基因OsBBX14在提高水稻干旱脅迫耐性中的應用

基因OsBBX14在提高水稻干旱脅迫耐性中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物基因工程技術領域，具體設及通過提高0SBBX14基因的表達水平 來提局水稻干旱脅迫耐性。
【背景技術】
[0002] 水稻是中國第一大作物，其生產在中國國民經濟中占有舉足輕重的地位，近年來， 由于人口的迅速增長，資源短缺與環境惡化，人民需求增加，中國糧食生產正面臨著越來越 嚴峻的挑戰。因此，利用植物基因工程手段改良水稻，培育水稻優良新品種有著重要的意 義。傳統的轉基因方法都設及到選擇標記基因，選擇標記基因的應用使植物基因工程成為 可能。然而另一方面，由于選擇標記基因及其蛋白產物畢竟不是基因工程的目的產品，運些 基因存在于轉基因植物中會帶來許多問題，如影響環境和人類健康的安全性狂echendorf B. 1994. 12:870-875)。人們擔屯、選擇標記基因及其產物在食用時可能有毒性或會引起過敏 反應，尤其是選擇標記基因編碼產物如具有某一臨床或腸道應用的抗生素抗性時，人們擔 屯、選擇標記基因轉移進微生物中將增強病原微生物的抗藥性，從而引起抗生素失效，此外 如果抗生素選擇標記基因平行轉移到野草中，可能會使其轉變成為難W控制的雜草，造成 生態平衡的破壞。但是如果轉化植株中不含有選擇標記基因，那么上述問題就迎刃而解了。 總而言之，培育無選擇標記基因的植物有著重要的意義。水稻作為中國乃至世界上最重要 的糧食作物之一，其轉基因產品的無選擇標記化尤為重要。
[0003] 干旱已是世界性的問題，世界干旱、半干旱地區已占陸地面積的1/3W上，干旱對 植物的影響在諸多自然逆境因素中占首位。旱災造成的糧食損失要占全部自然災害糧食 損失的一半W上。國務院第二次全國農業普查領導小組辦公室、國±資源部和國家統計局 2008年2月29日發布第二次全國農業普查主要數據公報（第六號）顯示，截至2006年10 月31日，全國耕地面積一半W上是旱地。在自然條件下，干旱脅迫不僅嚴重影響了作物生 長發育和產量，而且限制了植物的分布。因此培育高抗農作物新品種成了一個高度緊迫的 重大問題。隨著分子生物學技術的發展，基因工程已成為當今種質資源創新和改良的強有 力的武器。水稻是世界第一大糧食作物，解決了全世界大約一半W上人口的吃飯問題。然而 干旱也嚴重地影響著水稻的種植和生產，在我國，僅2001年華北、西北和東北地區的466. 7 萬hm2稻田種植面積就因為缺水而減少了 53. 3萬hm2。此外，水稻生產直接受到水資源分 布的影響，我國大部分地區耕地是干旱和半干旱地區，因此水資源的缺乏和水稻需水量大 的矛盾嚴重影響水稻種植面積的推廣。
[0004] 目前用于抗旱基因工程的基因主要包括W下幾類。第一，參與滲透保護物質（如 脯氨酸、甘露醇、甜菜堿、海藻糖等）合成的基因。運樣能夠使植物在水分脅迫下能合成 更多的滲透調節物質，W提高植物的滲透調節能力，從而增強植物的抗旱性。如在水稻中 過量表達脯氨酸生物合成途徑上的關鍵酶基因（P5CS,deltal-pyrroline-S-carbo巧late synthase)提高了轉基因植株的抗旱性狂hu等，1998，PlantSci，199:41 - 48);第二，與清 除活性氧相關的基因。運類基因的表達增強植物對活性氧自由基的清除能力，使植物在水 分脅迫下過量表達一些酶（如SOD,POD,CAT等），W有效地排除有害的活性氧自由基，從而 提高細胞耐脫水的能力。運類基因在水稻中的應用未見報道；第Ξ，編碼晚期胚胎富含蛋白 (LEA)的基因。推測LEA蛋白可能有W下Ξ方面的作用：①作為脫水保護劑，由于LEA蛋白 在結構上富含不帶電荷的親水氨基酸，它們既能像脯氨酸那樣，通過與細胞內的其他蛋白 發生相互作用，使其結構保持穩定，又可能給細胞內的束縛水提供了一個結合的襯質，從而 使細胞結構在脫水中不致遭受更大的破壞。②作為一種調節蛋白而參與植物滲透調節。③ 通過與核酸結合而調節細胞內其它基因的表達。如在水稻中組成型地過量表達大麥的HVA1 基因，導致轉基因植株耐旱性增強狂U等，1996,PlantPhysiol, 110:249 - 257);第四，調 控基因。運類基因包括與ΑΒΑ途徑相關的基因，包括ΑΒΑ生物代謝相關基因（如NC邸和 ABAox)及ΑΒΑ信號傳導途徑相關的基因（如編碼bZIP類、Myb類、zinc-finger類轉錄因子 的基因）。最近多個bZIP類轉錄因子被證明影響水稻干旱脅迫耐性，如0sbZIP23、0sbZIP72 和了3481等位1日叫等，2008，？1日111曲731〇1，148:1938-1952;山等，？1日111日，2009， 229:605 - 615 ;Hobo等，1999,Proc化tlAcadSciUSA，96:15348 - 15353)。其它的調控基 因如SNAC1和OsSKI化也參與水稻干旱脅迫耐性（Hu等，2006,PNAS，35 :12987-12992;Hou 等，PNAS，2009,106:6410-6415)。特別是OsSKIPa過量表達的轉基因水稻植株不僅提高了 清除活性氧的能力，而且許多脅迫相關基因（SNAC1、CBF2、PP2C和RD22)轉錄水平也提高。 陽〇化]由于人們對植物抗旱的分子機制缺乏了解，抗旱分子育種還有很大的盲目性。而 且水稻抗旱作用是眾多抗旱基因共同表達的結果，采用單基因策略提高植物的抗旱性在實 際生產應用中效果不明顯，如果改變一個基因的表達能夠整體調控植物耐旱反應能力，那 將是一個理想的選擇。
[0006] 在分析光敏色素調節水稻農藝性狀形成機制過程中，本課題組篩選到受地yB下 調的一個doubleB-box鋒指蛋白基因。進化樹分析表明，該基因編碼蛋白與擬南芥的 BBX22屬于同一個分支，化ang等人（2012)將其命名為0SBBX14。在我們前期研究過程中 發現，亞細胞定位和轉錄激活活性分析結果表明0SBBX14定位于細胞核，并具有轉錄激活 活性，據此推測0SBBX14可能是轉錄因子。

【發明內容】

[0007] 本發明從水稻品種日本晴中分離克隆到B-box鋒指蛋白的0SBBX14基因，轉入水 稻中提高0SBBX14基因的表達水平，顯著提高了水稻的干旱脅迫耐性。因此，在水稻中過量 表達0SBBX14基因的表達對于提高水稻干旱脅迫耐性具有重要意義，運為水稻的高抗旱性 育種提供新的思路。
[0008] 本發明申請人在一個水稻光敏色素突變體中，利用基因表達圖譜鑒定到一個基 因編號為0s05g0204600的、編碼B-box鋒指蛋白的0SBBX14基因的信使RNA序列。水稻 0SBBX14基因信使RNA序列為2055個堿基，編碼377個氨基酸和一個終止密碼子。本發明 通過PCR方法，擴增出水稻品種日本晴的0SBBX14基因的全長編碼區，包含1134個堿基，正 向連接在植物雙T表達載體pCDMAR-ubi-化OS上；再進行遺傳轉化至水稻中，提高0SBBX14 基因的表達，得到0SBBX14基因表達增強的轉基因水稻植株。在轉基因的T3代植株中發現， 陽性轉基因水稻植株的干旱脅迫耐性顯著高于野生型水稻。
[0009] 本發明用于構建過量表達0SBBX14基因的植物雙T表達載體、增強0SBBX14基因 表達的基因0sBBX14的DM序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0010] 本發明通過PCR方法，擴增出水稻品種日本晴的OsBBXH基因的全長 編碼區，正向連接在植物雙T表達載體pCDMAR-ubi-化OS上，得到植物表達載體 pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos;再進行遺傳轉化至水稻中，提高0SBBX14基因的表達水平，轉基 因水稻植株表現出干旱脅迫耐性增強。在干旱（20%陽G4000)條件下，90%W上的轉基因 植株能夠恢復正常生長，而野生型幾乎全部死亡。
[0011] 其中，植物雙T表達載體pCDMAR-ubi-化OS是將克隆在PMD18-T載體上的玉米 泛素啟動子化i利用SacI和化nl雙酶切，替換pCDMAR-Hyg載體SacI和化nl之間的 片段，獲得pCDMAR-ubi ;然后將克隆在PMD18-T載體上的化OS序列利用甜al和Sail雙 酶切替換pCDMAR-ubi載體甜al和SalI之間的片段，同時引入Spel酶切位點，獲得了 pCDMAR-ubi-Tnos植物表達載體。
[0012] 上述轉基因水稻植株進一步剔除含有選擇標記基因的轉基因植株。轉基因植 株的具體獲取方法是：植物表達載體pCDMAR-ubi-化OS植物表達載體轉化至農桿菌菌株 EHA105,然后侵染水稻愈傷組織，采用含有潮霉素的固體篩選培養基培養，然后篩選具有潮 霉素抗性的愈傷組織進行分化、生根、移苗得到轉基因植株，并剔除攜帶有潮霉素選擇標記 的轉基因水稻植株。
[0013] 本發明的優點在于：
[0014] (1)本發明提供了一種提高水稻干旱脅迫耐性的基因0SBBX14。申請人在水稻中 過量表達0SBBX14基因后，發現轉基因陽性植株干旱脅迫耐性顯著提高。
[0015] (2)本發明首次分離克隆了水稻0SBBX14基因，并首次在水稻中過量表達了 0SBBX14基因。為培育耐受干旱的水稻品種提供了新的思路，也為其它作物利用異源基因技 術提高水稻干旱脅迫耐性提供了理論支持。
[0016] (3)本發明首次初步掲示了水稻0SBBX14基因提高水稻干旱脅迫耐性的機制，為 提高水稻等禾谷類作物的干旱脅迫耐性研究提供支持。
[0017] (4)本發明使用的植物雙T表達載體pCDMAR-ubi-化OS轉化水稻獲得的轉基因水 稻不含有選擇標記基因，此外目的基因兩側含有MR序列，能夠提高目的基因在受體植物 中的表達水平及表達穩定性，最終獲得的轉基因株系更加高效穩定。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明的0SBBX14基因表達載體的構建示意圖。將克隆在PMD18-T載體上 的化i用SacI和化nl雙酶切，替換pCDMAR-Hyg載體SacI和化nl之間的片段，將克隆在 PMD18-T載體上的化OS用甜al和Sail雙酶切替換pCDMAR-ubi載體甜al和Sail之間的 片段，同時引入Spel酶切位點，獲得了pCDMAR-ubi-化OS植物表達載體；將克隆在PMD18-T 載體上的0SBBX14基因利用BamHI和Spel酶切，替換植物雙T表達載體pCDMAR-ubi-Tnos 上BamHI和Spel之間的DM片段，運樣0sBBX14基因正向插入玉米泛素基因啟動子（Pubi) 后，即pCDMAR-ubi-BBX14-Tnos植物表達載體；
[0019] 圖2為檢測T3代轉基因水稻陽性植株中0SB