬學軍，舒躍龍譯，北京 科學出版社，2004)中所述的方法進行實施例1 準噶爾無葉豆中DREB類轉錄因子&DREB的克隆植物材料的獲得本試驗中的最初植物材料均為室內光照培養箱內萌發的兩周大準噶爾無葉豆幼苗，準噶爾無葉豆種子在播種前用濃度98%硫酸處理10-15min，清水沖洗5次，播種于兩層濾紙的玻璃培養皿中，溫度25°C，iai/d照光培養，每隔一天添加蒸餾水，兩周后收獲幼苗并用20 %聚乙二醇6000模擬干旱脅迫，處理無葉豆幼苗，處理4小時后，用蒸餾水沖洗干凈植物材料并立即置于液氮中凍存，之后轉移至溫度-80°C超低溫冰箱中保存；準噶爾無葉豆總RNA的提取和反轉錄RNA提取用TAKARA的RNAiso reagent試劑，具體步驟按說明書進行。經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定后，完整性和純度都較好的RNA樣本可用于下游反轉錄實驗，用1 μ g RNA進行反轉錄，反轉錄試劑是TAKARA的I^rimei^cript RT-PCR試劑盒，反轉錄反應如下5XPrimeScript Buffer 4μ 1PrimerScript 反轉錄酶混合液1 μ 1Oligo dT 引物(50μΜ) 1 μ 1
總RNA IUg去 RNA 酶的水up to 20 μ 1反轉錄反應條件為溫度37 °C，時間30min ；溫度85 °C，時間k ；cDNA全長序列的獲得基因保守片段的簡并引物擴增根據DREB轉錄因子家族的AP2保守結構域設計保守片段擴增的簡并引物，引物序列見下表的P5，P3引物對
權利要求
1.一種超旱生植物準噶爾無葉豆DREB轉錄因子^^1 8，其特征在于它具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其中轉錄因子&DREB為207個氨基酸。
2.根據權利要求1所述的準噶爾無葉豆DREB轉錄因子&DREB的基因，其特征在于該基因為核苷酸序列SEQ ID NO 2所示，其中基因編碼區長為624bp。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于將所示的核苷酸序列按常規方法進行酵母表達載體構建，酵母表達載體導入宿主，其中宿主為酵母菌株INVkl，得到具備抗逆能力的轉EsDREB基因的轉化體的功能測試。
4.根據權利要求2所述的基因，其特征在于該基因在制備植物抗逆性育種和改良的用途。
全文摘要
本發明提供了一種準噶爾無葉豆DREB類轉錄因子EsDREB基因及其應用，所述蛋白具有SEQ ID No3所示的氨基酸序列，該基因編碼區長為624bp，編碼207個氨基酸，亞細胞定位實驗表明該基因定位在細胞核，酵母單雜交實驗證明，該基因作為轉錄因子具有轉錄激活活性。同時，轉化該基因的酵母菌在干旱，冷，熱脅迫下的存活率都高于對照非轉基因酵母菌，說明沙漠植物準噶爾無葉豆的DREB類轉錄因子基因EsDREB具有非生物脅迫的抗性。本發明可以用于作物非生物脅迫轉基因育種研究。
文檔編號A01H5/00GK102424702SQ20111037796
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者張遠明, 張道遠, 李小雙, 楊紅蘭, 蔡明 , 裴金玲 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所