專利名稱：一種神經干細胞儲存管的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞生物學領域，具體涉及一種用于神經干細胞儲存的容器。
背景技術：
神經干細胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成體腦、脊髓等組織中的一種干細胞，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，可通過不對等的分裂方式分化成神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等神經組織的各類細胞，也可轉分化成血細胞和骨骼肌細胞。目前的科學技術已經可以在體外培養擴增神經干細胞，神經干細胞在體外培養過程中一般呈懸浮狀態，不貼壁，并有形成神經球(Neurosphere)的特性。體外培養的神經干細胞可用于生命科學研究、藥物篩選測試、臨床應用研究等領域。神經干細胞的長期儲存方式一般是添加凍存保護劑后裝入凍存管凍存于_196°C 液氮罐中(一般可保存I年以上)，短期儲存方式可將神經干細胞重懸于生理鹽水或細胞培養液中裝入保存管在4°C冰箱中暫存(一般在12小時以下)。目前常用的市售細胞凍存管一般是聚丙烯材質，并且管底垂直面與水平面交接處為死角，在將管內儲存的神經干細胞取出時，凍存管的內壁殘留的神經干細胞非常多，從而造成儲存回收率低、損耗大，提高了神經干細胞的儲存成本。另外神經干細胞離心、常溫暫存常用的容器一般是聚苯乙烯或聚乙烯材質的離心管，也會因吸附等原因造成一定數量的細胞損失。而本發明提供的內壁管底或管底交界處呈圓滑弧形、內壁為白蛋白包被層的儲存管，能夠大大減少神經干細胞在內壁的殘留，降低儲存過程中的損耗，并延長細胞儲存時間，提高神經干細胞儲存效果。
發明內容
本發明的目的在于提供一種低殘留率的神經干細胞儲存管。本發明的技術方案如下一種神經干細胞儲存管，包括瓶蓋⑴和可立瓶體(2)，瓶蓋⑴外旋或外扣在可立瓶體(2)的瓶口處，所述可立瓶體(2)的內壁的垂直面(3)與水平面(4)的連接處呈圓滑的弧形(5)，或者內壁整個底部呈弧形(7)，并且所述可立瓶體(2)的內壁表面為白蛋白包被層(6)。上述神經干細胞儲存管在用于保存人類神經干細胞時，所述的白蛋白包被層優選使用人血白蛋白包被。上述神經干細胞儲存管的瓶蓋和可立瓶體的基本材質可使用任何具有一定機械強度、耐低溫并對細胞無毒害的高分子材質，在低溫儲存時優選使用聚丙烯材質，常溫儲存時優選使用聚苯乙烯或聚乙烯材質。白蛋白(又稱清蛋白，Albumin)屬于球蛋白，是血衆中含量最多的蛋白質,具有維持血漿膠體滲透壓、血漿物質載運、保護血細胞、提供營養、結合重金屬離子和毒素等功能，在生物學實驗中常添加于細胞培養液中。此外因其能夠與免疫反應板上的蛋白結合位點結合，也常在免疫實驗中用作封閉液，以阻止后續操作步驟中的抗原或抗體與反應板結合。人血白蛋白(Human Albumin)是人體產生的白蛋白，可從健康人的血液中提取,能夠直接靜脈注射到病人體內，主要用于失血創傷、燒傷弓I起的休克,腦水腫及損傷弓I起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹水，癌癥術后恢復等方面的治療，是一種臨床藥品， 國內多家生物醫藥企業有生產銷售。本發明中的白蛋白包被層可以通過物理吸附或共價交聯等多種方式附著在神經干細胞儲存管的內壁上。本發明通過在儲存管底部引入呈圓滑弧形的表面避免了神經干細胞在死角處的殘留，通過在內壁表面添加一層白蛋白包被層減少了儲存管內壁對神經干細胞的吸附，從而極大降低了神經干細胞在儲存管的殘留率。此外，本發明用于4°C儲存神經干細胞時可達到48小時而活細胞數量無明顯降低，極大延長了神經干細胞在4°C的儲存時間。本發明的有益效果是，能夠降低神經干細胞在儲存過程中的損耗，降低儲存成本， 延長神經干細胞在4°C的儲存時間，提高神經干細胞儲存效果。
圖I :本發明一個實施例的縱切面。圖2 :普通細胞凍存管的縱切面。圖3 :本發明另一個實施例的縱切面。
具體實施例方式本發明可以通過以下手段制造或實現(I)使用模具和高分子聚合物材料如聚丙烯制作成所需形狀；(2)將5%白蛋白溶液加入管內，放置于水平搖床上4°C反應12個小時，形成白蛋白包被層；(3)用超純水洗滌、晾干。實施例I(I)使用模具和高分子聚合物材料聚丙烯制作成所需形狀(圖I) ; (2)將5%人血白蛋白溶液加入管內，放置于水平搖床上4°C反應12個小時，形成人血白蛋白包被層(圖 I)。從ICR鼠腦組織皮層獲取的神經干細胞(經免疫熒光鑒定表達神經干細胞標志物巢蛋白nestin)進行培養擴增后取其中I. 2X 10~7個，重懸于一定體積的凍存液(含10% DMS0，0. lg/ml BSA)，使細胞懸液的最終濃度為I. OX 10~6個細胞/ml，分裝到6支本發明制作的神經干細胞儲存管(實驗組)和6支普通細胞凍存管(對照組)中，每管lml，放入程序降溫儀，以_1°C /min的速度降溫，然后轉入液氮中凍存。I周后將液氮中的凍存細胞取出，在37°C水浴鍋中溫育復融，加入5倍體積的 DMEM培養液重懸，離心去上清；重復該洗滌步驟；然后加入I倍體積的DMEM培養基(購自 Invitrogen公司)重懸,經自動細胞計數儀計數,實驗組和對照組的計數結果如下實驗組(單位10~5個細胞/ml) :7. 5,7. 8,7. 2,7. 6,8. 1,7. 7 ；對照組(單位10~5個細胞/ml) 5. 5,5. 8,5. 7,6. 1,5. 5,5. 9
統計分析表明實驗組與對照組差異顯著(P < O. 001)，說明本發明能夠改善細胞凍存復蘇率。實施例2(I)使用模具和高分子聚合物材料聚丙烯制作成所需形狀(圖I) ; (2)將5%人血白蛋白溶液加入管內，放置于水平搖床上4°C反應12個小時，形成人血白蛋白包被層(圖 I)。從ICR鼠腦組織皮層獲取的神經干細胞(經免疫熒光鑒定表達神經干細胞標志物巢蛋白nestin)進行培養擴增后取其中I. 2X 10~7個，重懸于生理鹽水中，使細胞懸液的最終濃度為1.0X10~6個細胞/ml，分裝到6支本發明制作的神經干細胞儲存管(實驗組)和 6支普通細胞凍存管(對照組)中，每管lml，放入4°C冰箱。12小時后將冷藏的細胞從冰箱中取出，經自動細胞計數儀計數，實驗組和對照組的計數結果如下實驗組(單位10~5個細胞/ml) 9. 8,9. 5,9. 7,9. 6,9. 9,9. 4 ；對照組(單位10~5個細胞/ml) 8. 3,8. 2,8. 4,7. 9,8. 5,8. 2 統計分析表明實驗組與對照組差異顯著(P < O. 001)，說明本發明能夠改善細胞冷藏效果。
權利要求
1.一種神經干細胞儲存管，包括瓶蓋(I)和可立瓶體(2)，瓶蓋(I)外旋或外扣在可立瓶體(2)的瓶口處，其特征在于，所述可立瓶體(2)的內壁的垂直面(3)與水平面(4)的連接處呈圓滑的弧形(5)，或者內壁整個底部呈弧形(7)，并且所述可立瓶體(2)的內壁表面附有白蛋白包被層￠);其中白蛋白包被層以物理吸附或共價交聯的方式附著在可立瓶體的內壁上。
2.權利要求I所述的一種神經干細胞儲存管，其特征在于，所述的白蛋白包被層為人血白蛋白包被層。
全文摘要
本發明公開了一種神經干細胞儲存管，涉及細胞生物學領域。本發明對神經干細胞儲存管內壁底部的形狀進行了改進，并在內壁添加了一層白蛋白包被層，能夠大大減少神經干細胞在內壁的殘留，降低儲存過程中的損耗，延長神經干細胞在4℃儲存時間，提高神經干細胞儲存效果。
文檔編號A01N1/02GK102599145SQ20121003461
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者楊立敏, 鄭佳威, 金宜強, 馬曉春 申請人:上海安集協康生物技術有限公司