干細胞的分化狀態的判定方法以及該判定方法中使用的新的分化標記與流程
本發明涉及一種新的分化標記，其能夠在分化的初始階段判定干細胞的分化狀態。
背景技術：
對于ES細胞(Embryonic Stem cell，胚胎干細胞)、iPS細胞(Induced Pluripoent Stem Cell，誘導多能干細胞)等多能干細胞而言，為了維持其多能性，需要采用下述技術，例如，與飼養層細胞共同培養、用來自飼養層的條件培養基(CM)進行培養、對培養基添加堿性FGF(bFGF/FGF2，basic Fibroblast Growth Factor，堿性成纖維細胞生長因子)或LIF(leukemia inhibitory factor，白血病抑制因子)等。否則有時會因環境、細胞狀態而喪失多分化能力，導致容易分化。因此，準確地獲知干細胞的未分化狀態(具備多能性的狀態)、分化狀態很重要。
另外，在再生醫療領域中，在使多能干細胞分化為目標細胞后，再進行移植，但是，在進行該移植的細胞中混有未分化細胞時，可能導致腫瘤形成。鑒于此，對經分化誘導處理的多能干細胞中是否混有未分化干細胞進行判定的技術很重要。
然而，難以根據細胞表觀來判斷細胞的分化狀態。
因此，作為判定多能干細胞的分化狀態的方法，實施對作為分化狀態的指標的標記進行檢測的方法。例如，堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)、Nanog、Oct4、TRA-1-60、Sox、LIF-R等作為多能干細胞的多能性標記眾所周知。多能干細胞在未分化狀態下表達這些標記，因此，通過檢測這些標記，能夠判斷干細胞是否維持未分化狀態。然而，如果干細胞不處在已進行一定程度的分化的狀態下(例如，截止至三胚層中的任意時期為止)，上述標記就不能判定分化狀態。因此，在分化誘導后的分化初始階段，難以判斷未分化細胞是維持其未分化狀態(多能性)，還是處于已獲得未來進行分化的分化能力的狀態。
另一方面，已知被稱作Fox(Forkhead box)的具有叉頭(forkhead)或翼螺旋(winged helix)DNA結合域的轉錄因子的一組(非專利文獻1)，而且，已知其在人體內存在有約50種(FOXB1、FOXB2等)。雖然已知Fox的表達蛋白質主要作為生長調節因子、組織特異性調節因子、細胞周期調節因子而發揮作用，但是，作用基本上尚未闡明。
現有技術文獻
非專利文獻
非專利文獻1：Eddy H van Roon等.Clinical Epigenetics 2013,Jan 16；5(1):2.doi:10.1186/1868-7083-5-2。
技術實現要素：
發明所要解決的問題
本發明的課題在于，提供一種能夠在分化的初始階段判定未分化干細胞的分化狀態的方法。
解決問題的技術方案
本發明是為了解決上述課題而完成的，并且具有以下構成。
(1)細胞分化狀態的判定方法，其對干細胞中FOXB2基因的表達進行檢測并基于該檢測結果進行判定。
(2)分化標記，其選自FOXB2基因來源的mRNA或蛋白質。
眾所周知的是，用添加有堿性FGF(bFGF,FGF2，basic Fibroblast Growth Factor，堿性成纖維細胞生長因子)的培養基對ES細胞、iPS細胞等未分化細胞進行培養時，該未分化細胞長期維持未分化狀態并進行增殖。
本發明人等為了解決上述課題進行了精心的研究，結果發現，使用未添加bFGF的培養基來培養iPS細胞時(分化誘導處理)，在開始培養后，經3～5天，檢測出iPS細胞中FOXB2 mRNA的表達，而且確認了其表達量顯著增加的現象。另外，還確認了在使用添加有bFGF的培養基進行培養并維持未分化狀態的iPS細胞中，未確認到FOXB2 mRNA的表達。由此，發現FOXB2 mRNA作為ES細胞、iPS細胞的分化標記很有用，而且，通過測定所述FOXB2mRNA的表達，能夠篩選出處于分化初始階段的細胞，從而完成了本發明。
發明效果
通過實施本發明的方法，能夠在分化的初始階段判定干細胞的分化狀態。另外，本發明能夠用于干細胞的品質管理、分化細胞的制備、分離方法中。進而，由于本發明能夠在培養初始階段判定分化的細胞，因此，本發明在細胞的早期篩選、干細胞的品質管理方面很有用，能夠有望縮短培養期間、降低培養基的成本。
附圖說明
圖1是在實施例1中得到的表示通過RT-PCR法檢測hiPS細胞的FOXB2 mRNA的表達的結果的電泳圖。在圖1中，分別示出了(1)FOXB2 mRNA的表達的檢測結果、(2)GAPDH mRNA的表達的檢測結果、(3)OCT3/4 mRNA的表達的檢測結果、(4)NANOG mRNA的表達的檢測結果、(5)SOX2 mRNA的表達的檢測結果。
圖2是在實施例2中得到的表示通過RT-PCR法研究FOXB2 mRNA的表達的結果的電泳圖。
圖3是在實施例3中得到的表示通過RT-PCR法研究FOXB2 mRNA的表達的結果的電泳圖。
圖4是在實施例4中得到的表示通過RT-PCR法研究的Foxb2 mRNA的表達的結果的電泳圖。
圖5是在參考例1中得到的使用未添加bFGF的培養基而培養的hiPS細胞的照片(圖5(1))以及使用添加有bFGF的培養基而培養的hiPS細胞的照片(圖5(2))。
具體實施方式
作為本發明的干細胞，可舉出具有所謂的自我復制能力以及能分化成各種細胞的分化能力的細胞。例如，除了作為具有多分化能力(多能性)的未分化細胞的ES細胞、iPS細胞以外，還可舉出ntES細胞(nuclear transfer Embryonic Stem Cell，核轉移胚胎干細胞)、EG細胞(Embryonic Cell，胚胎生殖細胞)、EC細胞(Embryonic Cell，胚胎瘤干細胞)等。
另外，作為干細胞所來源的動物，例如，可舉出人、牛、馬、狗、豚鼠、小鼠、大鼠等哺乳動物。
作為用于本發明的細胞分化狀態的判定方法中的受檢細胞的干細胞，可舉出經公知的分化誘導處理的干細胞、經維持未分化狀態的處理的干細胞、經公知的多能性誘導處理而脫分化的體細胞等。
作為對未分化干細胞進行分化誘導處理的方法，可采用已知的方法，沒有特別的限定。例如，可舉出在使用公知的分化誘導物質來處理細胞后對其進行培養的方法、使用不含有bFGF、LIF的培養基進行培養等在未分化干細胞被分化誘導的環境下進行培養的方法等。
作為誘導未分化干細胞進行分化的化學物質(分化誘導物質)，已知：例如，誘導分化為神經細胞的維甲酸(Retinoic Acid)；誘導分化為心肌細胞的精胺(Spermine)、丁酸鈉(Sodium Butyrate)、曲古菌素A(Trichostatin A)；誘導小鼠ES細胞分化為胰島素生成細胞的DNA甲基轉移酶抑制劑(DNA Methyltransferase Inhibitor)等。
“未分化狀態”是指，例如，細胞處于具有上述自我復制能力以及能分化成各種細胞的分化能的狀態。
對于“維持未分化狀態的處理”而言，例如，只要是公知的維持干細胞的未分化狀態的處理即可，例如，可舉出與飼養層細胞共培養、向培養基中添加bFGF、LIF的處理等。
本發明的FOXB2基因是指，對用于判定的細胞所來源的動物物種中存在的FOXB2蛋白質進行編碼的基因DNA、RNA等。另外，還包括對FOXB2蛋白質的同源物、突變體以及衍生物等進行編碼的基因。進而，還包括在嚴格條件下與所述基因進行雜交的堿基序列以及包含該序列的基因、具有與FOXB2基因具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的堿基序列的基因等。
具體而言，例如，作為人FOXB2基因，可舉出與由序列號1表示的堿基序列(人FOXB2mRNA的堿基序列)對應的基因、具有對由序列號2表示的蛋白質進行編碼的堿基序列的基因、或者具有與所述堿基序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的堿基序列的基因。
例如，作為小鼠Foxb2基因，可舉出與由序列號34表示的堿基序列(小鼠Foxb2mRNA的堿基序列)對應的基因、具有對由序列號35表示的蛋白質進行編碼的堿基序列的基因、或者具有與所述堿基序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的堿基序列的基因。
作為本發明的FOXB2 mRNA，可舉出由用于判定的細胞所來源的動物物種中存在的FOXB2基因轉錄的mRNA，例如，上述FOXB2基因來源的mRNA。
作為FOXB2基因來源的mRNA，例如，作為人FOXB2 mRNA，可舉出下述mRNA等。
·具有由序列號1表示的堿基序列(GenBank Accession No.NM_001013735)的mRNA
·具有與由序列號1表示的堿基序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的堿基序列的mRNA
·對由序列號2表示的氨基酸序列進行編碼的mRNA
·對由序列號2表示的氨基酸序列經1個～幾個、優選為1～5個、更優選為1～3個氨基酸的缺失、插入、添加或取代而形成的氨基酸序列進行編碼的mRNA
·對與由序列號2表示的氨基酸序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的氨基酸序列進行編碼的mRNA。
例如，作為小鼠Foxb2 mRNA，可舉出下述mRNA等。
·具有由序列號34表示的堿基序列(GenBank Accession No.NM_008023)的mRNA
·具有與由序列號34表示的堿基序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的堿基序列的mRNA
·對由序列號35表示的氨基酸序列進行編碼的mRNA
·對由序列號35表示的氨基酸序列經1個～幾個、優選為1～5個、更優選為1～3個氨基酸的缺失、插入、添加或取代而形成的氨基酸序列進行編碼的mRNA
·對與由序列號2表示的氨基酸序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的氨基酸序列進行編碼的mRNA
作為本發明的FOXB2蛋白質，可舉出由用于判定的細胞所來源的動物物種中存在的FOXB2基因翻譯而成的蛋白質。也可以是這種FOXB2蛋白質的同源物、突變體以及衍生物。
例如，作為人FOXB2蛋白質，可舉出下述蛋白質等。
·具有由序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質、或者具有所述氨基酸序列經1個或幾個、優選為1～5個、更優選為1～3個氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列的蛋白質
·具有與由序列號2表示的氨基酸序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質
作為小鼠FOXB2蛋白質，可舉出下述蛋白質等。
·具有由序列號35表示的氨基酸序列的蛋白質、或者具有所述氨基酸序列經1個或幾個、優選為1～5個、更優選為1～3個氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列的蛋白質
·具有與由序列號35表示的氨基酸序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質
＜I.本發明的細胞分化狀態的判定方法＞
本發明的細胞分化狀態的判定方法是“對干細胞的FOXB2基因的表達進行檢測并基于該檢測結果進行判定的細胞分化狀態的判定方法。”
＜I-1.對FOXB2基因的表達進行檢測的方法＞
作為對FOXB2基因的表達進行檢測的方法，可舉出對FOXB2 mRNA的表達進行檢測的方法、或者對FOXB2蛋白質的表達進行檢測的方法。
本發明中，“對表達進行檢測”的情況，包括“對FOXB2基因是否表達(例如，是否存在FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白質)進行檢測”的情況以及“對FOXB2基因表達量(例如，FOXB2mRNA的量、或者FOXB2蛋白質的量)進行測定”的情況。
FOXB2基因的表達的檢測是在經分化誘導處理后的受檢細胞表達至能夠檢測到FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白質的程度后進行的。具體而言，在對受檢細胞進行分化誘導處理后，以上限為7天以內、優選為6天以內、更優選為5天以內、下限為1天以上、優選為2天以上、更優選為3天以上進行培養，然后采集細胞，進行下述FOXB2基因表達的檢測即可。其間，可以每天采集細胞，進行FOXB2基因表達的檢測。
(1)對FOXB2 mRNA的表達進行檢測的方法
對FOXB2 mRNA的表達進行檢測的方法，只要是已知的檢測mRNA的方法，就沒有特別的限定，可適當地選擇公知的方法。
例如，除了RT-PCR法(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，逆轉錄聚合酶鏈反應)、實時RT-PCR法、競爭PCR法、原位PCR(in situ PCR)法、原位雜交法、DNA陣列法、Northern雜交(Northern hybridization)法、FISH法、斑點印跡法、核糖核酸酶保護法(RNase protection assay)、RT-LAMP法以外，還可舉出：使用結合于金納米粒子的與目標RNA互補的互補鏈(捕獲鏈)以及作為捕獲鏈的互補鏈的報告鏈的SmartFlareTM法、使用具有與目標RNA對應的序列的兩種熒光探針(還原觸發型熒光激活探針(Reduction-triggered Fluorescence activation probe)，RETF probe)的檢測法、利用芳香族親核取代反應的檢測法(使用CNs-AMCA探針及MBA探針的方法，所述CNs-AMCA探針是結合有與目標RNA互補的DNA且修飾了以2-氰基-4-硝基苯磺酰基保護的氨基香豆素的探針，所述MBA探針是結合有與目標RNA互補的DNA且經由苯硫酚基修飾的探針)等方法。
1)RT-PCR法
RT-PCR法是指以目標FOXB2基因(例如，FOXB2 mRNA)為模板，通過逆轉錄反應合成cDNA后，利用PCR進行DNA擴增的方法(Kawasaki,E.S.,et al.,Amplification of RNA.In PCR Protocol,A Guide to methods and applications,Academic Press,Inc.,SanDiego,21-27(1991))。對逆轉錄反應及DNA擴增反應的條件沒有特別的限定，能夠采用適當優選的條件。另外，該目標基因(例如，FOXB2 mRNA)的擴增區域無須是該基因全長，只要對擴增產物的確認沒有妨礙，也可以是該基因中的一部分區域。對于已擴增的cDNA量(相當于mRNA量)而言，例如，可以在將上述DNA擴增反應液用于電泳后，使用與目標擴增片段特異性雜交的探針來進行檢測。
具體而言，例如，首先采用公知的方法從受檢細胞中提取、分離mRNA。接著，將具有與FOXB2 mRNA的堿基序列對應的堿基序列的核苷酸鏈用作擴增用引物，以上述得到的mRNA為模板來實施RT-PCR法，從而合成、擴增與FOXB2 mRNA或其中的一部分區域互補的單鏈DNA(cDNA)。并且通過檢測所述擴增產物(cDNA)的有無、多寡(量)，能夠檢測細胞中FOXB2 mRNA的存在、量。
作為上述使用的擴增用引物，例如，作為檢測人的FOXB2 mRNA時使用的擴增引物，可舉出例如具有由序列號4表示的堿基序列的引物。作為檢測小鼠的Foxb2 mRNA時的擴增引物，可舉出例如具有由序列號37表示的堿基序列的引物。
進而，以通過上述方法擴增的cDNA為模板，基于FOXB2 mRNA的堿基序列，使用以使FOXB2 mRNA的目標區域能夠擴增而制備的一對引物，按照常規方法進一步實施PCR法等核酸擴增反應，檢測擴增產物的有無、多寡(量)，即能夠更準確地檢測FOXB2 mRNA的存在、量。該擴增產物的檢測可通過檢測擴增產物的電泳法等常規方法進行。
以通過上述方法擴增的cDNA為模板來實施核酸擴增反應時，可通過實時擴增檢測法來進行。作為利用實時擴增檢測法的檢測法，例如，可舉出實時PCR檢測法。
作為實時PCR檢測法的例子，可舉出利用嵌入劑(例如，SYBRTM Green I)進行實時PCR的常規嵌入劑法、TaqManTM實時PCR法、MGB Eclipse探針系統(MGB Eclipse Probe System)法、分子信標熒光探針技術(Molecular Beacons Probe Technology)法、LUX熒光引物(LUX Fluorogenic Primer)法、淬滅探針PCR(Quenching probe-PCR(QP))法、循環探針(cycling probe)法等，但是，并不限于這些方法。
作為所述PCR(包括實時PCR。)中使用的“以使FOXB2 mRNA的目標區域能夠擴增的方式制備的一對引物”，可舉出對FOXB2 mRNA的堿基序列或其特定區域(部分序列)進行擴增的一對引物。
作為這樣的一對引物，例如，可舉出對人的FOXB2 mRNA(由序列號1表示的堿基序列)或其特定區域(部分區域)進行擴增的一對引物。具體而言，例如，以由序列號1表示的堿基序列中的第45～223位的長度為179bp的區域(序列號3)為目標序列時，可舉出具有由序列號9表示的堿基序列的引物以及具有由序列號10表示的堿基序列的引物這一對引物。
另外，例如，也可舉出對小鼠中Foxb2 mRNA(由序列號34表示的堿基序列)或其特定區域(部分序列)進行擴增的一對引物。具體而言，例如，以由序列號34表示的堿基序列中的第132～300位的長度為169bp的區域(序列號36)為目標序列時，可舉出具有由序列號45表示的堿基序列的引物以及具有由序列號46表示的堿基序列的引物這一對引物。
市面上銷售有各種FOXB2 mRNA擴增用引物，因此，也可使用這些市售的引物。
如果以采用RT-PCR法進行的人FOXB2 mRNA的檢測法為例詳細說明，則如下所述。
在從受檢細胞中提取的、經DNase處理的總RNA(Total RNA)500ng～10μg中加入1μL的1～10μM的FOXB2 mRNA的擴增引物(例如，具有序列號4的堿基序列的引物)，在65～80℃溫度條件下保溫2～5分鐘，然后，在用冰冷卻條件下，加入5×緩沖液4μL、2.5mM dNTPs 4μL、RNase抑制劑0.5μL(20U)、逆轉錄酶(ReverTra Ace)1μL(100U)，用蒸餾水將總量調節為20μL，進行混合，在37～50℃條件下保溫20～60分鐘，由此進行逆轉錄反應。然后，通過常規方法來回收得到的cDNA。
接著，將得到的cDNA 1μL、蒸餾水5μL、2×PCR緩沖液12.5μL、2mM dNTPs 4μL、DNA聚合酶(KOD FX Neo)0.5μL(0.5U)、1μL的5～10μM正向引物(例如，具有序列號9的堿基序列的引物)、1μL的5～10μM反向引物(例如，具有序列號10的堿基序列的引物)進行混合。接著，例如，進行94℃條件下2分鐘、98℃條件下10秒鐘→56℃條件下20秒鐘→68℃條件下30秒鐘的反應，進行28～30個循環左右。
PCR結束后，例如，利用電泳進行擴增產物的檢測、分析，從而檢測FOXB2 mRNA。
或者，回收cDNA后，使用嵌入劑(例如，SYBRTM Green I)以及例如與上述相同的正向引物和反向引物，將上述得到的cDNA用作模板，使用Taq DNA聚合酶等聚合酶進行實時PCR。并且，通過測定與擴增產物的擴增量相關地嵌入的嵌入劑的熒光強度，進行擴增產物的檢測、分析，從而檢測FOXB2 mRNA。
進而，可通過毛細管電泳法(J.Chromatogr.593 253－258(1992)、Anal.Chem.641926－1932(1992)，WO2007/027495等)、毛細管電泳芯片法進行以采用上述方法擴增而成的cDNA為模板實施核酸擴增反應后的擴增產物的檢測、分析。即，可以在回收cDNA后，使用例如由熒光物質等標記物質標記的引物、嵌入劑，使用檢測器對通過毛細管電泳芯片分離的標記PCR擴增產物來源的信號進行檢測。作為檢測器，可以使用示差折光檢測器、熒光檢測器、UV檢測器等設備，其中，優選UV檢測器、熒光檢測器，更優選熒光檢測器。例如，使用LiBASys(島津制作所(株)制造)等全自動免疫分析儀，能夠實時地進行從PCR至電泳為止的操作。
2)Northern印跡雜交法
作為通過Northern印跡雜交法來檢測FOXB2 mRNA的方法，例如，可舉出以下方法：將從受檢細胞提取、分離出的mRNA固定于適當的載體，將所述mRNA和具有與FOXB2 mRNA互補的堿基序列的標記探針(也稱作cDNA)進行雜交，檢測雜交的程度，由此，檢測受檢細胞的FOXB2 mRNA。其中使用的探針可以由FOXB2 mRNA整個堿基序列的互補序列構成，也可以由其中的一部分堿基序列構成。另外，也能夠在所述檢測法中使用將該探針固定化的微陣列、DNA芯片。
需要說明的是，在本發明的檢測FOXB2 mRNA的方法中所使用的試劑中，能夠使用通常在該領域中所使用的試劑類，例如，能夠使用不會抑制共存的試劑等的穩定性、不會阻礙PCR等核酸擴增反應、雜交反應的緩沖劑、穩定劑、防腐劑等。另外，對于所述試劑類的濃度而言，通常可以從本領域通常使用的濃度范圍內適當選擇。
如果例舉緩沖液的具體例子，例如，可舉出Tris緩沖液、磷酸緩沖液、弗羅那緩沖液(veronal buffer)、硼酸緩沖液、Good’s緩沖液等通常實施PCR等核酸擴增反應、雜交反應時使用的所有緩沖液。對所述緩沖液的pH也沒有特別的限定，但是，例如，可舉出5～9的范圍。
另外，根據需要，使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等)、根據酶選擇的基質(dNTP、rNTP等)、或者雙鏈嵌入劑(溴化乙錠，SYBRTM Green等)或FAM、TAMRA等標記檢測物質等。
需要說明的是，使用原位PCR法、原位雜交法時，能夠不破壞受檢細胞來進行FOXB2mRNA的檢測。
(2)對FOXB2蛋白質的表達進行檢測的方法
1)不破壞細胞而進行檢測的方法
FOXB2蛋白質是轉錄因子，因此，其存在于細胞核內。
不破壞細胞而對核內物質進行染色的技術正在被開發，因此，使用該技術，能夠不破壞細胞而檢測核內的FOXB2蛋白質。例如，使用含有Triton TM、NP-40、Tween 20TM、Saponin、Digitonin TM、Leucoperm TM等表面活性劑的緩沖液，使受檢細胞的核膜局部可溶化。由此，能夠不破壞細胞膜的結構而生成使抗體能夠通過的間隙，因此，接下來使用由熒光物質等標記的抗FOXB2抗體進行核蛋白質的染色，能夠檢測核內的FOXB2蛋白質。
另外，對核內物質進行染色的各種試劑也可商購獲得。因此，也可使用這些市售試劑對核內的FOXB2蛋白質進行染色，從而檢測FOXB2蛋白質的表達。
2)破壞細胞而檢測的方法
另外，也能夠使用以下破壞細胞的方法來檢測FOXB2蛋白質。
首先，對受檢細胞培養物實施過濾或離心分離等常規方法，收集菌體或細胞，使其懸浮于適當的緩沖液中，例如，采用表面活性劑處理、超聲波處理、溶菌酶處理、凍結-融化等方法對細胞等的細胞壁和/或細胞膜進行破壞后，使用離心分離、過濾等方法，得到含FOXB2蛋白質的提取液。
接著，可采用已知的檢測蛋白質的方法來對得到的提取液中的FOXB2蛋白質進行檢測。
作為對提取液中的FOXB2蛋白質進行檢測的方法，例如，除了使用對FOXB2蛋白質具有親和性的物質(例如抗體等)的所謂的酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、熒光免疫測定法(FIA)、Western免疫印跡(Western blot)法、免疫組織化學法、抗體陣列法、利用簡易免疫層析進行的測定法等已知的依據免疫學測定法的方法以外，還可舉出采用上述方法與高效液相色譜(HPLC)、電泳法、毛細管電泳法、毛細管電泳芯片法等的組合的方法等。作為其檢測原理，例如，可舉出夾心法、競爭法、雙抗體法等，但是，并不限于這些方法。對于這些測定法的具有條件而言，可由本領域技術人員進行適當設定。
另外，例如，可采用根據免疫散射比濁法、免疫透射比濁法等免疫凝集法的測定法來檢測FOXB2蛋白質。所述檢測法還可以根據公知的方法來進行。
上述1)及2)的方法中，對于用于檢測FOXB2蛋白質的針對FOXB2蛋白質的抗體(抗FOXB2抗體)而言，只要是能識別FOXB2蛋白質、該蛋白質中的一部分肽、或它們的鹽的抗體即可，沒有特別的限定。
例如，可以是多克隆抗體、單克隆抗體中的任意一種，可以任意單獨地使用或適當地組合它們來使用。另外，對于這些抗體而言，如果需要，可以使用胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等酶進行消化來用作F(ab')2、Fab'或Fab。進而，也能夠使用針對FOXB2蛋白質的市售的抗體。
該抗體可以由標記物質進行標記。作為用于標記的標記物質，可舉出以下述物質為代表的具有作為自旋標記劑的性質的物質：例如用于EIA(ELISA)的堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、過氧化物酶、微過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、膽堿酯酶、蘋果酸脫氫酶、熒光素酶等酶類；例如用于RIA的99mTc、131I、125I、14C、3H等放射性同位素；例如用于FIA的熒光素、丹磺酰、熒光胺、香豆素、萘胺或它們的衍生物等熒光性物質；例如螢光素、異魯米諾、魯米諾、雙(2,4,6-三氯苯基)草酸酯等發光性物質；例如苯酚、萘酚、蒽或它們的衍生物等在紫外部分具有吸收的物質；例如具有4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷基-1-氧基、2,6-二-叔丁基-α-(3,5-二-叔丁基-4-氧代-2,5-環己二烯-1-亞基)-對甲苯氧基等氧基的化合物等。
作為針對FOXB2蛋白質的抗體的具體例子，例如，可舉出“針對具有由序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質的抗體”、“針對具有由序列號35表示的氨基酸序列的蛋白質的抗體”等。
另外，用于檢測上述FOXB2蛋白質的試劑及其檢測時的濃度、實施檢測時的測定條件等(反應溫度、反應時間、反應時的pH、測定波長、測定裝置等)全部可以根據已知的如上所述的免疫學測定法的測定操作法進行設定，能無例外地使用通常在該領域中使用的全自動分析裝置、分光光度計。
＜I-2.細胞分化狀態的判定方法＞
通過上述方法對干細胞的FOXB2基因的表達進行檢測，并基于得到的結果對受檢細胞的分化狀態進行判定。
本發明中，“已分化的/經分化的”或“已分化的狀態”包括細胞處于“分化的初始階段”的狀態、“已獲得未來進行分化的分化能力的(經分化誘導的)”狀態以及“經分化的”狀態中的任意狀態的情況。
優選的是，本發明中，“已分化的/經分化的”或者“已分化的狀態”是細胞處于“分化的初始階段”的狀態或者“已獲得未來進行分化的分化能力的(經分化誘導的)”狀態中的任意狀態的情況。
本發明中，“分化的初始階段”是指分化誘導處理后的早期，具體而言，是指從分化誘導處理開始至第7天為止、優選至第6天為止、更優選至第3～5天為止的時期。
或者，本發明中，“分化的初始階段”包括未分化干細胞分化為三胚層中的任意胚層前的階段以及分化誘導處理后未分化標記(例如OCT3/4、NANOG、SOX2等)消失前的階段。
作為本發明的分化狀態的判定方法，例如，可舉出下述方法。
(1)基于FOXB2 mRNA的表達的檢測結果進行判定的方法
作為基于FOXB2 mRNA的檢測結果進行判定的方法，例如，可舉出下述方法。
1)通過上述方法對受檢細胞中FOXB2 mRNA進行檢測，在檢測出FOXB2 mRNA的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
2)對受檢細胞的FOXB2 mRNA進行檢測，并且使用已確認為未分化狀態的未分化干細胞作為對比，同樣地對FOXB2 mRNA進行檢測。而且，在受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量多于作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2 mRNA的檢測量的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。此時，關于受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量與作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2 mRNA的檢測量相比是否更多，可比較這兩者來相對地進行判斷。
3)關于受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量與作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2mRNA檢測量相比是否更多的判斷，可通過比較受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量和預先已測定的未分化干細胞的FOXB2 mRNA的檢測量來實施。而且，在受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量比預先已測定的未分化干細胞的FOXB2 mRNA的檢測量更多的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
4)可以預先設定能判斷受檢細胞是否處于已分化狀態的邊界值(截止值)，通過判斷受檢細胞的FOXB2 mRNA檢測量是否高于該邊界值來判斷受檢細胞的分化狀態。在此情況下，受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量高于截止值時，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
(2)基于FOXB2蛋白質的檢測結果進行判定的方法
作為基于FOXB2蛋白質的檢測結果進行判定的方法，例如，可舉出下述方法。
1)通過上述方法對受檢細胞中的FOXB2蛋白質進行檢測，在檢測出FOXB2蛋白質的情況下，判定所述細胞處于已分化的狀態。
2)對受檢細胞的FOXB2蛋白質進行檢測，并且使用已確認為未分化狀態的未分化干細胞作為對比，同樣地對FOXB2蛋白質進行檢測。而且，在受檢細胞的FOXB2蛋白質的檢測量多于作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2蛋白質的檢測量的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。此時，關于受檢細胞的FOXB2蛋白質的檢測量與作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2蛋白質的檢測量相比是否更多，可比較這兩者來相對地進行判斷。
3)關于受檢細胞的FOXB2蛋白質的檢測量與作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2蛋白質檢測量相比是否更多的判斷，可通過比較受檢細胞的FOXB2蛋白質的檢測量和預先已測定的未分化干細胞的FOXB2蛋白質的檢測量來實施。而且，在受檢細胞的FOXB2蛋白質的檢測量比預先已測定的未分化干細胞的FOXB2蛋白質的檢測量更多的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
4)進一步地，可以預先設定能判斷受檢細胞是否處于已分化的狀態的邊界值(截止值)，通過判斷受檢細胞的FOXB2蛋白質檢測量是否高于該邊界值來判斷受檢細胞的分化狀態。在此情況下，在受檢細胞的FOXB2蛋白質的檢測量高于截止值的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
為了實施本發明的細胞分化狀態的判定方法，具體而言，例如，可實施下述方法。
通過公知方法對iPS細胞或ES細胞等未分化干細胞(受檢細胞)進行分化誘導處理。接著，在進行分化誘導處理后，以上限為7天以內、優選為6天以內、更優選為5天以內且下限為1天以上、優選為2天以上、更優選為3天以上進行培養后，采集細胞，通過上述方法檢測FOXB2基因的表達(FOXB2 mRNA的表達或FOXB2蛋白質的表達)。并且，在確認了FOXB2基因的表達的情況下，判定所述細胞處于已分化的狀態(包括“所述細胞群中存在處于已分化狀態的細胞”的情況。下同。)。
或者，對受檢細胞的FOXB2基因的表達進行檢測(FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白質的檢測)，并且使用已確認為未分化狀態的未分化干細胞作為對比，同樣地對FOXB2基因表達進行檢測。并且，在受檢細胞的FOXB2基因表達的檢測量(FOXB2 mRNA的表達量或FOXB2蛋白質的表達量)多于作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2基因表達的檢測量的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
另外，將預先測定的未分化干細胞的FOXB2基因表達的檢測量(FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白質的檢測量)與受檢細胞的FOXB2基因表達的檢測量進行比較，在受檢細胞的FOXB2基因表達的檢測量比作為對比對象的未分化干細胞的FOXB2基因表達的檢測量更多的情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
進一步地，預先設定能判斷受檢細胞是否處于已分化的狀態的邊界值(截止值)，在受檢細胞的FOXB2 mRNA的檢測量或FOXB2蛋白質的檢測量高于該邊界值得情況下，判定所述受檢細胞處于已分化的狀態。
此外，對于未進行分化誘導處理的未分化干細胞，如果實施本發明的分化狀態的判定方法，能夠確認所述未分化干細胞是否維持未分化狀態。
(3)本發明的應用
本發明的細胞分化狀態的判定方法還能夠應用于下述方法中。
1)在細胞篩選方法中的應用
針對含有某種細胞群的試樣，采用本發明的方法對構成細胞群的細胞的FOXB2mRNA進行檢測。并且，在檢測到FOXB2 mRNA的情況下，判定所述試樣中存在處于已分化狀態的細胞(“已分化的狀態”的含義與上述相同。下同。)，在未檢測到FOXB2 mRNA的情況下，則判定所述試樣中不存在處于已分化狀態的細胞。或者，在對FOXB2蛋白質的表達進行檢測并檢測到FOXB2蛋白質的情況下，判定所述試樣中存在處于已分化狀態的細胞，而在未檢測到FOXB2蛋白質的情況下，判定所述試樣中不存在處于已分化狀態的細胞。
2)在干細胞的品質管理中的應用
對于實施了公知的分化誘導處理的干細胞，通過采用本發明的方法來檢測FOXB2基因的表達(檢測FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白質)，能夠判斷該細胞是處于已分化狀態還是處于混入有未分化干細胞的狀態。因此，本發明的方法能夠用于分化細胞的品質管理。
另外，對于實施了維持未分化狀態的處理的干細胞，通過采用本發明的方法來檢測FOXB2基因的表達(檢測FOXB2 mRNA或FOXB2蛋白質)，能夠確認該細胞是否維持未分化狀態。因此，本發明的方法能夠用于未分化干細胞的品質管理。
3)在培養基的品質檢查方法中的應用
為了對未分化干細胞在維持其未分化狀態的同時進行培養，需要其培養基是例如不含有分化誘導因子且能夠維持未分化細胞的未分化狀態并進行培養的培養基。如果使用本發明的分化狀態的判定方法，能夠對這種培養基進行品質檢查。
例如，將未分化干細胞在作為判定對象的培養基中培養幾天，例如，培養3～7天左右，通常培養5～6天左右，然后，對細胞中FOXB2 mRNA的表達進行檢測，在未檢測到FOXB2mRNA的情況下，能夠判定該培養基是能夠一邊維持干細胞的未分化狀態一邊進行培養的培養基。或者，對培養后的該細胞中的FOXB2蛋白質的表達進行檢測，在未檢測到FOXB2蛋白質的情況下，能夠判定該培養基是能夠一邊維持干細胞的未分化狀態一邊進行培養的培養基。
4)在分化細胞的制備、分離方法中的應用
應用本發明的方法，能夠對分化細胞進行制備、分離。
例如，在上述“(2)對FOXB2蛋白質的表達進行檢測的方法”中記載的“1)不破壞細胞而進行檢測的方法”中，使由標記物質標記的抗FOXB2蛋白質抗體與含有或預測含有處于已分化狀態的細胞的細胞進行反應后，采用流式細胞儀等方法僅對由熒光標記的細胞進行分離、純化，從而能夠制備、分離處于已分化狀態的細胞。
進一步地，通過與上述相同的方法，通過流式細胞儀等方法僅對未進行熒光標記的細胞進行分離、純化，從而能夠制備、分離未分化干細胞。
5)在分化誘導因子的篩選方法中的應用
能夠將本發明應用在確認某種物質是否具有未分化干細胞的分化誘導能力的方法中。
例如，將未分化干細胞在含有受檢物質的培養基中培養幾天，例如，培養3～7天后，通常培養5～6天左右后，在對培養細胞的FOXB2 mRNA的表達進行檢測并檢測到FOXB2mRNA的情況下，確認受檢物質誘導未分化干細胞的分化。或者，在對該培養細胞的FOXB2蛋白質的表達進行檢測并檢測到FOXB2蛋白質的情況下，確認受檢物質誘導未分化干細胞的分化。
＜II.本發明的分化標記＞
作為本發明的分化標記，可舉出“選自FOXB2基因來源的mRNA或蛋白質中的分化標記”。具體而言，本發明的分化標記是干細胞的分化標記。干細胞的具體示例如上所述。
作為“FOXB2基因來源的mRNA或蛋白質”，可舉出上述本發明的FOXB2 mRNA及FOXB2蛋白質。其具體示例如上所述。
更具體而言，例如，可舉出選自下述(i)～(vii)的分化標記。
(i)具有由序列號1或序列號34表示的堿基序列的mRNA
(ii)具有與由序列號1或序列號34表示的堿基序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的堿基序列的mRNA
(iii)對由序列號2或序列號35表示的氨基酸序列進行編碼的mRNA
(iv)對由序列號2或序列號35表示的氨基酸序列經1個～多個、優選為1～5個、更優選為1～3個氨基酸的缺失、插入、取代或添加而形成的氨基酸序列進行編碼的mRNA
(v)與由序列號2或序列號35表示的氨基酸序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的氨基酸序列進行編碼的mRNA
(vi)具有由序列號2或序列號35表示的氨基酸序列或者該氨基酸序列經1個或多個、優選1～5個、更優選1～3個氨基酸的缺失、插入、取代或添加而成的氨基酸序列的蛋白質
(vii)具有與由序列號2或序列號35表示的氨基酸序列具有70％、優選為80％、更優選為95％、進一步更優選為97％以上的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質。
＜III.本發明的分化狀態判定用試劑盒＞
作為本發明的細胞分化狀態判定用試劑盒，可舉出具有對FOXB2基因的表達進行檢測的試劑的試劑盒，或者具有對FOXB2基因的表達量進行測定的試劑的試劑盒。
例如，可舉出下述試劑盒。
(a)具有用于檢測FOXB2 mRNA的表達或用于測定其表達量的引物或者它們的標記物的試劑盒
(b)具有用于檢測FOXB2蛋白質的表達或用于測定其表達量的針對FOXB2蛋白質的抗體(即，識別FOXB2蛋白質的抗體，優選與FOXB2蛋白質特異性結合的抗體)或者該抗體的標記物等的試劑盒。
構成上述試劑盒的構成試劑的優選形式以及具體示例如上所述。
作為上述(a)的“用于檢測FOXB2 mRNA的表達或者用于測定其表達量的引物”的示例，例如，可舉出“用于檢測由序列號1或序列號34表示的堿基序列或其部分序列的引物”。
更具體而言，例如，可舉出
(a-1)以通過逆轉錄反應得到的cDNA為模板進行PCR時所使用的一對引物，或者
(a-2)用于逆轉錄反應的擴增引物以及以通過逆轉錄反應得到的cDNA為模板進行PCR時所使用的一對引物的組合。
對于構成(a-1)的一對引物的引物而言，至少其中的一者可根據需要被標記物質所標記。
作為(a-1)的一對引物的具體示例，可舉出“具有由序列號9表示的堿基序列的引物與具有由序列號10表示的堿基序列的引物這一對引物”或者“具有由序列號45表示的堿基序列的引物以及具有由序列號46表示的堿基序列的引物這一對引物”。
作為(a-2)的具體示例，可舉出“由序列號4表示的引物以及下述一對引物的組合：具有由序列號9表示的堿基序列的引物和具有由序列號10表示的堿基序列的引物這一對引物”或者“由序列號37表示的引物以及下述一對引物的組合：具有由序列號45表示的堿基序列的引物和具有由序列號46表示的堿基序列的引物這一對引物”。
上述(b)中的“用于檢測FOXB2蛋白質的表達或者用于測定其表達量的針對FOXB2蛋白質的抗體”的具體示例如上所述。
例如，可舉出“針對具有由序列號2或序列號35表示的氨基酸序列的蛋白質的抗體”。
含有上述(a-1)或(a-2)作為構成要件的試劑盒中，還可以含有用于RT-PCR法的逆轉錄酶、根據需要進一步選擇的核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶等)、根據酶而選擇的底物(dNTP、rNTP等)以及雙鏈嵌入劑(SYBRTM Green、溴化乙錠等)或FAM、TAMRA等標記檢測物質等。
另外，含有上述(a-1)或(a-2)作為構成要件的試劑盒中，例如，可以含有不會抑制共存試劑等的穩定性且不會妨礙PCR、雜交反應的緩沖劑、穩定劑、防腐劑等。另外，對于它們的濃度而言，通常可以從該領域中通常使用的濃度范圍中適當地進行選擇。
如果例舉緩沖液的具體示例，可舉出Tris緩沖液、磷酸緩沖液、弗羅那緩沖液(veronal buffer)、硼酸緩沖液、Good’s緩沖液等通常實施PCR、雜交反應時使用的所有緩沖液。對所述緩沖液的pH也沒有特別的限定，但是，例如，可舉出5～9的范圍。
在含有上述(b)作為構成要件的試劑盒所含的試劑中，可以包括不會抑制共存試劑的穩定性、不會阻礙抗原抗體反應的該領域中通常使用的試劑類，例如，緩沖劑、敏化劑、表面活性劑、防腐劑(例如，疊氮化鈉、水楊酸、苯甲酸等)、穩定劑(例如，白蛋白、球蛋白、水溶性明膠、表面活性劑、糖類等)、激活劑、避免對共存物質產生影響的試劑及其他在該領域中通常所使用的試劑類。另外，對于所述試劑類等的濃度范圍等，可以適當地選擇通常用于已知的該測定方法中的濃度范圍等來使用。緩沖液等的具體示例、緩沖液的pH及濃度如上所示。
另外，對于本發明的細胞分化狀態判定用試劑盒中所含的(a-1)、(a-2)(b-1)等而言，可以是懸浮于適當緩沖液而成的懸浮液等處于溶液狀態的物品，或者，也可以是冷凍而成的冷凍品、冷凍干燥而成的冷凍干燥品。對于用于所述目的的緩沖液等的具體示例、緩沖液的pH及濃度如上所述。
進而，本發明的試劑盒中，還包括在用于對本發明的干細胞的FOXB2基因的表達(例如，FOXB2 mRNA的表達或者FOXB2蛋白質的表達)進行檢測的方法中使用的說明書或者用于實施本發明的判定細胞分化狀態的方法的說明書等。該“說明書”是指該方法的特征、原理、操作步驟、判定步驟等通過文章或圖表等形式來實質記載的該試劑盒的操作說明書、附加文檔、或者手冊(散頁印刷品)等。
下面，列舉實施例進一步具體說明本發明，但是本發明并不受到這些實施例的任何限定。
實施例
實施例1.
通過RT-PCR法，對經分化誘導處理的hiPS細胞檢測FOXB2 mRNA及公知的未分化標記的表達。
(1)干細胞的培養及分化誘導處理
使用添加或未添加bFGF(100ng/mL)的培養基(人多能干細胞培養基，StemSure hPSC Medium，和光純藥工業(株)制)，對hiPS細胞(201B7株，京都大學iPS細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式會社))以及作為對比的、作為已分化的細胞的HDF細胞(來自正常人體細胞的成纖維細胞，龍沙公司(ロンザジャパン)(株)制造)進行三次傳代培養，在培養的第5天回收細胞。
(2)總RNA的提取
使用作為市售的核酸提取試劑的試劑盒ISOGEN(日本基因(ニッポンジーン)制)，根據實物說明書，從上述(1)中回收的細胞中提取總RNA。
(3)DNase處理
在上述(2)中提取的總RNA 1μg中，加入蒸餾水，使總量成為17μL，加入10X反應緩沖液(普洛麥格公司(プロメガ)(株)制造)2μL、RQ1無RNA酶活性的脫氧核糖核酸酶(RQ1RNase-Free DNase)(普洛麥格公司(株)制造)1μL(1U)并進行混合，在37℃溫度條件下孵育20分鐘。然后，添加停止緩沖液(20mM EGTA)(普洛麥格公司(株)制造)1μL并進行混合，在65℃溫度條件下孵育10分鐘。然后，在反應物中添加結合緩沖液(5.5M胍鹽酸鹽(和光純藥工業(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6)100μL進行混合，然后，將其轉移至Econospin(核酸純化用硅膠膜離心柱，基因設計公司((株)ジーンデザイン)制)中，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管中的溶液。接著，在離心管中添加洗滌緩沖液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司)、80％乙醇(和光純藥工業(株)制))500μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。進而，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，然后，將Econospin(結合有mRNA)更換為新的離心管，添加洗脫緩沖液(10mMTris-HCl pH8.0)(日本基因公司)50μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，回收總RNA。然后，進行乙醇沉淀，將得到的沉淀物溶解于9.5μL蒸餾水中。
(4)逆轉錄反應
在9.5μL上述(3)中的經DNase處理的總RNA中，添加1μL混合引物(各5μM)，該混合引物含有以下述各mRNA為目標的擴增引物。下述引物均為西格瑪奧德里奇(シグマアルドリッチ)公司制造。
·FOXB2 mRNA的擴增引物：CAGAAGCTACCCTTGCCAG(序列號4，GenBank Accession No.NM_001013735:242-260(相當于GenBank Accession No.NM_001013735的堿基序列中第242-260號的堿基序列的互補鏈的堿基序列。下同。))；
·OCT3/4 mRNA的擴增引物：GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(序列號5，GenBank Accession No.NM_002701:641-661)；
·NANOG mRNA的擴增引物：GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(序列號6，GenBank Accession No.NM_024865:631-651)；
·SOX2 mRNA的擴增引物：GACCACACCATGAAGGCATTC(序列號7，GenBank Accession No.NM_003106:572-592)；
·GAPDH mRNA的擴增引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGG(序列號8，GenBank Accession No.NM_002046:1303-1323)
(GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。
將各個混合物在72℃溫度孵育3分鐘后，立即進行冰冷處理。接著，加入5×緩沖液(東洋紡(株)制)4μL、2.5mM dNTPs(日本基因公司制)4μL、RNase抑制劑(特級)(和光純藥工業(株)制)0.5μL(20U)、ReverTra Ace(東洋紡(株)制)1μL(100U)進行混合，在42℃溫度孵育50分鐘。然后，加入結合緩沖液(5.5M胍鹽酸鹽(和光純藥工業(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6(和光純藥工業(株)制))100μL進行混合，轉移至Econospin(核酸純化用硅膠膜離心柱，基因設計公司制)中，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。然后，添加洗滌緩沖液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光純藥工業(株)制))500μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。然后，進一步地，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離后，更換為新的離心管，添加洗脫緩沖液(10mMTris-HCl pH8.5)(日本基因公司制)25μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，使得到的沉淀物溶解于1μL蒸餾水中，回收cDNA。
需要說明的是，為了確認本實驗體系中未混入基因組DNA，使用相同的試樣，除了不添加RTase(ReverTra Ace(東洋紡(株)制)，逆轉錄酶)以外，進行與上述相同的反應。
(5)PCR反應
將上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸餾水5μL、KOD FX Neo(東洋紡)用2×PCR緩沖液12.5μL、2mM dNTPs(東洋紡)4μL、KOD FX Neo(東洋紡)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL進行混合。
使用的各引物的堿基序列如下所述。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735:45-67、201-223
正向引物:CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(序列號9)
反向引物:GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(序列號10)
擴增鏈長:179bp
※序列號9的正向引物與序列號10的反向引物分別基于FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735的第45-67位的堿基序列以及第201-223位的堿基序列進行設計。下同。
由此，通過使用所述一對引物的核酸擴增反應，FOXB2基因(由序列號1表示的堿基序列)的第45～223位共計179bp的區域(序列號3)(GenBank Accession No.NM_001013735.1的第45-223位)得以擴增。
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_002701:340-361、515-535
正向引物:CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(序列號11)
反向引物:CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(序列號12)
擴增鏈長:196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No.NM_024865:284-305、528-550
正向引物:CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(序列號13)
反向引物:CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(序列號14)
擴增鏈長:267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_003106:31-54、443-464
正向引物:GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(序列號15)
反向引物:CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(序列號16)
擴增鏈長:434bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No.NM_002046:240-260、618-638
正向引物:GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(序列號17)
反向引物:GGCATTGCTGATGATCTTGAG(序列號18)
擴增鏈長:399bp
將各混合物置于熱循環儀中，以94℃2分鐘、98℃10秒鐘→56℃20秒鐘→68℃30秒鐘的方式使OCT3/4 cDNA、NANOG cDNA、SOX2 cDNA及FOXB2 cDNA進行擴增時，進行28個循環，以所述同樣方式使GAPDH cDNA進行擴增時，進行20個循環，然后，在68℃溫度條件下進行2分鐘的反應。
(6)電泳
將上述(5)中得到的PCR擴增產物5μL與6×上樣緩沖液雙色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL進行混合，使用1.5％瓊脂糖凝膠對其進行電泳。使用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業(株)制)進行染色。
需要說明的是，對于上述(4)中不添加RTase進行反應而得到的反應物，進行上述(5)～(6)的處理。
(7)結果
將結果一并示于圖1中。
由圖1的結果可知，作為通常已被確認的未分化標記的OCT3/4 mRNA(圖1(3))、NANOG mRNA(圖1(4))及SOX2 mRNA(圖1(5))，在維持未分化、多能性的狀態的hiPS細胞(hiPS/bFGF(+)/RTase(+)的情況)中進行了表達。還確認了它們在分化誘導處理后第5天的hiPS細胞(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情況)中仍然進行表達(確認了電泳條帶)。然而，OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及SOX2 mRNA在作為已分化的細胞的HDF細胞中未進行表達。
另一方面，確認了FOXB2 mRNA(圖1(1))在分化誘導處理后第5天的hiPS細胞(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情況)中進行表達(確認了電泳帶)。然而，FOXB2 mRNA在維持未分化、多能性的狀態的hiPS細胞(hiPS/bFGF(+)/RTase(+)的情況)以及作為已分化的細胞(特別是分化已完成的細胞)的HDF細胞中未進行表達。
需要說明的是，在全部mRNA的檢測結果中，在RTase(-)的情況下未確認到電泳條帶，由此，確認了在本實驗體系中未混入基因組DNA。
另外，參見GAPDH mRNA的檢測結果(圖1(2))，在“hiPS/bFGF(+)/RTase(+)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(+)”、“HDF/RTase(+)”的情況下確認了電泳條帶，而在“hiPS/bFGF(+)/RTase(-)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(-)”、“DF/RTase(-)”的情況下未確認到電泳條帶。由此，確認了在本實驗體系中mRNA未分解。
因此，可知FOXB2 mRNA作為分化標記很有用，通過對FOXB2 mRNA進行檢測，能夠判定細胞的分化狀態。另外，即使在通常所測定的未分化標記(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表達未被檢測到變化的階段也檢測到了FOXB2 mRNA的顯著表達，因此，可知與現有的未分化標記相比，在分化的初始階段，FOXB2 mRNA更能夠判定細胞的分化狀態。
實施例2.
(1)干細胞的培養及分化誘導處理
使用添加或未添加bFGF的培養基(人多能干細胞培養基，StemSure hPSC Medium，和光純藥工業(株)制)對hiPS細胞(201B7株，京都大學iPS細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式會社))進行培養，在培養的第3天、第5天、第7天回收細胞。
另外，使用MEM培養基(+10％FBS)(和光純藥工業(株)制)，對作為對比且作為已分化的細胞的HDF細胞(來自于人正常細胞的成纖維細胞，龍沙公司制造)進行培養，在培養的第7天回收細胞。
(2)總RNA的提取
通過與實施例1(2)相同的方法，從上述(1)中回收的培養的第3天、第5天、第7天的細胞中分別提取總RNA。
另外，使用HMSC-bm細胞(人骨髓來源間充質干細胞)的總RNA(美國ScienCell研究實驗室(ScienCell Research Laboratories)制)作為對比。
(3)DNase處理
采用與實施例1(3)中相同的方法，分別對在上述(2)中提取的總RNA及HMSC-bm細胞的總RNA 1μg進行DNAase處理。
(4)逆轉錄反應
在上述(3)中經DNase處理的總RNA 9.5μL中，加入含有下述引物的混合引物(各5μM)1μL。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
·FOXB2 mRNA的擴增引物：CAGAAGCTACCCTTGCCAG(序列號4，GenBank Accession No.NM_001013735:242-260)；
·OCT3/4 mRNA的擴增引物：GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(序列號5，GenBank Accession No.NM_002701:641-661)；
·NANOG mRNA的擴增引物：GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(序列號6，GenBank Accession No.NM_024865:631-651)；
·SOX2 mRNA的擴增引物：GACCACACCATGAAGGCATTC(序列號7，GenBank Accession No.NM_003106:572-592)；
·GAPDH mRNA的擴增引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGG(序列號8，GenBank Accession No.NM_002046:1303-1323)，
對于各混合物，采用與實施例1(4)相同的方法進行逆轉錄反應，分別回收cDNA。
(5)PCR反應
將上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸餾水5μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)制)用2×PCR緩沖液12.5μL、2mM dNTPs(東洋紡(株)制)4μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)制)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL進行混合。
使用的各引物的堿基序列如下所述。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735:45-67、201-223
正向引物:CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(序列號9)
反向引物:GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(序列號10)
擴增鏈長:179bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_002701:340-361、515-535
正向引物:CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(序列號11)
反向引物:CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(序列號12)
擴增鏈長:196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No.NM_024865:284-305、528-550
正向引物:CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(序列號13)
反向引物:CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(序列號14)
擴增鏈長:267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_003106:31-54、443-464
正向引物:GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(序列號15)
反向引物:CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(序列號16)
擴增鏈長:434bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No.NM_002046:240-260、618-638
正向引物:GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(序列號17)
反向引物:GGCATTGCTGATGATCTTGAG(序列號18)
擴增鏈長:399bp
將各混合物置于熱循環儀中，以94℃2分鐘、98℃10秒鐘→56℃20秒鐘→68℃30秒鐘的方式使OCT3/4 cDNA、NANOG cDNA、SOX2 cDNA及FOXB2 cDNA進行擴增時，進行28個循環，以所述同樣的方式使GAPDH cDNA進行擴增時，進行20個循環，然后，在68℃溫度條件下反應2分鐘。
(6)電泳
將PCR擴增產物5μL與6×上樣緩沖液雙色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL進行混合，使用1.5％瓊脂糖凝膠對其進行電泳。使用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業(株)制)進行染色。
需要說明的是，對于上述(4)中不添加RTase進行反應而得到的反應物，進行上述(5)～(6)的處理。
(7)結果
將結果一并示于圖2中。
由圖2的結果可知，使用未添加bFGF的培養基對hiPS細胞進行培養并進行分化誘導處理時，隨著培養期間的增長，FOXB2 mRNA的表達量成比例地增加。
相對于此，確認了即使使用未添加bFGF的培養基進行培養并進行分化誘導處理，截止至分化誘導處理后第7天為止，FOXB2 mRNA以外的公知未分化標記(OCT3/4 mRNA,NANOG mRNA,SOX2 mRNA,GAPDH mRNA)仍然未消失而進行表達。
另一方面，即使使用未添加bFGF的培養基對HMSC-bm(人骨髓來源間充質干細胞)進行培養，也沒有確認到FOXB2 mRNA的表達，也沒有確認到公知的未分化標記(OCT3/4mRNA,NANOG mRNA,SOX2 mRNA,GAPDH mRNA)的表達。HMSC-bm是由干細胞(RS細胞)經中胚層而形成的體干細胞。由此，可推測如果未分化干細胞的分化進展至所述程度，則FOXB2 mRNA不再表達，換言之，FOXB2 mRNA在細胞分化的初始階段特異性地表達。
另外，在培養第5天的HDF細胞中沒有確認到FOXB2 mRNA的表達，也沒有確認到公知的未分化標記(OCT3/4 mRNA,NANOG mRNA,SOX2 mRNA,GAPDH mRNA)的表達。
需要說明的是，在全部mRNA的檢測結果中，在RTase(-)的情況下未確認到電泳條帶，因此，確認了本實驗體系中未混入基因組DNA。另外，在RTase(+)的全部情況下GAPDHmRNA都被檢測到，因此，確認了在本實驗體系中mRNA未分解，能夠準確地檢測mRNA的表達。
根據上述結果可知，相比于通常所測定的未分化標記(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表達的改變被檢測出的時期，FOXB2 mRNA的表達更早地得以檢測。由此可知，FOXB2 mRNA作為細胞分化的初始階段的分化標記特別有用，換言之，通過檢測FOXB2 mRNA的表達，能夠在分化的初始階段判定細胞的分化狀態。
實施例3.
(1)干細胞的培養及分化誘導處理
使用添加bFGF(100ng/mL)或未添加bFGF的培養基(人多能干細胞培養基，StemSure hPSC Medium，和光純藥工業(株)制)對hiPS細胞(201B7株，京都大學iPS細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式會社))以及作為對比且作為已分化的細胞的HDF細胞(來自于正常人體細胞的成纖維細胞，龍沙公司制造)進行三次傳代培養，在培養的第6天回收細胞。
(2)總RNA的提取
使用作為市售的核酸提取試劑的試劑盒ISOGEN(日本基因公司制)，根據實物說明書，從上述(1)中回收的細胞中提取總RNA。
(3)DNase處理
使用與實施例1(3)中相同的方法，分別對上述(2)中提取的總RNA 1μg進行DNase處理。
(4)逆轉錄反應
在上述(3)中經DNase處理的總RNA 9.5μL中，添加混合引物(各5μM)1μL，該混合引物含有以下述各mRNA為目標的擴增引物。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
·FOXB2 mRNA的擴增引物：CAGAAGCTACCCTTGCCAG(序列號4，GenBank Accession No.NM_001013735:242-260)
·OCT3/4 mRNA的擴增引物：GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(序列號5，GenBank Accession No.NM_002701:641-661)
·NANOG mRNA的擴增引物：GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(序列號6，GenBank Accession No.NM_024865:631-651)
·SOX2 mRNA的擴增引物：GACCACACCATGAAGGCATTC(序列號7，GenBank Accession No.NM_003106:572-592)
·FGF5 mRNA的擴增引物：CTCCCTGAACTTGCAGTCATC(序列號19，GenBank Accession No.NM_004464:709-729)
·CDX2 mRNA的擴增引物：CCTGAGGAGTCTAGCAGAGTC(序列號20，GenBank Accession No.NM_001265:1359-1379)
·GATA4 mRNA的擴增引物：GATTACGCAGTGATTATGTCCC(序列號21，GenBank Accession No.NM_001308094:1110-1131)
·GATA6 mRNA的擴增引物：CATCTTGACCCGAATACTTGAG(序列號22，GenBank Accession No.NM_005257:1961-1982)
·SOX17 mRNA的擴增引物：CCCAGGAGTCTGAGGATTTCC(序列號23，GenBank Accession No.NM_022454:1515-1535)
·GAPDH mRNA的擴增引物：GTCTACATGGCAACTGTGAGG(序列號8，GenBank Accession No.NM_002046:1303-1323)
將各混合物在72℃溫度孵育3分鐘后，立即進行冰冷處理。接著，加入5×緩沖液(東洋紡(株)制)4μL、2.5mM dNTPs(日本基因公司制)4μL、RNase抑制劑(特級)(和光純藥工業(株)制)0.5μL(20U)、ReverTra Ace(東洋紡(株)制)1μL(100U)進行混合，在42℃溫度孵育50分鐘。然后，加入結合緩沖液(5.5M胍鹽酸鹽(和光純藥工業(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6(和光純藥工業(株)制))100μL并進行混合，轉移至Econospin(基因設計公司制)中，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。然后，添加洗滌緩沖液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光純藥工業(株)制)500μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。然后，進一步地在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，然后更換為新的離心管，添加洗脫緩沖液(10mMTris-HCl pH8.5)(日本基因公司制)25μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，使得到的沉淀物溶解于1μL的蒸餾水中，回收cDNA。
(5)PCR反應
將上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸餾水5μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)制)用2×PCR緩沖液12.5μL、2mM dNTPs(東洋紡(株)制)4μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)制)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL進行混合。
使用的各引物的堿基序列如下所述。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001013735:45-67、201-223
正向引物:CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(序列號9)
反向引物:GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(序列號10)
擴增鏈長:179bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_002701:340-361、515-535
正向引物:CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(序列號11)
反向引物:CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(序列號12)
擴增鏈長:196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No.NM_024865:284-305、528-550
正向引物:CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(序列號13)
反向引物:CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(序列號14)
擴增鏈長:267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_003106:31-54、443-464
正向引物:GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(序列號15)
反向引物:CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(序列號16)
擴增鏈長:434bp
FGF5 cDNA、GenBank Accession No.NM_004464:462-482、615-637
正向引物:GCAGAGCAGTTTCCAGTGGAG(序列號24)
反向引物:GTATTCCTACAATCCCCTGAGAC(序列號25)
擴增鏈長:176bp
CDX2 cDNA、GenBank Accession No.NM_001265:923-944、1176-1196
正向引物:CAAATATCGAGTGGTGTACACG(序列號26)
反向引物:GACACTTCTCAGAGGACCTGG(序列號27)
擴增鏈長:274bp
GATA4 cDNA、GenBank Accession No.NM_001308094:795-816、1020-1040
正向引物:CAGCTCCTTCAGGCAGTGAGAG(序列號28)
反向引物:CGGGAGACGCATAGCCTTGTG(序列號29)
擴增鏈長:246bp
GATA6 cDNA、GenBank Accession No.NM_005257:1682-1703、1842-1864
正向引物:GCTTGTGGACTCTACATGAAAC(序列號30)
反向引物:GCTGCAATCATCTGAGTTAGAAG(序列號31)
擴增鏈長:183bp
SOX17 cDNA GenBank Accession No.NM_022454:1286-1306、1490-1511
正向引物:CGGAATTTGAACAGTATCTGC(序列號32)
反向引物:GCTCCTCCAGGAAGTGTGTAAC(序列號33)
擴增鏈長:226bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No.NM_002046:240-260、618-638
正向引物:GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(序列號17)
反向引物:GGCATTGCTGATGATCTTGAG(序列號18)
擴增鏈長:399bp
將各混合物置于熱循環儀中，以94℃2分鐘、98℃10秒鐘→56℃20秒鐘→68℃30秒鐘的方式使OCT3/4 cDNA、NANOG cDNA及SOX2 cDNA進行擴增時，進行24個循環，以所述相同的方式使FOXB2 cDNA、FGF5 cDNA、GATA4 cDNA、GATA6 cDNA及SOX17 cDNA進行擴增時，進行28個循環，以所述相同的方式使GAPDH cDNA進行擴增時，進行20個循環，在68℃溫度反應2分鐘。
(6)電泳
將上述(5)中得到的PCR擴增產物5μL與6×上樣緩沖液雙色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL進行混合，用1.5％瓊脂糖凝膠對其進行電泳。用GelRed核酸凝膠染色液(和光純藥工業(株)制)進行染色。
需要說明的是，對于在上述(4)中不添加RTase進行反應而得到的反應物，進行上述(5)～(6)的處理。
(7)結果
將結果一并示于圖3中。
由圖3的結果可知，確認了在使用未添加bFGF的培養基對hiPS細胞進行培養并進行分化誘導的情況下，即使在分化誘導后(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情況)的第6天，作為未分化標記的OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及SOX2 mRNA仍然進行表達(確認了電泳條帶)。
另外，確認了作為公知的分化標記的FGF5 mRNA(外胚層分化標記)、CDX2 mRNA(外胚層分化標記)、GATA4 mRNA(內胚層分化標記)、GATA6 mRNA(內胚層分化標記)、SOX7 mRNA(內胚層分化標記)、SSEA-1 mRNA(分化標記)在分化誘導處理后第6天的hiPS細胞中仍未表達(未確認到電泳條帶)。
另一方面，確認了FOXB2 mRNA在分化誘導處理后第6天的hiPS細胞(hiPS/bFGF(-)/RTase(+)的情況)中進行表達(確認了電泳條帶)。
需要說明的是，在全部mRNA的檢測結果中，在RTase(-)的情況下未確認到電泳條帶，因此，確認了在實驗體體系中未混入基因組DNA。
另外，觀察GAPDH mRNA的檢測結果，在“hiPS/bFGF(+)/RTase(+)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(+)”、“HDF/RTase(+)”的情況下確認了電泳條帶，在“hiPS/bFGF(+)/RTase(-)”、“hiPS/bFGF(-)/RTase(-)”、“DF/RTase(-)”的情況下未確認到電泳條帶。由此，確認了本實驗體系中mRNA未進行分解。
因此，可知FOXB2 mRNA作為分化標記很有用，通過檢測FOXB2 mRNA，能夠判定細胞的分化狀態。另外，即使在通常的未分化標記(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表達的變化未被檢測出的階段，也檢測出了FOXB2 mRNA的顯著表達。
進一步可知，在已知作為目前最有前景的分化標記的FGF5 mRNA還未進行表達的階段，就檢測出FOXB2 mRNA的表達。即，FOXB2 mRNA能夠比現有的分化標記、未分化標記在分化的更早階段(初始階段)判定細胞的分化狀態。
根據上述內容，可知FOXB2 mRNA是相比于現有的分化/未分化標記更加極為有用的分化標記。另外，由于能夠在培養初始階段判定已分化的細胞，因此，在細胞的早期篩選、干細胞的品質管理等方面很有用，有望能夠縮短培養期間、降低培養基的成本等。
實施例4.
使用未添加LIF的培養基對小鼠ES細胞進行培養并進行分化誘導處理，通過RT-PCR法檢測FOXB2 mRNA及公知的未分化標記的表達。
(1)干細胞的培養及分化誘導處理
使用添加LIF(1000單位)或未添加LIF的培養基(StemSure DMEM、StemSure血清替代品、MEM非必需氨基酸溶液、L-谷氨酰胺溶液、StemSure2-巰基乙醇溶液，和光純藥工業(株)制)對mES細胞(D3株，ATCC，b723512)進行三次傳代培養，在培養的第3天、第5天、第7天回收細胞。
(2)總RNA的提取
使用作為市售的核酸提取試劑的試劑盒ISOGEN(日本基因公司制)，根據實物說明書，從上述(1)中回收的細胞中提取總RNA。
(3)DNase處理
在上述(2)中提取的總RNA 1μg中，加入蒸餾水，使總量成為17μL，加入10X反應緩沖液(普洛麥格公司制造)2μL、RQ1無RNA酶活性的脫氧核糖核酸酶(RQ1RNase-Free DNase)(普洛麥格公司制造)1μL(1U)并進行混合，在37℃溫度孵育20分鐘。然后，加入停止緩沖液(20mM EGTA)(普洛麥格公司制造)1μL進行混合，在65℃溫度孵育10分鐘。然后，在反應物中加入結合緩沖液(5.5M胍鹽酸鹽(和光純藥工業(株)制)，20mM Tris-HCl pH6.6)100μL進行混合后，轉移至Econospin(核酸純化用硅膠膜離心柱，日本基因公司制)中，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。接著，在離心管中，添加洗滌緩沖液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光純藥工業(株)制)500μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。進而，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離后，將Econospin(結合有mRNA)更換為新的離心管，添加洗脫緩沖液(10mMTris-HCl pH8.0)(日本基因公司制)50μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，回收總RNA。然后，進行乙醇沉淀，將得到的沉淀物溶解于9.5μL蒸餾水中。
(4)逆轉錄反應
在上述(3)中經DNase處理的總RNA 9.5μL中，加入混合引物(各5μM)1μL，該混合引物含有以下述各mRNA為目標的擴增引物。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
·Foxb2 mRNA的擴增引物：CATGATGAACTTGTAGATGTC(序列號37，GenBank Accession No.NM_008023:302-322)
·Oct3/4 mRNA的擴增引物：CATGTTCTTAAGGCTGAGCTGC(序列號38，GenBank Accession No.NM_013633:617-638)
·Nanog mRNA的擴增引物：CTGAATCAGACCATTGCTAGTC(序列號39，GenBank Accession No.NM_028016:388-408)
·Sox2 mRNA的擴增引物：CAACGATATCAACCTGCATGG(序列號40，GenBank Accession No.NM_011443:2120-2140)
·Klf2 mRNA的擴增引物：GAACTGGTGGCAGAGTCATTTTC(序列號41，GenBank Accession No.NM_008452:1205-1227)
·Esrrb mRNA的擴增引物：GATTCGAGACGATCTTAGTCAATG(序列號42，GenBank Accession No.NM_011934:957-980)
·Fgf5 mRNA的擴增引物：GACGCATAGGTATTATAGCTG(序列號43，GenBank Accession No.NM_010203:729-749)
·Gapdh mRNA的擴增引物：CTTGATGTCATCATACTTGGC(序列號44，GenBank Accession No.NM_001289726:843-863)
將各混合物在72℃溫度孵育3分鐘后，立即進行冰冷處理。接著，添加5×緩沖液(東洋紡(株)制)4μL、2.5mM dNTPs(日本基因公司制)4μL、RNase抑制劑(特級)(和光純藥工業(株)制)0.5μL(20U)、ReverTra Ace(東洋紡(株)制)1μL(100U)進行混合，在42℃溫度孵育50分鐘。然后，添加結合緩沖液(5.5M胍鹽酸鹽(和光純藥工業(株)制)、20mM Tris-HCl pH6.6(和光純藥工業(株)制)100μL進行混合，轉移至Econospin(基因設計公司制)，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。然后，添加洗滌緩沖液(2mM Tris-HCl pH7.5(日本基因公司制)、80％乙醇(和光純藥工業(株)制)500μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，除去離心管的溶液。然后，進一步在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離后，更換為新的離心管，添加洗脫緩沖液(10mMTris-HCl pH8.5)(日本基因公司制)25μL，在12000×g、室溫條件下進行1分鐘的離心分離，將得到的沉淀物溶解于1μL的蒸餾水中，回收cDNA。
(5)PCR反應
將上述(4)中得到的cDNA 1μL、蒸餾水5μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)制)用2×PCR緩沖液12.5μL、2mM dNTPs(東洋紡(株)制)4μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)制)0.5μL(0.5U)、各正向引物(10μM)1μL、各反向引物(10μM)1μL進行混合。
使用的各引物的堿基序列如下所述。下述引物均為西格瑪奧德里奇公司制造。
Foxb2 cDNA、GenBank Accession No.NM_008023:132-152、279-300
正向引物:CTTTCCAAGAGGCGTTAAGGC(序列號45)
反向引物:CTCAGAGGCAGCATCTTCTCAG(序列號46)
擴增鏈長:169bp
Oct3/4 cDNA、GenBank Accession No.NM_013633:163-186、480-501
正向引物:GAACCTGGCTAAGCTTCCAAG(序列號47)
反向引物:GCTTGGCAAACTGTTCTAGCTC(序列號48)
擴增鏈長:339bp
Nanog cDNA、GenBank Accession No.NM_028016:110-134、388-408
正向引物:GCATTAGACATTTAACTCTTCTTTC(序列號49)
反向引物:CTTGAAGAGGCAGGTCTTCAG(序列號50)
擴增鏈長:299bp
Sox2 cDNA、GenBank Accession No.NM_011443:1652-1674、1836-1859
正向引物:GAATCGGACCATGTATAGATCTG(序列號51)
反向引物:CATTTGATTGCCATGTTTATCTCG(序列號52)
擴增鏈長:208bp
Klf2 cDNA、GenBank Accession No.NM_008452:910-931、1159-1182
正向引物:GAAGCCTTATCATTGCAACTGG(序列號53)
反向引物:CTGTCCTAAGGTCCAATAAATAGC(序列號54)
擴增鏈長:273bp
Esrrb cDNA、GenBank Accession No.NM_011934:552-573、760-782
正向引物:GCAAGAGCTACGAGGACTGTAC(序列號55)
反向引物:GTTTGGTGATCTCACATTCATTG(序列號56)
擴增鏈長:231bp
Fgf5 cDNA、GenBank Accession No.NM_010203:445-465、617-639
正向引物:GAACATAGCAGTTTCCAGTGG(序列號57)
反向引物:GTTGCTGAAAACTCCTCGTATTC(序列號58)
擴增鏈長:195bp
Gapdh cDNA、GenBank Accession No.NM_001289726:224-246、512-534
正向引物:GTTCCAGTATGACTCCACTCACG(序列號59)
反向引物:CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG(序列號60)
擴增鏈長:311bp
將各混合物置于熱循環儀中，以94℃2分鐘、98℃10秒鐘→57℃20秒鐘→68℃30秒鐘的方式使Oct3/4 cDNA、Nanog cDNA、Sox2 cDNA、Klf2 cDNA及Esrrb cDNA進行擴增時，進行25個循環，以所述同樣方式使Fgf5 cDNA及FOXB2 cDNA進行擴增時，進行30個循環，以所述同樣方式使Gapdh cDNA進行擴增時，進行20個循環，在68℃溫度反應2分鐘。
(6)電泳
將上述(5)中得到的PCR擴增產物5μL與6×上樣緩沖液雙色染料(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因公司制)1μL進行混合，用1.5％的瓊脂糖凝膠對其進行電泳。使用GelRed核酸凝膠染色試劑(和光純藥工業(株)制)進行染色。
需要說明的是，針對在上述(4)中不添加RTase進行反應而得到的反應物，進行上述(5)～(6)的處理。
(7)結果
將結果一并示于圖4中。
由圖4的結果可知，確認了FOXB2 mRNA在分化誘導處理后第7天的ES細胞(LIF(-)/RTase(+)的情況)中進行表達(確認了電泳條帶)。但是，FOXB2 mRNA在維持未分化/多能性的狀態的ES細胞(LIF(+)/RTase(+)的情況)中未進行表達。
確認了作為分化標記的Fgf5 mRNA在分化誘導處理后第7天的ES細胞(LIF(-)/RTase(+)的情況)中進行表達(確認了電泳條帶)。
另外，確認了作為未分化標記的OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及SOX2 mRNA在維持未分化/多能性的狀態的ES細胞(LIF(+)/RTase(+)的情況)中進行了表達。另外，確認了即使在分化誘導處理后第7天的ES細胞(LIF(-)/RTase(+)的情況)中仍進行表達(確認了電泳條帶)。
需要說明的是，由于在全部mRNA的檢測結果中，在RTase(-)的情況下未確認到電泳條帶，因此，確認了本實驗體系中沒有混入基因組DNA。
另外，對GAPDH mRNA的檢測結果進行觀察，在“LIF(+)/RTase(+)”和“LIF(-)/RTase(+)”的情況下確認了電泳條帶，而在“LIF(+)/RTase(-)”和“LIF(-)/RTase(-)”的情況下未確認到電泳條帶。由此，確認了在本實驗體系中mRNA未進行分解。
由上述結果可知，FOXB2 mRNA的表達，與被認為是目前最具前景的分化標記的Fgf5mRNA在同樣程度的早期被檢測出。另外，即使在常規未分化標記(OCT3/4,NANOG,SOX2)的表達的變化未被檢測出的階段，FOXB2 mRNA的表達也被顯著地檢測出。進一步地，在已知作為初始標記的Klf2 mRNA、Esrrb mRNA仍未消失的分化誘導后第7天的階段，確認了FOXB2mRNA的表達。
由上述內容可知，與以往的未分化標記相比，FOXB2 mRNA在分化的初始階段就能夠判定ES細胞的分化狀態。另外，由于在培養初始階段能夠判定已分化的細胞，因此，在細胞的早期篩選、干細胞的品質管理等方面有用，能夠有望縮短培養期間、降低培養基的成本等。
參考例1.細胞的分化狀態的確認
(1)干細胞的培養和分化誘導處理
使用下述培養基對hiPS細胞(201B7株，京都大學iPS細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式會社))進行培養。
使用添加或未添加+bFGF及+ROCK抑制劑的hPSCΔ培養基(和光純藥工業(株)制)，將hiPS細胞播種于4個孔中，以使20000細胞/孔，培養1天。
從第2天開始，對于4個孔中的每2個孔，將培養基設為(1)hPSCΔ培養基、+bFGF、(2)hPSCΔ培養基、+bFGF(100mg/mL)，每天分別交換培養基。培養6天后，觀察細胞。
(2)結果
將結果示于圖5中。
在圖5中，(1)是使用未添加bFGF的培養基進行培養(分化誘導處理)的hiPS細胞的照片。(2)是使用添加有bFGF的培養基進行培養的hiPS細胞的照片。
可知通過使用未添加bFGF的培養基進行培養，對hiPS進行培養時，iPS細胞分化誘導為神經細胞系的細胞。
由圖5(1)可知，使用未添加bFGF的(-bFGF)培養基進行培養時，在培養的第6天，確認了細胞形態變成突起狀或纖維狀的狀態(克隆的邊緣呈刺狀)。
但是，由圖5(2)可知，在使用添加有bFGF(+bFGF)的培養基進行培養時，沒有觀察到如使用未添加bFGF的培養基進行培養時那樣的細胞形態的變化。
根據上述內容，確認了使用未添加bFGF的培養基進行培養時，hiPS細胞的分化受到誘導。
實驗例1.FOXB2蛋白質的檢測1
1)抗人FOXB2蛋白質抗體固定化ELISA用微孔板的制備
將抗人FOXB2蛋白質抗體的溶液(50mM MOPS緩沖液(pH7.0))分別注入ELISA用微孔板(能肯公司(Nunk社)制)的各孔中，然后，靜置24小時，從而得到固定了抗人FOXB2蛋白質抗體的微孔板。
2)過氧化物酶標記抗FOXB2蛋白質抗體的制備
通過常規方法對抗人FOXB2蛋白質抗體進行過氧化物酶標記。
3)試樣的制備
回收分化誘導后第3天的hiPS細胞，通過超聲來破壞hiPS細胞，從而得到細胞的裂解液。將得到的裂解液溶解于緩沖液中，制成試樣。
4)測定
將上述3)中制備的試樣添加至上述1)中制備的抗FOXB2蛋白質抗體固定ELISA用微孔板各孔中，在37℃溫度反應1小時左右。接著，使用緩沖液洗滌各孔。
將上述2)中制備的過氧化物酶標記抗FOXB2蛋白質抗體分別注入各孔中，在37℃反應1小時左右。使用緩沖液洗滌各孔，接著使用蒸餾水洗滌各孔，在各孔中，分別添加50μL的TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液(和光純藥工業(株)制)，在25℃溫度反應30分鐘。然后，在各孔中分別添加50μL的反應停止液(1M磷酸溶液)，使反應停止。使用Vmax(分子器件公司(モレキュラーデバイス社)制)對450nm處的吸光度進行測定。
其結果是，在檢測到FOXB2蛋白質的情況下，判定用作試樣的hiPS細胞處于已分化的狀態。或者，判定在用作試樣的hiPS細胞的細胞群中包含處于已分化的狀態的細胞。
實驗例2.FOXB2蛋白質的檢測2
1)試樣的制備
回收分化誘導后第3天的hiPS細胞，通過超聲來破壞hiPS細胞，得到細胞的裂解液。使得到的裂解液溶解于緩沖液中，制成試樣。
2)過氧化物酶標記抗FOXB2蛋白質抗體的制備
通過常規方法對抗人FOXB2蛋白質抗體進行過氧化物酶標記。
3)Western印跡法
將上述1)中得到的試樣施加于SuperSepTM(電泳用凝膠，和光純藥工業(株)，5-20％的梯度凝膠)，進行SDS-PAGE電泳(恒定電流25mA)。接著，采用半干印跡法，將電泳后所分離部分轉印于PVDF膜。
使封閉劑Block Ace(DS生物醫學制藥公司(ファーマバイオメディカル(株))制)溶解于PBS-T(含吐溫20的磷酸鹽緩沖液，Phosphate Buffered Saline with TweenTM 20，pH 7.4)中，制成封閉液。在該封閉液中浸漬上述轉印后的PVDF膜，在室溫進行1個小時的封閉處理，然后，洗滌PVDF膜，使其浸漬于封閉液中。
接著，將上述2)中得到的過氧化物酶標記抗人FOXB2蛋白質抗體添加至封閉液中，在室溫浸漬1小時左右。洗滌PVDF膜，使用ECLTM Prime Western免疫印跡法檢測試劑(Western Blotting Detection Reagent)(過氧化物酶的化學發光底物，GE醫療制)進行發光，使用LAS4000(富士フイルム(株)制)，以10秒的曝光時間進行檢測。
其結果是，在檢測到FOXB2蛋白質的情況下，判定用作試樣的hiPS細胞處于已分化的狀態。或者，判定用作試樣的hiPS細胞的細胞群中包含處于已分化的狀態的細胞。
判定包含狀態的細胞。
工業實用性
根據本發明，能夠在分化的初始階段判定干細胞的分化狀態。另外，本發明能夠用于干細胞的品質管理、分化細胞的制備、分離方法中。進而，由于本發明能夠在培養初始階段判定已分化的細胞，因此，在細胞的早期篩選、干細胞的品質管理方面有用，能夠有望縮短培養期間、降低培養基的成本。
序列表
<110> 和光純藥工業株式會社
<120> 細胞分化狀態的判定方法
<130> 1993PCT
<150> JP2014-167800
<151> 2014-08-20
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人 FOXB2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1299)
<400> 1
atg ccg cgg ccg ggg aag agc tcg tac agc gac caa aaa ccg ccc tac 48
Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr
1 5 10 15
tct tac atc tcg ctg acc gcc atg gca atc cag cac tcg gcc gag aag 96
Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys
20 25 30
atg ctg ccg ctg agc gac atc tac aag ttc atc atg gag cgc ttc ccc 144
Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro
35 40 45
tac tac cgc gag cac aca cag cgc tgg cag aac agc ctg cgc cac aac 192
Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn
50 55 60
ctc tcc ttc aac gac tgc ttc atc aag att ccg cgg agg ccc gac cag 240
Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln
65 70 75 80
cct ggc aag ggt agc ttc tgg gcg ctg cac ccc gac tgc ggg gac atg 288
Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met
85 90 95
ttc gag aac ggc agc ttc ctg cgg cgt cgc aag cgc ttc aag gtg ctg 336
Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu
100 105 110
cgc gcc gac cat act cac ttg cac gcg gga agc acc aag agc gcg ccg 384
Arg Ala Asp His Thr His Leu His Ala Gly Ser Thr Lys Ser Ala Pro
115 120 125
ggc gcc ggt ccg gga ggg cac ctt cac ccc cat cac cac cac cac ccc 432
Gly Ala Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His His His His Pro
130 135 140
cac cac cac cat cat cac cac gct gcc gca cac cac cac cat cac cac 480
His His His His His His His Ala Ala Ala His His His His His His
145 150 155 160
cac cca ccc cag ccg ccg ccg ccg ccg ccc ccg ccg ccg ccg cac atg 528
His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met
165 170 175
gta cac tat ttc cat cag caa ccg cct act gct ccg cag ccg cct ccg 576
Val His Tyr Phe His Gln Gln Pro Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Pro
180 185 190
cac ctc ccg tca cag ccc ccg cag caa ccg ccc cag cag tcg cag cct 624
His Leu Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Pro
195 200 205
cag cag ccg tct cac ccc ggc aag atg cag gag gcg gcg gcc gtg gcg 672
Gln Gln Pro Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala
210 215 220
gcg gcg gcg gcg gcg gcc gcg gca gcc gcg gtg ggc agc gtg gga cgc 720
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg
225 230 235 240
ctg tct cag ttc cca ccc tac ggg ctg ggc tcg gcc gcc gcc gct gcc 768
Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
gcc gcg gcc gcg gcg tcc acg tca ggc ttc aag cac ccc ttt gcc att 816
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile
260 265 270
gag aac att att ggc cgg gac tac aag ggc gtg ctg cag gct gga ggg 864
Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly
275 280 285
ctg ccc ttg gcg tcc gtc atg cac cac ctg ggc tac ccc gtg ccc ggc 912
Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly
290 295 300
cag ctt ggc aac gtc gtc agc tcc gtg tgg ccg cac gtt ggc gtc atg 960
Gln Leu Gly Asn Val Val Ser Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met
305 310 315 320
gat tcg gtg gcc gcc gcc gcg gcc gcc gca gcc gca gcc gga gtc cct 1008
Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro
325 330 335
gta ggc ccg gag tat ggg gcc ttc ggg gtc ccg gtc aag tcc ctg tgc 1056
Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ser Leu Cys
340 345 350
cac tcg gca agc cag agc ctg cct gcc atg ccg gtg ccc atc aag ccc 1104
His Ser Ala Ser Gln Ser Leu Pro Ala Met Pro Val Pro Ile Lys Pro
355 360 365
acg cct gcg ctg ccg ccc gtg tcc gcg ctg cag ccg ggg ctc act gtc 1152
Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Ser Ala Leu Gln Pro Gly Leu Thr Val
370 375 380
ccc gcg gct tcg cag cag cct ccg gcg cca tcc acc gtg tgc tcc gcg 1200
Pro Ala Ala Ser Gln Gln Pro Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ser Ala
385 390 395 400
gcc gcg gcc tcg ccc gtt gcc tct ctg ctg gag ccc aca gcc cct acc 1248
Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Ala Pro Thr
405 410 415
tcg gcc gaa agc aag ggc ggc tcc ttg cac tcg gtg cta gtg cac tcc 1296
Ser Ala Glu Ser Lys Gly Gly Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
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tag 1299
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<212> PRT
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Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr
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Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys
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Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro
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Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met
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Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu
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Arg Ala Asp His Thr His Leu His Ala Gly Ser Thr Lys Ser Ala Pro
115 120 125
Gly Ala Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His His His His Pro
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His His His His His His His Ala Ala Ala His His His His His His
145 150 155 160
His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met
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Val His Tyr Phe His Gln Gln Pro Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Pro
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His Leu Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Pro
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Gln Gln Pro Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg
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Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile
260 265 270
Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly
275 280 285
Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Asn Val Val Ser Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met
305 310 315 320
Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro
325 330 335
Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ser Leu Cys
340 345 350
His Ser Ala Ser Gln Ser Leu Pro Ala Met Pro Val Pro Ile Lys Pro
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Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Ser Ala Leu Gln Pro Gly Leu Thr Val
370 375 380
Pro Ala Ala Ser Gln Gln Pro Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ser Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Ala Pro Thr
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Ser Ala Glu Ser Lys Gly Gly Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
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gctgagcgac atctacaagt tcatcatgga gcgcttcccc tactaccgcg agcacacaca 120
gcgctggcag aacagcctgc gccacaacct ctccttcaac gactgcttca tcaagattc 179
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<223> 寡核苷酸引物
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<212> DNA
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gttcttgaag ctaagctgca g 21
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<212> DNA
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gttctggaac caggtcttca c 21
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<212> DNA
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cttggagacc tctcagcctg ag 22
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cttcaggagc ttggcaaatt g 21
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<212> DNA
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<400> 30
gcttgtggac tctacatgaa ac 22
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 31
gctgcaatca tctgagttag aag 23
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 32
cggaatttga acagtatctg c 21
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 33
gctcctccag gaagtgtgta ac 22
<210> 34
<211> 1515
<212> DNA
<213> 小鼠 FOXB2
<220>
<221> CDS
<222> (191)..(1474)
<400> 34
ttgcggggac ccggggcagc tccccgaagg aggaggacca aggcaaaagg ggtctgggga 60
ccaagaaagc tggggatcag ctggcgcagg tggagagaga attagtgggg acacttaagc 120
ctggtatccg gctttccaag aggcgttaag gcccactgtg ggccggacgg aggtggaaga 180
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Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys
1 5 10
ccg ccc tac tct tac atc tca ctg acc gcc atg gcc atc cag cat tcg 277
Pro Pro Tyr Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser
15 20 25
gct gag aag atg ctg cct ctg agc gac atc tac aag ttc atc atg gag 325
Ala Glu Lys Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu
30 35 40 45
cgc ttc ccc tac tac cgc gag cac acg cag cgc tgg cag aac agc ctg 373
Arg Phe Pro Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu
50 55 60
cgc cac aac ctc tcc ttc aac gac tgt ttc atc aag atc cct cgg agg 421
Arg His Asn Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg
65 70 75
ccg gac caa ccc ggt aag ggc agc ttc tgg gcg cta cac cct gac tgc 469
Pro Asp Gln Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys
80 85 90
ggt gac atg ttc gag aac ggc agc ttc ctg cgg cgc cgc aag cgc ttc 517
Gly Asp Met Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe
95 100 105
aag gtg cta cgc gca gac cac gct cac cta cac tca gga agc agc aag 565
Lys Val Leu Arg Ala Asp His Ala His Leu His Ser Gly Ser Ser Lys
110 115 120 125
ggc gcg ccc ggc acg ggg cca gga ggt cac ctg cat ccc cac cat ccc 613
Gly Ala Pro Gly Thr Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His Pro
130 135 140
cac cac gca cac cac cac cac cac cat cac cac cac gcc gca cac cat 661
His His Ala His His His His His His His His His Ala Ala His His
145 150 155
cac cac cat cac cac ccg ccg cag ccg ccc ccg ccg ccg ccg ccg cac 709
His His His His His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
160 165 170
atg gtg ccc tat ttc cac cag cag ccg gct ccg gct ccg cag cct cca 757
Met Val Pro Tyr Phe His Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro
175 180 185
cac ctc ccg tcg cag ccc gcg cag cag cca cag ccg cag tcg cag cct 805
His Leu Pro Ser Gln Pro Ala Gln Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro
190 195 200 205
ccg cag acg tcc cat ccc ggc aag atg cag gag gcg gcg gcc gtg gcg 853
Pro Gln Thr Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala
210 215 220
gcg gcc gca gca gcg gcg gcg gcc gca gcg gtg ggc agc gtg ggg cgt 901
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg
225 230 235
ctg tct cag ttc cca ccc tac ggg ctg ggc tcg gcc gcc gcc gcc gcc 949
Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala
240 245 250
gct gca gcc gcc gcg tcc acc aca ggc ttc aaa cat ccg ttc gcc ata 997
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Thr Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile
255 260 265
gag aac atc atc ggg cgg gac tac aag ggc gtg ctg cag gct gga ggg 1045
Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly
270 275 280 285
ttg cct ttg gcg tcg gtc atg cac cac ttg ggc tac ccc gtg ccg ggc 1093
Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly
290 295 300
cag ctc agc aat gtt gtc ggc tcc gtg tgg cct cat gtt ggc gtg atg 1141
Gln Leu Ser Asn Val Val Gly Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met
305 310 315
gat tcg gta gcc gcg gct gcc gct gct gcc gcc gca gct ggg gtc ccg 1189
Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro
320 325 330
gta ggc ccg gag tat ggg gca ttc ggg gtg cca gtc aag gct ctg tgc 1237
Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Leu Cys
335 340 345
cac tcg gca aac cag agc ctg cca gct gta ccg gtg ccc atc aag ccc 1285
His Ser Ala Asn Gln Ser Leu Pro Ala Val Pro Val Pro Ile Lys Pro
350 355 360 365
acg cct gcg cta cca ccc gtg acc acg ctg ccg ccg gcg ttg tct gtc 1333
Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Thr Thr Leu Pro Pro Ala Leu Ser Val
370 375 380
ccc acg gcg tcg cag cag ctg cct gct ccc tcc acc gtg tgc gcg gcc 1381
Pro Thr Ala Ser Gln Gln Leu Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ala Ala
385 390 395
gcc gcc tca ccc aca gcc cct ctc ttg gag ccc acc gca gcc ggc agg 1429
Ala Ala Ser Pro Thr Ala Pro Leu Leu Glu Pro Thr Ala Ala Gly Arg
400 405 410
gct gac agc aag ggg agc tcc cta cac tcg gtg ttg gtg cat tct 1474
Ala Asp Ser Lys Gly Ser Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
415 420 425
taggggaccc cgcgaccggt gagaaggcgc ctgtcgagag a 1515
<210> 35
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<212> PRT
<213> 小鼠 FOXB2
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Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys
20 25 30
Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro
35 40 45
Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn
50 55 60
Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met
85 90 95
Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu
100 105 110
Arg Ala Asp His Ala His Leu His Ser Gly Ser Ser Lys Gly Ala Pro
115 120 125
Gly Thr Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His Pro His His Ala
130 135 140
His His His His His His His His His Ala Ala His His His His His
145 150 155 160
His His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met Val Pro
165 170 175
Tyr Phe His Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro His Leu Pro
180 185 190
Ser Gln Pro Ala Gln Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro Pro Gln Thr
195 200 205
Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg Leu Ser Gln
225 230 235 240
Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ser Thr Thr Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile Glu Asn Ile
260 265 270
Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly Leu Pro Leu
275 280 285
Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly Gln Leu Ser
290 295 300
Asn Val Val Gly Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met Asp Ser Val
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Val Gly Pro
325 330 335
Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Leu Cys His Ser Ala
340 345 350
Asn Gln Ser Leu Pro Ala Val Pro Val Pro Ile Lys Pro Thr Pro Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Val Thr Thr Leu Pro Pro Ala Leu Ser Val Pro Thr Ala
370 375 380
Ser Gln Gln Leu Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ala Ala Ala Ala Ser
385 390 395 400
Pro Thr Ala Pro Leu Leu Glu Pro Thr Ala Ala Gly Arg Ala Asp Ser
405 410 415
Lys Gly Ser Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser
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<213> 小鼠 FOXB2
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ctttccaaga ggcgttaagg cccactgtgg gccggacgga ggtggaagag cctgggaaga 60
tgccacggcc agggaagagt tcctacagcg accaaaagcc gccctactct tacatctcac 120
tgaccgccat ggccatccag cattcggctg agaagatgct gcctctgag 169
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catgatgaac ttgtagatgt c 21
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<213> 人工序列
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<223> 寡核苷酸引物
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catgttctta aggctgagct gc 22
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ctgaatcaga ccattgctag tc 22
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caacgatatc aacctgcatg g 21
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gaactggtgg cagagtcatt ttc 23
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gattcgagac gatcttagtc aatg 24
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gacgcatagg tattatagct g 21
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cttgatgtca tcatacttgg c 21
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ctttccaaga ggcgttaagg c 21
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ctcagaggca gcatcttctc ag 22
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gaacctggct aagcttccaa g 21
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gcttggcaaa ctgttctagc tc 22
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gcattagaca tttaactctt ctttc 25
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cttgaagagg caggtcttca g 21
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gaatcggacc atgtatagat ctg 23
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gaagccttat cattgcaact gg 22
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ctgtcctaag gtccaataaa tagc 24
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gcaagagcta cgaggactgt ac 22
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gtttggtgat ctcacattca ttg 23
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gaacatagca gtttccagtg g 21
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cattgctgac aatcttgagt gag 23
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