專利名稱：神經干細胞培養基及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養基，具體是涉及一種用于培養神經干細胞的培養基，本發明還涉及該神經干細胞培養基的制備方法。
對于一般的胚胎干細胞而言，在適宜環境下可以分化生長成各種不同的組織細胞，故人們可用胚胎干細胞培育出各種新組織甚至器官進行移植。而對于神經干細胞而言，主要焦點在于成功地從不同途徑培養、獲得足夠數量的神經前體細胞，以供移植治療、或進行轉基因操作攻擊腫瘤的生長、觀察某些合成/天然化合物的神經活性等。比如，若能從自體抽得骨髓組織作為神經干細胞的種子細胞，在一定條件下誘導分化為神經干細胞、進而回輸于自體體內，并在局部微環境作用下產生多巴胺能神經細胞，就可用于治療其帕金森癥。而令這種技術應用的關鍵前提，是能否使骨髓源等種子細胞在特定環境中培養成所需的神經干細胞。現用一般合成細胞培養基均為普遍細胞存活培養之用，如Eagle，DMEM，F12，RPMI1640，CMRL1066，L15，199，MB752/1等，其主要含有成份為氨基酸、維生素、無機鹽、糖類等。這些合成培養基的主要作用是為不同種類組織細胞提供一般生存生長的微環境，而上述細胞培養基都缺乏將不同來源的種子細胞(如骨髓組織細胞等)定向分化為神經干細胞的能力。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有使骨髓組織等不同來源種子細胞定向發育分化為神經干細胞功能的細胞培養基，可隨時準確無誤地為醫學科研教學及臨床應用提供相關需要的神經干細胞。
本發明的另一目的提供該神經干細胞培養基的制備方法。
為實現上述目的，本發明神經干細胞培養基由下列重量配比的組分配成(重量份)DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎培養液10000～25000胰島素(Insulin) 4.5～12.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～35.6硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.51氫化可的松(Hydrocortisone) 5.0～35.0所述本發明各組分的優先重量(份)配比范圍是DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎培養液 10000～15000胰島素(Insulin) 4.5～6.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～15硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.4氫化可的松(Hydrocortisone) 9～12所述本發明還包含下列重量配比的組分(重量份)L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 3.5～12.5人轉鐵蛋白(Transferrin) 50.0～150.0黃體酮(Progesterone) 0.01～0.55將上述各組分制成本發明神經干細胞培養基的制備方法依次包括以下步驟①按所述比例取DMEM和F12以1∶1混合而成的基礎培養液，加純凈水至濃度為10～25g/L，并充分攪拌溶解，制得細胞的一般基礎培養液；②按所述比例再取胰島素(Insulin)、鹽酸丁二胺(Putrescine)、硒化鈉(SodiumSelenide)、氫化可的松(Hydrocortisone)依次加入基礎培養液中，充分攪拌均勻；③以1～10當量濃度的氫氧化鈉調pH7.4～8.0；
④層流細胞培養室抽濾消毒，4℃儲存備用。
本發明神經干細胞培養基的制備方法的步驟2中還可按所述比例加入L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、人轉鐵蛋白(Transferrin)、黃體酮(Progesterone)。
本發明中的DMEM和F12混合而成的基礎培養液作為一般種子細胞生長發育的基本微環境；胰島素可通過促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，從而促進細胞增殖分裂，特別是促進神經干細胞生長；L-谷氨酰胺可促進神經干細胞發育生長期間核酸、蛋白質的合成；鹽酸丁二胺能刺激、誘導神經干細胞增殖；硒化鈉參與、促進神經干細胞代謝；人轉鐵蛋白可結合鐵離子，減少其毒性和被細胞所利用，同時使神經干細胞數量增多、減少成纖維細胞數；氫化可的松促進神經干細胞生長發育；黃體酮促進神經干細胞生長。用本發明培養的神經干細胞經過免疫細胞化學鑒定表達特有的高親和力抗原NESTIN；表達NESTIN抗原的神經干細胞可進一步分化為神經元、神經膠質細胞，證明本發明能有效地誘導包括骨髓組織種子細胞在內的各種來源組織細胞分化為神經干細胞，其誘導時間為11～21天。用本發明培養的神經干細胞移植至有腦或脊髓損傷的病灶周圍，移植3個月后癥狀有明顯改善(主要表現為運動功能不同程度的恢復)，病理切片檢測有神經干細胞向病灶區遷移、整合現象。另外其配制方法簡單，可重復性強，操作簡便易行。本發明為有關神經干細胞及其應用的科研、教學、臨床應用等能起到不可估量的作用，同時也孕育著巨大的社會效益和經濟效益。
2、再取胰島素(Irsulin)5mg、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)3.9mg、鹽酸丁二胺(Putrescine)10mg、硒化鈉(Sodium Selenide)0.03mg、人轉鐵蛋白(Transferrin)50mg、氫化可的松(Hydrocortisone)10mg、黃體酮(Progesterone)0.02mg依次加入步驟1所制得的基礎培養液中，充分攪拌均勻，并以純凈水定容為1000毫升，此時呈橙黃微濁狀態；3、以5當量濃度的氫氧化鈉調pH為7.8，此時培養基呈桃紅色清亮狀態；4、層流細胞培養室抽濾消毒(過濾膜孔直徑為0.22μm規格)，4℃儲存備用。
配制上述實施例二、三、四的制備方法與實施例一相同，不同之處在于各組分的含量。
權利要求
1.一種神經干細胞培養基，其特征在于由下列重量配比的組分配成DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎培養液10000～25000胰島素(Insulin) 4.5～12.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～35.6硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.51氫化可的松(Hydrocortisone) 5.0～35.0
2.根據權利要求1所述的神經干細胞培養基，其特征在于所述各組分的優先重量(份)配比是DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎培養液 10000～15000胰島素(Insulin) 4.5～6.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～15硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.4氫化可的松(Hydrocortisone) 9～12
3.根據權利要求1或2所述的神經干細胞培養基，其特征在于還包含下列重量配比的組分L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 3.5～12.5人轉鐵蛋白(Transferrin) 50.0～150.0黃體酮(Progesterone)0.01～0.55
4.權利要求3所述神經干細胞培養基的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟①按所述比例取DMEM和F12以1∶1混合而成的基礎培養液，加純凈水至濃度為10～25g/L，并充分攪拌溶解，制得細胞的一般基礎培養液；②按所述比例再取胰島素(Insulin)、鹽酸丁二胺(Putrescine)、硒化鈉(Sodium Selenide)、氫化可的松(Hydrocortisone)依次加入基礎培養液中，充分攪拌均勻；③以1～10當量濃度的氫氧化鈉調pH7.4～8.0；④層流細胞培養室抽濾消毒，4℃儲存備用。
5.根據權利要求4所述神經干細胞培養基的制備方法，其特征在于步驟2中還可按所述比例加入L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、人轉鐵蛋白(Transferrin)、黃體酮(Progesterone)。
全文摘要
本發明公開了一種神經干細胞培養基及其制備方法,由DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎培養液、胰島素、鹽酸丁二胺、硒化鈉、氫化可的松、L－谷氨酰胺、人轉鐵蛋白和黃體酮配制而成,本發明具有使骨髓組織等不同來源種子細胞定向發育分化為神經干細胞功能,可隨時準確無誤地為醫學科研教學及臨床應用提供相關需要的神經干細胞;其配制方法簡單,可重復性強,操作簡便易行。
文檔編號C12N5/00GK1389566SQ0213431
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月8日 優先權日2002年7月8日
發明者姜曉丹, 徐如祥 申請人:姜曉丹, 徐如祥