一種甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因及其利用的制作方法

專利名稱：一種甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因及其利用的制作方法
技術領域：
本發明公開一種藍細菌甘氨酸甜菜堿合成途徑中的兩種甲基轉移酶基因序列以及其修飾基因的序列和它們分別編碼的蛋白質序列，并將這兩種基因用于作物抗逆育種， 屬于基因工程領域。具體地說涉及到克隆和修飾參與一條甘氨酸甜菜堿生物合成途徑中的甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因和二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶基因及利用。
背景技術：
在甜菜堿天然合成植物中，甘氨酸甜菜堿作為一種滲透保護物質，能夠提高植物對多種非生物脅迫(如鹽堿、干旱、低溫等)的抗性，而且對某一脅迫的抗性程度與甜菜堿的積累水平密切相關。基因工程研究表明，通過轉基因技術在植物中積累甘氨酸甜菜堿能夠提高其抗逆性。在自然界中，已知的甘氨酸甜菜堿的生物合成途徑主要有兩種，即膽堿氧化途徑和甘氨酸甲基化途徑。膽堿氧化途徑以膽堿為底物，通過一步或兩步氧化反應合成甘氨酸甜菜堿。此途徑分布廣泛，由存在于微生物、植物和哺乳動物中的膽堿脫氫酶(CDH)和甜菜堿醛脫氫酶催化。存在于微生物中的膽堿氧化酶，能催化合成甜菜堿的兩個連續的反應。在合成甘氨酸甜菜堿的高等植物中膽堿單加氧酶和甜菜堿醛脫氫酶依次催化甘氨酸甜菜堿合成。已有多個參與膽堿氧化合成甘氨酸甜菜堿的酶基因被相繼克隆。甘氨酸甲基化途徑是甘氨酸經過連續三步N-甲基化生成甜菜堿，是由依賴S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶(glycine sarcosine methyl transferase, GSMT)和依賴SAM的肌氛酸二甲基甘氛酸甲基轉移酶(sarcosine dimethyl glycine methyltransferase, SDMT)分別催化完成的。從上個世紀80年代后期開始，陸續在一些古細菌、真細菌和極端蘭細菌中發現了該條途徑，但了解極少，至今只從少數幾個物種中克隆得到相關基因。以膽堿為底物的合成途徑已在多種生物中進行了研究。該途徑中根據膽堿氧化方式的不同涉及一種或兩種酶。在高等植物中，甜菜堿生物合成途徑的研究主要集中于藜科植物，在莧科和禾本科植物中也有研究(McNeil et al. ,1999, 2001) 在藜科和莧科植物中，甜菜堿由膽堿經兩步氧化反應合成，先由膽堿單加氧酶(CMO)催化生成甜菜堿醛，后者在甜菜堿醒脫氫酶(BADH)催化下生成甜菜堿(Weretilnyk et al. , 1989 ；Akamoto, 2000) 目前，CMO僅在藜科和莧科植物中發現，推測其它科植物可能具有不同的膽堿氧化酶。而編碼BADH的基因已經從菠菜(Weretilnyk and Hanson, 1990)等多種植物中克隆。BADH并不是甘氨酸甜菜堿合成特用的酶，它與氨基醛脫氫酶(一種在多胺代謝中廣泛存在的
3酶)相同(Holmstrom et al. , 1994 ；Rathinasabapathi et al. ,1994)。在大腸桿菌中，與甜菜堿合成相關基因由bet操縱子編碼(Andresen et al., 1988 ；Lamark et al. , 1991) :betA 編碼 CDH, betB 編碼 BADH, betT 編碼膽喊轉運蛋白，betl 編碼調控蛋白，從膽堿到甜菜堿的轉變途徑與植物中類似，是由兩種酶催化的，即膽堿脫氫酶(choline dehydrogenase, Q)H)和BADH。Q)H是一種依賴氧的膜結合黃素蛋白，不但能催化膽堿氧化為甜菜堿醛，而且能以幾乎相同的速率催化甜菜堿醛的氧化。BADH是一種依賴于NAD的可溶性蛋白，對甜菜堿醒具有很高的親合性(Landfald and Strom, 1986)。在微生物球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)和滋養節桿菌(A. pascens) 中，甘氨酸甜菜堿的合成僅需要一種酶即膽堿氧化酶(choline oxidase, COD)催化(Ikuta et al.，1977)，同時產生 H2O2。以甘氨酸為底物合成甜菜堿的途徑首先是在兩種極嗜鹽的微生物 Actinopolyspora halophila和Ectothiorhodospira halochloris 中發現的(Nyyssola et al. ,2000,2001 ；ffaditee et al. ,2003) 在這些微生物中，甘氨酸經過連續三步N-甲基化生成甘氨酸甜菜堿，反應的第一步是由依賴S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶(glycine sarcosine methyltransferase, GSMT)催化的，反應的第二步由GSMT或依賴SAM的肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉移酶(sarcosine dimethylglycine methyltransferase, SDMT)催化，最后一步是由 SDMT 催化的(Nyyssola et al. , 2001 ；ffaditee et al. ,2003)。甜菜堿生物合成的基因工程研究對天然積累甜菜堿生物體的生化分析表明，甜菜堿在植物體內是穩定的，并且甜菜堿積累的限速步驟是其合成而不是其降解(Rhodes and Hanson, 1993)。隨著人們對植物和微生物中甜菜堿生物合成途徑分子機制深入了解，大量甜菜堿合成的相關基因也相繼被克隆。這為通過基因工程的手段在不積累甜菜堿的生物體內建立甜菜堿生物合成途徑提供了分子依據。目前參與甜菜堿合成的多個基因如COD、CDH、CM0、BADH等已在多種植物中轉化成功，這些轉基因植株積累了不同水平的甜菜堿，提高了其對多種逆境的抗性。高等植物中，膽堿轉化為甜菜堿由膽堿單氧化酶(CMO)催化，已先后從菠菜 (Rathinasabapathi et al., 1997)、甜菜(Russell et al. , 1998)和山菠菜(Atriplex hortensis)(沈義國等，2001)中克隆到CMO并進行了轉基因研究，這些基因具備信號肽序列，用于引導成熟肽鏈定位于葉綠體基質。Nuccio等(1998)將菠菜的CMO基因轉入煙草，轉基因產物定位于葉綠體中，然而CMO活性和甜菜堿含量都非常低(彡50nmol g—1 FW) (Nuccio et al. ,2000)。然而，當CMO在細胞質中表達,而不是在葉綠體中表達時,轉基因煙草中甜菜堿含量大大提高(430nmol g-1 FW)。McNeil等(2000)用14C標記的膽堿(甜菜堿合成底物)追蹤研究轉基因煙草中膽堿代謝的動力學，發現膽堿由胞質向葉綠體的轉運是制約葉綠體內甜菜堿合成的主要因素(McNeil et al.，2000)。磷酸乙醇胺_N_甲基轉移酶(PEAMT)是膽堿合成途徑中的關鍵酶，它催化磷酸乙醇胺生成磷酸膽堿的甲基化反應。McNeil等(2001)將菠菜的PEAMT和CMO基因以及甜菜的BADH基因共轉化到煙草葉綠體，同單轉CMO基因煙草相比，轉多基因煙草的游離膽堿含量提高了 50倍，甜菜堿含量提高 7 30 倍，最高達到 I. 8 u mo I g-1FW (McNeil et al. ,2001) 自1981年從高等植物中分離到BADH后，有關甜菜堿合成酶的研究很快引起了廣泛關注。已從疲菜(Weretilnyk and Hanson, 1990)、甜菜(McCue and Hanson, 1992)、高梁(Wood et al. , 1996)、水稻(Nakamura et al.，1997)、大麥(Ishitani et al. , 1995 ； Nakamura et al. , 2001)、山菠菜(肖崗等，1995)和千穗谷(Legaria et al., 1998)中克隆到BADH基因。在藜科、莧科等植物中，BADH主要存在于葉綠體基質；而在水稻、大麥等單子葉植物中BADH主要存在于過氧物酶體中。BADH在細胞中的不同定位可能有利于其酶活性的發揮。正常條件下植物BADH基因表達量很低，一些資料(Nakamura et al.，1997;肖崗等，1995 ；WeretiInyk et al.，1989)表明，BADH基因的表達受鹽脅迫誘導，但這個反應并不具有鹽誘導的特異性，而是對滲透脅迫的反應(Ishitani et al.，1995)。轉BADH基因的研究較多。Rathinasabapathi等(1994)最早將在菠菜和甜菜的 BADH基因轉入煙草，轉基因產物定位于葉綠體中。外源基因的表達使轉基因煙草能夠抵抗甜菜堿醛的毒害。在培養基中加入5mM甜菜堿醛時，轉基因煙草中甜菜堿的含量達到了 20i!mOl g-1 FW。然而，在培養基中不加甜菜堿醛時，轉基因煙草不能合成甜菜堿。郭巖等(1997)利用基因槍法將山菠菜BADH基因轉移到水稻內，篩選出的轉基因水稻能夠在鹽脅迫下生長結籽。Kumar等(2004)獲得了轉BADH基因的胡蘿卜，甜菜堿含量分別為 93-101 u mo I g—1 DW，大大提高了轉基因植株的耐鹽性。Yang等(2005，2007)將來源于菠菜(Spinacia oleracea)的BADH基因轉化煙草,轉基因植株能合成甘氨酸甜菜堿,合成的甜菜堿主要積累于葉綠體中，轉基因植株提高了對高溫脅迫的抗性。他們認為在中度高溫脅迫下，轉基因煙草光合作用的維持是由于甜菜堿對Rubisco活化酶的保護作用；在嚴重高溫脅迫下，轉基因煙草通過提高體內抗氧化酶系統的功能，減輕了高溫脅迫對光合機構造成的活性氧傷害，維持了轉基因煙草較高的PS II活性(Yang et al.，2007)。已有的關于CMO和BADH基因工程的研究多集中在單個基因的轉化，雖然轉基因植物的抗逆性有不同程度的提高，但甜菜堿含量很低。大腸桿菌的CDH兼有膽堿單氧化物酶和甜菜堿醛脫氫酶的功能，此特性使僅轉移 betA基因的基因工程即可賦予植物積累甘氨酸甜菜堿的能力。1996年，Lilius等將betA 基因轉入煙草，轉基因植物的耐鹽性與對照植株相比有明顯的提高，但他們沒有報道甜菜堿的積累水平。Takabe等(1998)將修飾后包含線粒體定位信號的betA基因導入水稻，轉基因水稻能夠積累5i!m0l g-1 FW的甜菜堿，而且其耐鹽和抗旱性較對照有明顯提高。王淑芳等(2001)將betA轉移到番茄中，提高了番茄的抗鹽性。在鹽脅迫條件下，轉betA基因的卷心菜(Brassica oleracea var. capitata)的葉綠素含量和生物量都顯著高于野生型植株的(Bhattacharya et al. ,2004)。我們實驗室通過農桿菌介導法獲得了轉betA基因玉米和棉花，抗逆性生理分析表明轉基因玉米的耐冷和抗旱能力有明顯提高(Quan et al.， 2004a，b)，轉基因棉花的抗旱性也的得了明顯的改善(Lv et al.，2007)。節桿菌體內的膽堿氧化酶(COD)催化甜菜堿合成只需要單個酶，因此，轉COD基因的研究有較多工作。COD 酶由 codA (Arthrobactor globiformis)或 cox (A. pascens)基因編碼，目前使用最多的是codA基因。codA基因已被轉入擬南芥(Hayashi et al. , 1997, 1998 ；Alia et al. , 1998 ；Sakamoto et al. ,2000)、水稻(Akamoto et al. , 1998 ；Mohanty et al. ,2002)和番茄(Park et al.，2004)等多種植物中，轉基因植株的耐鹽(Hayashi et al. ,1997,1998 ;Akamoto, 1998)、耐冷(Park, 2004 ；Hayashi et al. , 1997 ；Alia et al.， 1998 ；Akamoto et al.，1998)、耐熱(Alia et al. , 1998)和抗凍(Sakamoto et al. , 2000)能力都有顯著提高。在擬南芥中表達帶有葉綠體定位信號的COD基因，葉片和種子中甜菜喊濃度分別為I. 2 ii mo I gtW和18iimol g 1 Dff (Hayashi et al. , 1997),轉基因植株表現出很強的耐鹽性。在冰凍脅迫下，GB在轉基因擬南芥植株中的積累顯著提高了植株的存活率，而很多冷調控基因(如cor6. 6, corl5a, cor47和cor78)的表達水平與野生型相比無明顯差別(Sakamoto et al.，2000)。在水稻的轉化中將COD定位于葉綠體，轉基因水稻葉片中甜菜堿濃度與轉基因擬南芥中類似；如果將COD定位于胞質內，合成的甜菜堿濃度比 COD定位于葉綠體的植株高3-5倍(Akamoto et al.，1998)。這可能因為膽堿濃度在細胞質中(膽堿合成位點)比在葉綠體中高所致(Mudd and Datko, 1989 ；Alia et al. ,1999)。 然而，甜菜堿在葉綠體中的積累卻能更好的保護PS II復合體免受高鹽和低溫脅迫的傷害 (Akamoto et al. , 1998)。轉codA基因番爺能夠積累0. 3-1. 2 ii mol g 1 FW甜菜喊,轉基因植株在從種子萌發到結實的各個階段的耐冷性都得到明顯提高。在冷脅迫條件下，轉基因番茄的產量比野生型提高了 10-30% (Park et al.，2004)。由于COD催化膽堿生成甜菜堿的過程中伴隨著H2O2的產生，而轉基因植株體內H2O2水平的適當提高激活了一些活性氧清除機制如抗壞血酸氧化酶和過氧化氫酶等的表達，這些酶可以將H2O2轉化成H2O,從而使 H2O2含量維持在一個較低的對細胞無害的水平。同時，轉基因植株體內活性氧清除酶類活性的增高，也有利于提高植物的抗逆境脅迫能力(Park et al.，2004)。Nyyssola等(2000)分別從兩種在系統發生學上相去甚遠的喜鹽生物 (Ectothiorhodospira halochloris 和 Actinopolyspora halophila,即嗜鹽隱桿藻)中分離到兩個催化甜菜堿合成的甲基轉移酶GSMT(甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶)和SDMT(肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉移酶)，兩個物種中的甲基轉移酶在氨基酸水平上序列相似性很高， 而且它們都以甘氨酸為底物通過兩步甲基化反應合成甘氨酸甜菜堿。Nyyssola等(2001) 從E. halochloris克隆出這兩個甲基轉移酶基因，分別命名為EcGSMT和EcSDMT。在哺乳動物中甘氨酸N-甲基轉移酶(GMT)催化甘氨酸甲基化成肌氨酸，不發生進一步的甲基化反應。哺乳動物中的GMT和EcGSMT、EcSDMT以及ApGSMT、ApSDMT之間缺少同源性(Waditee et al.，2003)。2005 年，Waditee 等將 A. halophila 中編碼 GSMT (ApGSMT)和 SDMT (ApSDMT) 的基因共轉化到淡水藻青菌(Synechococcus sp. PCC 7942)和擬南芥中，發現在鹽脅迫下轉ApGSMT/ApDMT基因的PCC 7942細胞的GB濃度高達200mM，比轉bet (betA、betB)基因的淡水藻青菌的含量提高了 5倍，前者在600mMNaCl條件下和海水中能夠生長。轉ApGSMT/ ApDMT的擬南芥植株甜菜堿含量比轉CMO基因的植株顯著增加，推測是由于底物不同造成的。另外，GB在轉ApGSMT/ApDMT基因擬南芥的根、莖、葉和花等中都有積累，轉基因植株的耐鹽、耐冷和抗旱性與轉CMO基因的擬南芥相比都有明顯提高。最近，Waditee等(2007) 從A. hanothece中克隆出磷酸甘油酸脫氫酶基因(ApP⑶H),并將其轉入大腸桿菌E. coli 和擬南芥中。結果表明，無論是在天然合成GB的大腸桿菌中還是不能自身合成GB的擬南芥中，ApP⑶H的異源表達都提高了甘氨酸甜菜堿的積累水平。他們還將ApP⑶H、ApGSMT和 ApSDMT三個基因在擬南芥中共表達，在IOOmM NaCl條件下，轉基因擬南芥根的甜菜堿含量是轉 ApGSMT/ApSDMT 的 I. 5 倍(ffaditee et al.，2007)，積累水平達到 I. 6u mo Ig^1Fff0 這些結果表明，將以甘氨酸為底物的GB合成途徑引入不合成GB的植物中，有望使植物積累大量GB。如何提高細胞甘氨酸甜菜堿積累水平從而進一步提高轉基因植物抗逆性是植物科學領域里十分關注的課題之一。開展甘氨酸甲基化途徑引入的基因工程可利用細胞中較膽堿豐富的甘氨酸為底物，有望在轉基因植株中積累高濃度的甘氨酸甜菜堿。本發明的用語和培養基“莖尖”是指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristemetic)和大到幾十毫米的芽端(Shoot tip)，“莖尖分生組織”是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基。在本發明中，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的轉化程序基本上同Ishida等(Ishida等，1996)報道的,在轉染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone, As) 等酚類化合物和中性單糖。在本發明中，轉染所用的農桿菌含有改造后的Ti-質粒，后者可攜帶或不攜帶除草劑抗性基因或其它選擇劑抗性基因。在本發明中，所用的除草劑抗性基因或其它抗性基因只要在轉化植物細胞中活躍表達并賦予植株抗性即可，不限制基因的來源、大小、所用啟動子和所抗除草劑或其它選擇劑的種類的限制，也不受農桿菌菌株的限制。在本發明中，基本培養基及植物生長調節物質用熱壓滅菌；抗生素等活性成分用過濾滅菌，在培養基滅菌后加入。在本發明中，除草劑等篩選劑用中性自來水溶解后噴灑。在本發明中，農桿菌培養一般采用YEP培養基(酵母提取物10g/l，蛋白胨10g/l， NaCl 5g/l，pH 7. 0，固體培養基加入15g/l瓊脂)培養。禾谷類作物種子萌發和胚培養采用的基本培養基為改良MS培養基KN03 1 900mg/
I,NH4NO3 1650mg/l、CaCl2 2H20 440mg/l、MgSO4 7H20 370mg/l、KH2PO4 H2O 170mg/l、 FeSO4 7H20 27. 8mg/l、ZnSO4 7H20 10mg/l、MnSO4 H2O 22mg/l、H3BO3 10mg/l、Na2MoO4 0. 5mg/l、CuSO4 5H20 0. 05mg/l、CoCl2 2H20 0. 05mg/l、鹽酸硫胺素 10mg/l、鹽酸吡哆醇 lmg/1、煙酸lmg/1、甘氨酸2mg/l、肌醇100mg/l、生物素0. 05mg/l、酪蛋白水解物250mg/l、 蔗糖30g/l、瓊脂粉7g/l、pH 5. 8-6.0。植物生長調節物質的種類和濃度因培養材料的基因型而調整。豆科作物種子萌發和胚培養采用的基本培養基為改良MS培養基(同上)或改良 B5 培養基。后種培養基成分為KN03 2500mg/l、(NH4)2SO4 134mg/l、CaCl2 2H20 150mg/l、 MgSO4 7H20 250mg/l、NaH2PO4 H2O 150mg/l、FeSO4 7H20 27. 8mg/l、ZnSO4 7H20 2mg/l、 MnSO4 H2O 10mg/l、H3BO3 10mg/l、Na2MoO4 0. 5mg/l、CuSO4 5H20 0. 05mg/l、CoCl2 2H20 0. 05mg/l、鹽酸硫胺素10mg/l、鹽酸批卩多醇lmg/1、煙酸lmg/1、甘氨酸2mg/l、肌醇100mg/l、 生物素0. 05mg/l、酪蛋白水解物250mg/l、蔗糖20g/l、瓊脂粉7g/l、pH 5. 8-6. O。植物生長調節物質的種類和濃度因培養材料的基因型而調整。在本發明中，移栽苗隔天澆灌1/2改良MS培養基無機鹽溶液或1/2改良B5培養基無機鹽溶液，pH 6. 0-7. O。

發明內容
針對現有技術本發明的目的是提供一種甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因及其修飾和利用。ApGSMT2基因和ApDMT2基因的克隆
本發明提取嗜鹽隱桿藻(Aphanothece halophytica)基因組DNA,根據哺乳類甘氨酸N-甲基轉移酶(GMT)的保守序列設計PCR引物，克隆出ApGSMT2、ApDMT2基因，構建植物表達載體，轉入煙草中進行基因功能驗證。通過檢測轉基因煙草的甘氨酸甜菜堿含量，結合基因序列分析比較，確定了 ApGSMT2和ApDMT2基因是有功能的，分別是ApGSMT和ApSDMT 的同源基因。具體步驟為30ml菌液裝入50ml離心管中，4°C 5000g離心IOmin收集菌體。STE(0. IM NaCl, IOmM Tris-HCKpH 8. 0), ImM EDTA(pH 8. 0))重懸2次。向盛有菌體的50ml離心管中加 A 20ml 2XCTAB(IOOmmoI/L Tris-HCl pH 8. 0,1. 4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA pH8. 0， 2% CTAB)緩沖液，混勻，65°C水浴中溫育90min(預熱前加入1% P -巰基乙醇)，中間搖勻2-3次。然后將離心管從水浴鍋中取出，待混合物冷至室溫后加入等體積氯仿/異戊醇 (24 : I),輕輕顛倒離心管幾次,室溫下IOOOOrpm離心lOmin。再將上清轉入新的50ml離心管中，0. 8倍體積異丙醇沉淀。絮狀沉淀轉入盛有70%乙醇的7ml離心管中，洗滌兩次。 棄去乙醇，晾干，2ml TER(2ml TE+2 u I 10mg/ml RNaseA)溶解，37°C水浴助溶。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)，輕輕顛倒，使其充分混勻抽提10min，4°C 12000rpm 離心lOmin。取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24 I)，輕輕顛倒，使其充分混勻抽提 lOmin, 4°C 12000rpm離心IOmin0取上清液，加入1/10體積3M醋酸鈉(PH 5. 2)，混勻后， 加入2倍體積冷的無水乙醇。輕輕混勻靜置一會兒后，用槍頭勾出DNA，用70%乙醇沖洗2 次后，真空干燥。依所提DNA量加入100-500ul的TE溶解DNA。檢索GenBank數據庫，收集相關甲基轉移酶基因，對相應蛋白序列進行分析，設計簡并引物 GSMT-F 5’ATGGCNAARA ARGTNGA 3’ 和 GSMT-R 5’YTARTCYITY TTNGC3> ；DMT-F 5’ ATGACNAARG CNGAYGC 3’ 和 DMT-R 5’ YTANGGYTTR TGRAA 3’。注釋RA/G ；ff A/T ；K G/T ；B C/G/T ；M A/C ；D A/G/T ；V A/C/G ；H A/C/T ；N A/C/G/T ；Y C/T ；S G/C.以嗜鹽隱桿藻基因組DNA為模板，分別用簡并引物GSMT-F和GSMT-R，DMT-F和 DMT-R，擴增得到DNA片段。反應程序為95°C預變性5min ;95°C變性lmin，45°C退火lmin， 72°C延伸30s，循環35次；72°C延伸7min。采用Takara回收Kit回收PCR擴增得到的DNA 片段，選用 pGEM-T Easy Vector Systems Kit (Promega, USA)對 PCR 片段進行克隆，送測序公司進行測序。測序結果表明，獲得了兩條長為798bp和834bp的核昔酸序列。對獲得的序列進行分析，確定了它們分別編碼兩個0RF。將兩個ORF序列編碼的蛋白序列進行blast分析， 發現它們與已報道來源于其他種生物的GSMT和DMT序列有很高的相似性。進一步分析表明它們均含有甲基轉移酶的特征基序(Motif I,Post I,Motif II，和MotifIII)，初步推定它們是嗜鹽隱桿藻甲基轉移酶基因的新成員，分別命名為ApGSMT2、ApDMT2基因。本發明克隆的嗜鹽隱桿藻甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因(ApGSMT2)的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。ApGSMT2編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 6所示。本發明克隆的嗜鹽隱桿藻二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶基因(ApDMT2)的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。ApDMT2編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
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ApGSMT2基因和ApDMT2基因的修飾本發明為了使嗜鹽隱桿藻(一種藍藻)的基因能在禾谷類作物中高效表達，我們選用禾谷類植物及玉米的偏愛密碼子取代部分ApGSMT2和ApDMT2的密碼子，修飾后的 ApGSMT2 命名為 ApGSMT2d，修飾后的 ApDMT2 基因命名為 ApDMT2d。ApGSMT2d 和 ApDMT2d 基因人工合成，并經過測序驗證。ApGSMT2d的核甘酸序列如序列表SEQ ID NO. 9所示。ApDMT2d的核甘酸序列如序列表SEQ ID NO. 10所示。甲基化酶與葉綠體蛋白導肽序列融合本發明為了使ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d基因在高等植物細胞內能有效提高植株的抗逆性，從實現甘氨酸甜菜堿在細胞內的區域化積累角度出發， 將ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d分別與定位葉綠體蛋白的導肽(transit peptide)編碼區融合，使ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d蛋白在合成后定位于葉綠體中，促進葉綠體內積累大量的甘氨酸甜菜堿。克隆出擬南芥的RUBISC0小亞基基因的導肽編碼區,分別與ApGSMT2及ApGSMT2d和ApDMT2及ApDMT2d基因融合，產生ApTpGSMT2 及 ApTpGSMT2d 和 ApTpDMT2 及 ApTpDMT2d 基因。擬南介的RUBISC0小亞基基因的導妝編碼區如序列表SEQ ID NO. 11所不。其編碼的導肽如序列表SEQ ID NO. 12所示。本發明產生的融合蛋白ApTpGSMT2和ApTpGSMT2d氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 13所示。本發明產生的融合蛋白ApTpDMT2和ApTpDMT2d的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 14所示。克隆的甲基化酶基因與線粒體蛋白導肽序列融合本發明構建融合基因以實現甘氨酸甜菜堿在植物線粒體中積累達到進一步提高轉基因植物的抗逆性的目的。線粒體作為細胞內ATP合成的場所，是細胞能量來源的主要場所，實現甜菜堿在線粒體內的積累有利于提高轉基因植物的抗逆性。如將玉米檸檬酸合成酶基因的導肽編碼序列與ApGSMT2和ApDMT2基因融合，產生ApTpGSMT2m和ApTpDMT2m基因。玉米線粒體蛋白導肽序列如序列表SEQ ID NO. 15所示。本發明產生的融合蛋白ApTpGSMT2m序列如序列表SEQ ID NO. 16所示。本發明產生的融合蛋白ApTpDMT2m序列如序列表SEQ ID NO. 17所示。植物表達載體的構建本發明將ApGSMT2/ApDMT、ApTpGSMT2d/ApTpDMT2d 、ApTpGSMT2m/ApTpDMT2m 等分別與高等植物啟動子如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S RNA基因啟動子、玉米Ubiquitin基因啟動子、擬南芥RD29啟動子和基因3’尾巴區相連，形成高效表達的融合基因，進而構建出分別攜帶 ApGSMT2 和 ApDMT、ApTpGSMT2d 和 ApTpDMT2d 及 ApTpGSMT2m 和 ApTpDMT2m 的植物表達載體(目標基因分別由不同的啟動子啟動，可有不同組合)。如利用mini-Ti質粒產生T-DNA區為圖I所示的不同植物表達載體。基因重組采用常規的分子生物學技術。基因功能確定及其應用價值的評估本發明為了確定ApGSMT2和ApDMT2是否具有催化甲基化反應的活性，二者協同表達能否提高細胞甘氨酸甜菜堿的含量，將ApGSMT2和ApDMT2重組到原核表達載體上， 轉入大腸桿菌，測定轉基因大腸桿菌和野生型大腸桿菌的甘氨酸甜菜堿含量。甘氨酸甜菜堿提取采用Xing和Rajashekar (2001)方法，含量用1H NMR測定(Bruker AM500 NMR spectrometer)。在ApGSMT2和ApDMT2共表達的大腸桿菌BL21 (DE3)plysS細胞中甘氨酸甜菜堿的含量比未轉基因對照細胞高一倍左右(在LB培養液中)，在培養液中增加
0.3-0. 5mol/LNaCl，轉基因細胞的甘氨酸甜菜堿含量比未轉基因對照增加30% -60%，轉基因細胞表現出比對照明顯提高的耐鹽性，生長速率顯著高于對照。即ApGSMT2和ApDMT2 在大腸桿菌中共表達能大量合成甘氨酸甜菜堿，提高細胞的耐鹽性。本發明以含有CaMV 35S啟動子、多克隆位點和植物抗除草劑基因EPSPs (5_e noIpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene)的植物表達載體 pCPE 為受體， 插入ApGSMT2和ApDMT2基因(均由CaMV 35S啟動子啟動)，產生質粒pCPE_ApGSMT2、 pCPE-ApDMT2和pCPE-ApGSMT2-ApDMT2。將這些質粒分別轉入根癌農桿菌LBA4404中， 然后轉化不能合成甘氨酸甜菜堿的煙草細胞，產生轉基因植株。在不同轉基因植株的葉片中測定甘氨酸甜菜堿含量，確定轉基因是否產生產物功能。遺傳轉化和轉基因植株分析步驟為取煙草無菌苗為材料，采用葉盤法進行轉化。轉基因小芽在含有選擇劑4mg/ L glyphosate (Monsanto, USA)的誘導培養基上篩選，在生根培養基上生根。采用PCR和 Southern雜交分析法確定轉基因植株。通過RT-PCR (Reverse Transcription PCR)方法檢測轉基因在煙草葉片中的表達水平，利用1H NMR測定法定量葉片中甘氨酸甜菜堿含量。結果表明，共表達ApGSMT2/ApDMT2的煙草不僅細胞內有較高豐度的轉基因轉錄本，而且積累了較高濃度的甘氨酸甜菜堿(株系9濃度為0. 1832 u Iiiolg-1FW)，大幅度高于轉betA基因植株的甘氨酸甜菜堿含量。而未轉基因植株和只含ApGSMT2或ApDMT2基因的轉基因植株沒有檢測出甘氨酸甜菜堿積累。為檢測轉ApGSMT2/ApDMT2基因對煙草植株生長發育和抗逆性的影響，將轉基因植株種子和未轉基因對照植株種子播種在花盆中，觀察生長發育的變化。在正常生長條件下轉基因煙草植株沒有表型差異。然而，通過檢測轉基因煙草葉盤在高鹽和滲透脅迫條件下的存活率和生長速率，得出轉ApGSMT2/ApDMT2基因的煙草與對照相比耐鹽耐旱性大幅度提高，轉基因煙草耐鹽耐旱性的改變是由于ApGSMT2/ApDMT2基因表達及甘氨酸甜菜堿積累造成。為了了解ApGSMT2/ApDMT2基因表達能否影響轉基因煙草植株對干旱脅迫的反應，將轉基因煙草小苗置于含10% (ff/V)PEG 6000的MS無機鹽溶液中進行滲透脅迫處理， 檢測葉片相對含水量的變化和細胞膜損傷等變化。得出煙草植株在滲透脅迫過程中葉片相對含水量逐漸降低，細胞膜損傷不斷加重，而轉基因植株相對含水量比對照植株降低速率低，細胞膜損傷明顯較輕，生長較快，表明ApGSMT2/ApDMT2基因表達的煙草植株耐旱性有較大提高。該基因在作物抗性育種中有很好的應用價值。作物遺傳轉化及轉基因株系獲得根據轉基因受體材料選用不同轉基因方法獲得轉基因植物。常用的轉化方法有1)農桿菌介導的遺傳轉化方法，如通過花序浸染法轉化擬南芥，通過平板抗生素篩選以及PCR驗證獲得陽性轉化植株進行后續分析。2)直接轉化法，即提取重組質粒DNA，采用基因槍轟擊法、聚乙二醇誘導法、電融合法、硅碳纖維法等直接將質粒DNA導入細胞。3)種系轉化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，還有將不同類方法組合使用的轉化程序，如將基因槍轟擊法和農桿菌結合使用以提高轉化效率。本發明以以玉米、小麥、高梁、大豆、棉花等作物為材料進行遺傳轉化，采用的轉化方法主要為農桿菌介導法和基因槍轟擊法。本發明以農桿菌介導法轉化小麥獲得抗性株系為例簡述試驗步驟及方法小麥種子用70%乙醇浸泡l-3min,再用0. I %氯化萊溶液浸泡7-lOmin,然后用無菌水洗滌5遍。滅菌期間不斷搖晃種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌種子放在盛有用無菌水浸潤濾紙的罐頭瓶內，封口后放在黑暗條件(24±2°C )下1-2天。待種子萌動長出胚根及胚芽后，將其放在Ml培養基上于黑暗條件(24±2°C)下繼續培養。待胚芽伸長至2-5cm 時，用解剖刀剝去胚芽鞘及1-2片幼葉，暴露出芽尖，再用解剖刀從中部縱向切傷莖尖生長點，切去初生根。切傷莖尖生長點的無菌苗用于農桿菌轉化。將帶有目的質粒的根癌農桿菌LBA4404在附加抗生素的YEP培養基中28°C下震蕩培養，震蕩速率為180rpm，使細菌處于對數生長期。然后在3000rpm下離心5分鐘，棄上清夜。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)的MS液體培養基重懸。 然后將菌液倒在直徑15cm的培養皿中，傾斜培養皿，使已被切傷的無菌苗莖端浸泡在菌液中，抽真空(0. 05MPa)感染7 IOmin。浸染后的莖尖用無菌濾紙吸干，將小苗插入小麥萌發培養基(MS培養基無機鹽成分，N族維生素(李世潤等，1990)，蔗糖30g/L,瓊脂7g/L，pH 5. 8-6. 0)上黑暗中共培養3 天。培養溫度為22-24°C。3天后將共培養后的無菌苗移栽到上層蛭石下層土壤的花盆中， 并用松散濕潤的蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28°C，夜溫 15-21°C。隔天澆灌1/2MS培養基的無機鹽溶液。移栽到蛭石中的轉化植株長到三葉期時，均勻噴灑合適濃度的除草劑水溶液進行篩選。噴灑以植株葉片掉液滴為宜。噴灑后植株放在溫室生長，白天溫度15_20°C，夜間溫度10°C左右，日光照12h左右，每3天澆水I次。返青期取葉片DNA進行PCR檢測。以epsps基因為篩選標記基因的轉化植株噴灑0. 12% Roundup水溶液，即每升自來水中加入I. 2ml “Roundup”(41%草甘膦異丙胺鹽)。噴灑后15天左右未轉基因對照植株開始死亡，25天后對照植株死亡率在90%左右。轉化植株在噴灑除草劑水溶液后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體則持續生長，變化不明顯。存活植株長到4-5葉期時移栽到田間。抗除草劑篩選的轉化植株(TO)自交產生Tl代種子，后者在花盆中萌發，小苗長到 3-4葉期時噴灑除草劑水溶液，除草劑濃度和植株生長條件同TO代。存活植株長出3片新葉后取材進行分子檢測。PCR檢測陽性植株部分移栽入花盆，每株一盆；部分移栽到大田， 按照常規管理方法進行管理，自然越冬，返青后取葉片DNA進行分子檢測。單株隔離自交授粉得T2代種子。部分T2代種子在大田播種，小苗自然越冬，返青后取新葉進行PCR檢測、 Southern雜交和半定量RT-PCR驗證。轉基因純合株系的種子用于耐鹽、耐旱生理性測定。轉基因植株的抗逆性檢測本發明以轉基因小麥的耐鹽檢測及利用為例簡述轉基因植株的抗逆性檢測及利用的一般程序及方法。以非轉基因植株為對照，選擇來自不同獨立轉化體的轉基因純合株系進行抗逆性測定。在種子萌發試驗中，將種子曬干后種于大小一致的砂盆中，分別澆灌含不同濃度 NaCl(0、100mM、200mM、300mM)的水溶液，各株系每濃度種300粒種子。澆灌量各盆之間保持一致，每天觀察種子出苗狀況和小苗的整齊度，并避免雨淋。20天后統計種子最終出苗率，胚芽鞘露出覆蓋的沙子即認為出芽。根據種子出芽率的測定，選擇合適濃度NaCl溶液作為鹽脅迫處理期間的鹽濃度。 分別選取來自不同獨立轉化體的轉基因純合株系和非轉基因對照進行耐鹽生理學測定。將各株系種子播種于大小一致的砂盆中(直徑10cm，高15cm)，每盆種20粒，每個株系種8 盆，每天燒灌Hoagland營養液,植株長到3葉期時定苗,各盆中留下大小長勢一致的小苗15 株。植株長到5葉期時，將沙盆按每個株系隨機分成兩組。其中一組開始澆灌含有NaCl的 Hoagland營養液,連續燒灌10天,另一組繼續燒灌Hoagland營養液作為未處理對照組。鹽脅迫處理過程中，測定處理植株和未處理植株的甘氨酸甜菜堿含量及其它生理指標包括光合作用指標、離子含量、RWC、葉綠素含量、細胞溶質勢、可溶性糖和脯氨酸含量、細胞膜離子滲漏、丙二醒含量和生物量。在鹽堿地種植轉基因純合的小麥株系進行耐鹽性分析，研究轉基因能否提高小麥全生育期耐鹽性以及耐鹽性提高的機制。冬小麥對鹽脅迫的敏感期分別是出苗及小苗階段和早春返青期，耐鹽性強弱最終表現在鹽堿地中的經濟產量。測定結果表明，轉基因株系的種子在鹽脅迫條件下萌發率顯著高于野生型，小苗生長較好。其中部分株系在200mM NaCl濃度處理下萌發率為95%左右，約為野生型的I. 5 倍，小苗受害較輕。對5葉期小苗進行鹽脅迫處理，NaCl濃度以每天50mM遞增至終濃度 200mM，然后每天澆灌一次，鹽濃度不變。鹽脅迫處理后，轉基因植株長勢明顯優于對照植株的，處理半月后部分轉基因植株的地上部分生物量比對照植株高30%以上，根生物量也比對照植株高30%左右。測定鹽脅迫條件下不同株系小苗的生理參數的變化，得出無論轉基因植株還是對照植株，葉片和根中的Na+含量都明顯升高，K+含量先略有升高而后降低。與對照植株相比， 轉基因植株Na+增加量少，K+降低幅度小，部分株系的Na+、K+含量與對照相比均差異顯著， 并且K+/Na+比值也顯著高于對照植株的。在鹽脅迫條件下，所有株系的葉綠素含量均是先有小幅度升高然后以不同速率下降，但轉基因植株的葉綠素含量在處理期后期顯著高于對照植株的。光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度以及PS II光化學效率的測定結果顯示，在較長時間NaCl脅迫處理下，光合速率大幅度降低是由于氣孔導度降低和PS II復合體活性受抑共同造成的。但在鹽脅迫處理中，轉基因植株表現出明顯較高的光合速率、氣孔導度和最大光化學效率(Fv/Fm)，即在鹽脅迫處理中能合成較多的碳水化合物。鹽脅迫條件下，葉細胞溶質勢隨著脅迫時間的增加而逐漸降低，但部分轉基因株系的溶質勢顯著低于對照植株的，即具有更強的保水和吸收水分的能力。與對照植株相比， 轉基因植株葉片含有較多的可溶性糖和脯氨酸。這些結果表明，在鹽脅迫條件下轉基因株系細胞內積累了較多的可溶性物質(包括Na+和脯氨酸及可溶性糖等)，使細胞維持較低的溶質勢，有利于細胞正常代謝和光合作用以及植株的生長。在鹽脅迫條件下，轉基因植株表現出較低的MDA水平和離子滲漏率，表明細胞膜受損程度小于對照植株的，這與轉基因植株中積累較高的甘氨酸甜菜堿水平呈顯著的負相關，與轉基因植株有較高的PS II活性相一致。表明甘氨酸甜菜堿在轉基因植株中的過量積累對細胞膜的穩定性和生物大分子功能產生了有益的保護作用。在濱海鹽堿地種植的轉基因株系和對照品種的試驗結果顯示，一些轉基因株系在鹽堿地中的存活和生長發育明顯優于對照品種的，經濟性狀如單株分蘗數、旗葉面積、單株產量等顯著優于對照品種的，表現出顯著提高的耐鹽性。即轉甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶基因(ApDMT2)小麥有顯著提高的耐鹽性。本發明的有益效果本發明公開了一種藍細菌甘氨酸甜菜堿合成途徑中的甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶基因(ApDMT2)序列及推測的編碼蛋白質序列。這兩個基因來源于嗜鹽隱桿藻(Aphanothece halophytica),在與高等植物組成型啟動子(花椰菜花葉病毒(CAMV) 35SRNA基因啟動子、玉米Ubiquitin基因啟動子)融合后， 共同轉入玉米、小麥、棉花、煙草等作物中，顯著提高了植株的抗逆(旱、鹽、冷、高溫)性，表明這兩個基因在作物抗逆育種中有很好的應用價值。本發明以克隆的ApGSMT2和ApDMT2基因為基礎，根據作物抗逆育種的需要，對基因序列進行了修飾，(I)以禾谷類植物及玉米偏愛的密碼子替換在高等植物中使用頻率低的密碼子，合成了 ApGSMT2d和ApDMT2d基因；(2)將蛋白質在葉綠體定位序列的編碼區與 ApGSMT2 和 ApDMT2 基因、ApGSMT2d 和 ApDMT2d 基因分別融合，產生 ApTpGSMT2 和 ApTpDMT2 基因、ApTpGSMT2d和ApTpDMT2d基因，實現了轉基因表達產物在葉綠體內的定位；(3)將蛋白質在線粒體基質定位序列的編碼區與ApGSMT2和ApDMT2基因、ApGSMT2d和ApDMT2d基因分別融合，產生 ApTpGSMT2m 和 ApTpDMT2m 基因、ApTpGSMT2dm 和 ApTpDMT2dm 基因，實現了轉基因表達產物在線粒體內的定位；(4)通過多基因轉化載體的應用和轉基因聚合方法的應用，獲得了轉基因表達產物在細胞內不同區域的定位以及甘氨酸甜菜堿在脅迫誘導條件下的局部高濃度積累。這樣，可根據需要重組出多樣的轉基因抗逆育種新材料或新品種。


圖I、質粒 pCUA-APGSMT2-ApDMT2-印sp 的 T-DNA 區圖譜P35S promoter,花椰菜花葉病毒35S啟動子；PUbi,玉米泛素ubiquintin基因啟動子；epsp,篩選標記基因；RB與LB, Ti質粒的T-DNA左、右邊界；Tnos, nos終止子。
具體實施例方式實施例I :ApGSMT2/ApDMT2基因克隆和玉米轉基因抗逆材料的創造l)ApGSMT2/ApDMT2 基因克隆培養嗜鹽隱桿藻(Aphanothecehalophytica)至 0D600 = I. 2,取 30ml 菌液裝入50ml離心管中，離心收集菌體。用STE (0. IMNaCl，IOmMTris-HCl (pH 8. 0)， ImMEDTA(pH8. 0))液重懸菌體，離心收集，重復I次。再加入20ml 2XCTAB(IOOmmoI/L Tris-HCl pH8. 0，I. 4mol/LNaCl，20mmol/LEDTApH 8. 0,2% CTAB)緩沖液，混勻，65°C水浴中溫育90min (預熱前加入1% P -巰基乙醇)，中間搖勻2-3次。然后將離心管從水浴鍋中取出，冷卻至室溫后加入等體積氯仿/異戊醇(24 I)，輕輕顛倒離心管幾次，室溫下 IOOOOrpm離心IOmin。再將上清轉入新的50ml離心管中，用0. 8倍體積異丙醇沉淀。沉淀轉入70%乙醇中洗滌2次，然后晾干，用2ml TER(2ml TE+2 u I RNaseA(10mg/ml))在37°C溶解。然后加入2倍體積冷的無水乙醇。輕輕混勻靜置一會兒后用槍頭勾出DNA，用70% 乙醇沖洗2次后，真空干燥。依所提DNA量加入100-500ul的TE溶解DNA。設計簡并引物GSMT-F 5，ATGGC (T/C/A/G) AA (A/G) AA (A/G) GT (T/C/A/G) GA 3’ 和 GSMT-R 5， (C/T)TA(G/A)TC(C/T)TT(C/T)TT(C/T/G/A)GC ；DMT-F 5’ ATGAC(T/C/A/G) AA (A/G)GC(T/C/A/G)GA(T/C)GC 3 ’ 和 DMT-R 5，(C/T)TA (T/C/A/G)GG(C/T)TT(G/A)TG(G/A) AA 3’。以所提DNA為模板，分別用簡并引物GSMT-F和GSMT-R，DMT-F和DMT-R，擴增得到 DNA片段。反應程序為95°C預變性5min ;95°C變性lmin，45°C退火lmin，72°C延伸30s，循環 35次；72°C延伸7min。采用Takara回收Kit回收PCR擴增出的DNA片段，選用pGEM-T Easy Vector Systems Kit (Promega, USA)對PCR片段進行克隆,測序公司測序。獲得了長度分別為798bp和834bp的核苷酸序列，各自編碼一個0RF。基于已報道的其他種生物的 GSMT和DMT序列，命名所克隆基因為ApGSMT2、ApDMT2基因。2)植物表達載體的構建采用常規的DNA重組技術，以含有CaMV 35S啟動子、多克隆位點和植物抗除草劑基因 EPSPs (5_enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene)的植物表達載體 pCPE為受體，在T-DNA區插入ApGSMT2和ApDMT2基因(均由CaMV 35S啟動子啟動)，產生質粒pCPE-ApGSMT2-ApDMT2。將該質粒采用凍融法轉入根癌農桿菌LBA4404或AGLO等，用于玉米轉基因。3)轉基因受體系統的建立以我國農業生產上所用的骨干自交系為材料，如鄭58、掖478、掖515等的自交系種子。離體培養誘導莖尖產生叢生芽塊，以叢生芽塊為受體進行遺傳轉化。所用培養基有種子萌發培養基KN031 900mg/l, NH4NO3 1650mg/l, CaCl2 2H20 440mg/l, MgSO4 7H20 370mg/l, KH2PO4 H2O 170mg/l, FeSO4 7H20 27. 8mg/l, ZnSO4 7H20 10mg/l, MnSO4 4H20 22. 3mg/l, H3BO3 10mg/l, KI 0. 83mg/l, Na2MoO4 2H20 0. 5mg/l, CuSO4 5H20
0.025mg/l, CoCl2 6H20 0. 025mg/l,鹽酸硫胺素 10. Omg/1,鹽酸吡哆醇 1.0mg/l,煙酸
1.Omg/1,甘氨酸2. Omg/1,肌醇100. Omg/1,生物素0. 05mg/l,酪蛋白水解物500mg/l,鹿糖 30g/l，瓊脂粉7g/l，pH 5. 8-6. O。用于種子萌發。液體培養基則去掉瓊脂粉。A培養基種子萌發培養基附加 6-BA 4. 5-9. 0 y mol/1 和 2，4-D I. 0-3. Oumol/1, 用于誘導離體培養芽尖產生叢生芽組織塊和叢生芽組織塊繼代培養。B培養基種子萌發培養基附加6-BA 4.51111101/1和184(吲哚丁酸)1.81111101/1， 用于叢生芽組織塊分化小苗。成苗培養基種子萌發培養基附加6-BA 2. 25iimol/l和IBA 3. 6 y mol/1，用于叢
生小芽發育成小苗。生根培養基種子萌發培養基附加IBA 2. 8 3. eymol/l，用于無根小苗生根。基本培養基及植物生長調節物質熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，在培養基滅菌后加入。種子滅菌和萌發玉米種子用70%乙醇浸泡10分鐘，再用0. I %氯化萊浸泡 10-15分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌后種子放在無菌三角瓶內萌發，瓶內放入少量 (30-40毫升/250毫升三角瓶)無菌水，封口后放在黑暗條件(23-30°C )下1—2天。萌動 (露白)后種子放在基本培養基上于黑暗條件下繼續萌發。
莖尖培養和叢生芽組織塊誘導、繼代、分化萌發種子的胚芽伸長至3-5厘米時， 剝離胚芽鞘及幼葉，切取長約5毫米左右的上胚軸及莖尖，接種到A培養基上于黑暗下 (24-270C )培養，并及時切去伸長的胚軸和剝去幼葉。培養6-10天后，莖尖開始不規則膨大生長，在膨大的分生組織上出現數個瘤狀或指狀突起。20天后，在瘤狀或指狀突起的表面開始形成不定芽及胚狀體。一般每4周繼代培養一次。在繼代培養中，若叢生芽組織塊叢生小芽偏多2，4-D濃度取3. 0 ii mol/1 ;若叢生芽組織塊愈傷組織化較重，雖有大量的分生細胞團，但表面很少出現不定芽，可將2，4-D濃度降為l.Oymol/1，繼續培養則重新產生大量瘤狀或指狀突起。A培養基上的叢生芽組織塊，少數有不定根的產生。與幼葉存在一樣， 不定根也影響組織塊的膨大生長及胚狀體和叢生小芽的產生，需要及早去掉。叢生芽組織塊在轉移到B培養基上2-3天后，色澤逐漸變黃，質地較柔韌，5-6天后表面出現微小突起。 掃描電鏡下觀察可見各期胚狀體及不定芽。胚狀體及不定芽迅速發育，在組織塊表面形成叢生小芽。4)以叢生芽組織塊為受體的轉化和植株再生將帶有目的基因的根癌農桿菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB培養基 (每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH 7.0，高壓滅菌)中28°C 下震蕩培養，震蕩速率為110rpm(轉/分)，使細菌處于對數生長期。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體種子萌發培養基(即種子萌發培養基成分減半，去掉瓊脂粉)洗漆，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone, As) 100 u mol/1的1/2濃度的液體叢生芽誘導培養基懸浮，稀釋5-10倍用于轉化。取繼代后培養13-20天的叢生芽組織塊為轉基因受體。用農桿菌介導法進行轉化，轉化后材料在暗中進行恢復培養。農桿菌感染的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有頭孢霉素(Cefotaxime) 250mg/l或羧芐青霉素(Carb) 500mg/L的培養基上于黑暗中培養7-12 天，抑制細菌生長。恢復培養后或抑菌培養后的叢生小芽或叢生芽組織塊在加有選擇劑的培養基上連續篩選3-4代，獲得轉基因細胞及小芽。在篩選培養中絕大數叢生芽組織塊逐漸死亡。將存活的組織塊轉移到無選擇劑的去掉2，4-D的A培養基上恢復培養后產生小芽。將小芽放在成苗培養基上照光下生長，光強2000-30001x，光照14_15小時/天。 小苗長到3-4片葉時轉入生根培養基中生根。培養15天左右，約40%的小苗產生新根。對于未生根苗，切傷其基部，轉移到新的生根培養基上培養，10天后大多數植株產生根系。生根苗洗去培養基后，移栽到以蛭石為栽培介質的花盆中生長。植株在自然光照下生長，日溫 22-28°C，夜溫15-21°C，隔天澆灌1/2濃度的種子萌發培養基的無機鹽成分。生長2周左右，移植苗產生發達根系，然后定植于田間。5)轉基因植株的抗性檢測和選擇利用取移栽成活植株的葉片進行分子生物學檢測確定轉基因植株。將轉基因植株套袋自交結實。取種子播種在砂盆中，用0. 7% NaCl水溶液進行連續澆灌30天，將存活小苗移栽到大田，待植株長大后套袋自交結實。對其下一代繼續進行分子生物學鑒定和甘氨酸甜菜堿含量測定，擇優套袋自交留種。對轉基因純合株系分別進行耐鹽、耐旱性檢測，并套袋自交繁種，獲得抗逆性比未轉基因自交系顯著提高的轉基因自交系。后者可用于配制玉米耐鹽耐旱雜交種。
6)轉基因玉米的耐鹽、耐旱性檢測及利用將轉ApGSMT2d/ApDMT2d基因的純合玉米植株套袋自交，種子播種在砂盆中，澆灌 0. 8% NaCl水溶液，并以未轉基因自交系種子為對照。轉基因植株的不同株系在鹽水澆灌下表現出不同的耐鹽性，多數轉基因的株系表現出比對照明顯提高的耐鹽性，半數以上株系的5葉期成活率在70%以上，而對照自交系種子很少出苗，出苗后也逐漸死亡，5葉期的成活率不到10%。實時定量RT-PCR檢測表明轉基因表達強度高，在未轉基因植株中無檢測信號。挑選出耐鹽性優異的轉基因植株套袋自交純合，并進行配合力測定，選擇配合力與供體自交系相同或有提高的轉基因自交系用于耐鹽玉米雜交種選育。將轉ApGSMT2/ApDMT2基因的純合玉米植株的種子和未轉基因的對照自交系的種子播在的花盆中，分別在苗期(3-7葉期)、雌雄穗發育期(9-13葉期)、開花授粉期進行干旱脅迫處理，檢測干旱處理對玉米生長發育的影響、細胞膜受損程度、單株產量及其它經濟性狀和生理指標的差異等。綜合多方面的測試結果，轉基因的玉米比對照植株表現出明顯提高的耐旱性。選出耐旱性優異的轉基因植株套袋自交純合，并進行配合力測定，選擇配合力與供體自交系相同或有提高的轉基因自交系用于玉米單交種選育。實施例2 :ApGSMT2d、ApDMT2d基因的合成和玉米轉基因抗逆材料的創造l)ApGSMT2d、ApDMT2d基因的合成和植物表達結構的構建選用禾谷類植物及玉米的偏愛密碼子取代部分ApGSMT2和ApDMT2的密碼子，人工合成ApGSMT2d和ApDMT2d基因。然后與RD29啟動子連接構建融合基因，將后者重組到植物表達載體PCPE中，產生pCPE-ApGSMT2d-ApDMT2d。將重組質粒導入根癌農桿菌中用于遺傳轉化。2)玉米無菌苗的獲得套袋獲取玉米骨干自交系如鄭58、齊319、昌7-2等種子，用70%乙醇浸泡10分鐘，再用0. I %氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子， 以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內萌發，瓶內放入少量無菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30°C )下1-2天。待種子萌動(露白) 后，將其放在改良MS培養基上，在黑暗條件下繼續萌發。待胚芽伸長至3-5厘米時，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐。3)農桿菌培養及活化將帶有雙元載體(Mini-Ti質粒即為pCPE-ApGSMT2d-ApDMT2d，該質粒帶有除草劑草甘膦抗性基因epsps)的根癌農桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養基中 28°C震蕩培養，震蕩速率為110r/min，使細菌處于對數生長期。然后在3000r/min下離心10 分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養基洗滌，離心收集。再將菌體用添加IOOmg/ L乙酰丁香酮的1/2MS改良液體培養基懸浮，稀釋5-10倍用于轉化。4)玉米無菌苗轉化。A.把菌液倒在4. 5厘米直徑的培養皿中，傾斜培養皿，將露出莖尖生長錐的無菌苗頂端浸泡在菌液中2-5分鐘(AGL15分鐘，LBA44049分鐘)。B.浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，將根部插入改良MS培養基中于黑暗中培養2-3 天，培養溫度為22-24°C，然后將無菌苗放在散射光下培養2天。C.將照光培養后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石和下層壤土的花盆中，蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28°C，夜溫18-23°C，隔天澆灌1/2改良MS
培養基無機鹽。5)轉化植株篩選與定植轉化植株長出3片葉后，噴灑草甘膦水溶液，以未轉化植株為對照。噴灑量以植株不掉液滴為宜。對照植株在噴灑后3天停止生長，15天左右開始死亡。轉化處理后的植株， 一些個體的變化與對照植株相似，另一些個體則持續生長，無明顯變化。存活植株長到5葉期，將其定植到田間。6)轉基因植株的鑒定、管理和后代分析抗除草劑植株生長到7-8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測外源基因，對 PCR陽性植株進行Southern blotting驗證和RT-PCR檢測。轉基因植株開花后套袋自交或姊妹交結實。種子播種在大田或溫室，植株長到4-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測是否帶有外源基因，對PCR陽性植株進行Southern blotting檢測和RT-PCR檢測，從中選出轉基因植株。同時對轉基因植株進行套袋自交留種，分析下一代中轉基因個體的比例，選出轉基因純合系。7)轉基因植株的抗逆性測定選轉基因純合株系用于測定，以非轉基因自交系為對照。轉基因植株種子和對照種子同期播種，分別播種于大小一致、土量相等的花盆中，使植株處于適宜生長季節。植株生長環境和管理方法一致。種于花盆的玉米植株長至10葉期后，控制每天澆水量(約 600ml)，使土壤中相對含水量保持在15-16%左右，白天9-16時期間植株葉片萎蔫，夜晚葉片恢復伸展，持續處理2周，然后恢復正常澆水。恢復正常澆水一周后植株抽雄。再將花盆分開放置，以使植株自交結實。收獲成熟果穗和莖葉，烘干后測定生物量和籽粒產量。將植株控制澆水第2天(葉片在上午9時左右開始萎蔫)記為干旱脅迫處理第0天，分別在處理的第0、1、5、10、14天和恢復正常澆水后第7天取材，采用常規的植物生理學方法測定與抗逆相關的各項生理指標。并對雌雄穗發育情況、植株高度、籽粒重、花粉活力等進行觀測。 將部分10葉期植株停止澆水，觀察連續干旱對植株生長發育和存活率的影響。在整個試驗過程中，植株處于自然光照和溫度下生長，控水處理期間避免植株受到雨淋。在正常生長條件下，轉基因植株和對照植株的生長發育和形態特征無顯著差異。 經干旱脅迫處理后，轉基因植株和對照植株在株高、雄穗分枝數、開花散粉時間、散粉-吐絲間隔時間、花粉活力、果穗長度、百粒重等性狀均出現明顯差異。未轉基因植株雄穗分枝數少、雄蕊發育不良、花粉敗育、散粉-吐絲間隔時間長、單株籽粒產量低，而轉基因植株表現出明顯提高的耐旱性，花粉發育正常，單株籽粒產量明顯高于對照的。即轉基因植株在干旱處理過程中生長發育較正常，具有明顯增強的耐旱性。測定葉片相對含水量，可溶性總糖含量，離子滲漏率，丙二醛含量，脯氨酸含量等生理指標，表明在干旱脅迫下轉基因植株葉片相對含水量比對照植株降低的慢，保水能力較強；離子滲漏率和丙二醛含量表明轉基因植株葉片細胞膜損傷較小，可溶性糖及脯氨酸含量明顯高于對照植株的，說明轉基因植株在干旱脅迫下可能是通過積累較多的滲透保護性物質來維持正常代謝。對苗期玉米澆灌0. 8%的鹽水，轉基因植株的耐鹽性明顯高于未轉基因對照植株。 測定苗期植株在鹽處理條件下地上部分及地下部分鮮重、干重等發現，轉基因植株生長發育正常，未出現生長遲緩、植株矮化等情況。
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本實施例創造出了耐旱耐鹽性顯著提高的轉基因玉米材料。實施例3、ApTpGSMT2d、ApTpDMTd2基因的構建和玉米轉基因抗逆材料的創造l)ApTpGSMT2d、ApTpDMTd2基因的合成和植物表達結構的構建為了使ApGSMT2和ApDMT2在玉米細胞內高效表達，并實現甘氨酸甜菜堿在葉綠體 (質體)內的積累，將ApGSMT2d和ApDMT2d基因分別與定位葉綠體蛋白的導肽(transit peptide)編碼區融合，使ApGSMT2和ApDMT2蛋白在合成后定位于葉綠體(質體)中，催化在葉綠體內合成大量的甘氨酸甜菜堿。依據已報道的擬南芥RUBISC0小亞基基因序列設計PCR引物，從擬南芥中克隆出RUBISC0小亞基的導肽編碼區，測序驗證后分別連接到ApGSMT2d基因和ApDMT2d基因開放讀碼框的5'端，產生融合基因，即ApTpGSMT2d和 ApTpDMT2d基因。然后用構建的融合基因分別取代質粒pCUA-ApGSMT2d-ApDMT2d-印sps中的 ApGSMT2d 和 ApDMT2d，產生植物遺傳轉化結構 pCUA-ApTpGSMT2d_ApTpDMT2d-印sps。采用凍融法將重組質粒導入根癌農桿菌中用于玉米遺傳轉化。2)玉米轉基因植株的產生和轉基因純合株系的抗逆性測定同實施例2，獲得了抗旱耐鹽性顯著提高的轉基因玉米材料。實施例4、ApTpGSMT2dm、ApTpDMT2dm基因的構建和玉米轉基因抗逆材料的創造l)ApTpGSMT2dm、ApTpDMTd2m基因的合成和植物表達結構的構建本實驗室工作發現，在玉米遭受嚴重干旱或鹽脅迫時，線粒體功能大幅度降低， 提高線粒體在細胞遭受脅迫時的工作效率，有利于提高玉米的抗逆性。為了使ApGSMT2 和ApDMT2在玉米細胞內高效表達，并實現甘氨酸甜菜堿在線粒體內的區域化積累，將 ApGSMT2d和ApDMT2d基因分別與定位線粒體蛋白的導肽(transit peptide)編碼區融合, 使ApGSMT2和ApDMT2蛋白合成后定位于線粒體中，在線粒體內積累較多的甘氨酸甜菜堿。 依據已報道序列設計PCR引物，從玉米幼葉中克隆出檸檬酸合成酶基因的導肽編碼序列， 測序驗證后分別連接到ApGSMT2d基因和ApDMT2d基因開放讀碼框的5’端，產生融合基因， 即ApTpGSMT2dm和ApTpDMT2dm基因。然后將構建的融合基因重組到帶有脅迫誘導型啟動子RD29的DATEWAY入門載體中，由RD29分別啟動其表達。再通過定點重組將融合基因重組到DATEWAY植物表達載體中，產生質粒pZH-ApTpGSMT2dm-ApTpDMT2dm-epsps。采用凍融法將該質粒導入根癌農桿菌中用于玉米遺傳轉化。2)玉米轉基因植株的產生和轉基因純合株系的抗逆性測定同實施例2，獲得了抗旱耐鹽性顯著提高的轉基因玉米材料，但材料抗性提高幅度小于實施例2和實施例3產生的轉基因純合株系。實施例5、ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2共同導入創造玉米抗逆育種新材料為了使ApGSMT2和ApDMT2在玉米細胞內高效表達，實現甘氨酸甜菜堿既在葉綠體 (質體)中又在細胞質中的積累，同時避免轉基因沉默發生的機率，并預防甘氨酸甜菜堿細胞質中過高濃度的積累引起植株生長變慢，因此，一方面將ApGSMT2和ApDMT2基因分別與定位葉綠體蛋白的導肽(transit peptide)編碼區融合,促使合成的ApGSMT2和ApDMT2蛋白定位于葉綠體(質體)中，在葉綠體內積累大量甘氨酸甜菜堿；另一方面將ApGSMT2d和 ApDMT2d基因分別與脅迫誘導型啟動子融合，實現在脅迫條件下轉基因產物在胞質中大量積累。
l)ApTpGSMT2、ApTpDMT2基因的合成和植物表達結構的構建利用已克隆的擬南芥中RUBISC0小亞基基因的導肽編碼區，分別連接到ApGSMT2 基因和ApDMT2基因(不用ApGSMT2d和ApDMT2d序列，減少轉基因沉默事件發生)開放讀碼框的5’端，產生融合基因，即ApTpGSMT2和ApTpDMT2基因。采用常規的分子生物學技術，將ApTpGSMT2d和ApTpDMT2d基因、ApGSMT2d和 ApDMT2d分別重組到GATEWAY A門載體中，分別與不同的植物啟動子和基因3 ’尾巴區融合， 形成適合在禾谷類作物中表達的融合基因，其中ApGSMT2d和ApDMT2d基因分別與脅迫誘導的啟動子RD29連接，ApTpGSMT2和ApTpDMT2分別與組成型啟動子Ubiquitin相連。然后通過定點重組導入以GATEWAY植物表達載體為基礎的多基因轉化載體中，產生質粒pZH-Ap GSMT2d-ApDMT2d-ApTpGSMT2-ApTpDMT2-epsps。采用凍融法將多基因轉化載體導入根癌農桿菌中用于玉米等作物遺傳轉化。2)玉米轉基因植株的產生和轉基因純合株系的抗逆性測定同實施例2，獲得了抗旱耐鹽性顯著提高的轉基因玉米材料，后者的抗逆性顯著優于實施例2和實施例3產生的材料。實施例6、轉ApTpGSMT2、ApTpDMT2基因創造棉花抗逆育種新材料I)植物表達結構和農桿菌培養植物表達載體的構建和農桿菌培養及活化同實施例I。農桿菌菌株為LBA4404。2)棉花無菌苗獲得取棉花優良品種或恢復系的種子，用濃硫酸脫去表面絨毛，70%乙醇浸泡I分鐘， 再用0. I %氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內萌發，瓶內放入少量無菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30°C)下1-2天。待種子萌動(露白)后， 將其放在銨鹽減半的改良MS培養基上于黑暗條件下萌發。待胚軸伸長至3-5厘米時，剝去一片子葉，露出莖端生長錐。3)棉花無菌苗轉化(I)將農桿菌菌液浸涂在解刨針刺傷的莖尖生長錐上，并在其上覆蓋用農桿菌液浸濕的棉球，然后在暗中培養2-3天,培養溫度為24-26°C。再將無菌苗放在散射光下培養 2天。(2)將照光培養后的無菌苗移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，讓植株在自然光照下生長，日溫22-28°C，夜溫18-23°C，隔天澆灌1/2改良MS培養基無機鹽。4)轉化植株篩選與定植轉化植株長出3片葉后，噴灑除草劑草甘膦(濃度因品種而異)水溶液，以植株不掉液滴為宜。未轉化的對照植株在噴灑后3天停止生長，12天左右開始死亡。轉化植株在噴灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體表現很強的抗性，持續生長。存活植株長到5葉期時，將其定植到田間。5)抗除草劑植株的分子生物學鑒定抗除草劑植株長到7-8葉時，從第3-4片葉上取樣，混合后提取DNA，采用PCR技術檢測外源基因。收獲PCR陽性植株的種子(自交)，種植后在3-4葉期時噴灑除草劑草甘膦篩選，存活植株取葉片提取DNA進行PCR檢測，陽性植株進行Southern blotting驗證和RT-PCR檢測。轉基因植株自交結桃，收獲種子繼續種植。T2代植株仍在3-4葉期時噴灑除草劑草甘膦，統計存活植株和死亡植株比例，結合上代Southern blotting結果,確定轉基因能否穩定遺傳，并從中選出目標基因表達強度高的轉基因純合株系。然后進一步采用實時定量RT-PCR技術和甘氨酸甜菜堿含量測定技術分析不同轉基因中轉基因表達強度和甘氨酸甜菜堿含量，選擇適宜株系進行抗性分析試驗。6)轉基因植株的抗性鑒定和利用取純合的轉基因植株的種子，播種在花盆中，植株2葉期時進行低溫處理，通過存活率統計和生理指標測定，篩選出耐冷株系，用于生產。將轉基因株系的種子播在砂盆中，用0. 7% NaCl水溶液進行連續澆灌30天，將存活小苗移栽到大田，待植株長大后套袋自交結實。對其下一代繼續進行分子生物學鑒定和耐鹽性檢測，并套袋自交純合，獲得了耐鹽品種。將轉基因株系的植株分別在苗期(5葉期)、蕾期和開花期進行干旱脅迫試驗，測定相關的生理指標分析，確定植株耐旱性。5葉期棉花幼苗在含有12% PEG-6000的Hogland 營養液中處理，24小時后野生型植株的葉片失水嚴重，植株嚴重萎蔫，而轉基因植株葉片較伸展，植株未發生萎蔫或程度較輕，轉基因植株的葉片相對含水量顯著高于野生型的，凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率都顯著高于野生型的。滲透脅迫降低了棉花幼苗細胞的溶質勢，其中轉基因植株細胞的溶質勢降低較多，生理學研究表明，在干旱脅迫條件下，細胞中積累了更多的溶質，增強了細胞吸取水分和持水能力，從而有利于植株保持正常形態和細胞膨壓。棉花在花盆中生長至蕾期時，一次性澆足水后停止澆水，進行干旱脅迫處理。在蕾期干旱脅迫8天后，轉基因植株的葉片甜菜堿含量顯著高于野生型植株的，葉片失水速度明顯比對照緩慢，葉片萎蔫晚，葉片細胞膜離子滲漏率和丙二醛含量顯著低于野生型植株， 說明細胞膜損傷和膜脂過氧化程度都較輕。另外，轉基因植株的葉綠素含量和過氧化物岐化酶(SOD)活性在干旱脅迫處理中也較高。干旱脅迫后轉基因植株的分支數比野生型對照多15% _26%，單株開花數比野生型對照多10% _20%，單株籽棉產量下降幅度明顯小比野生型對照。相關性分析得出，轉基因棉花單株籽棉產量與甜菜堿水平呈顯著正相關。這些結果表明，甜菜堿水平的增加能大大提高轉基因棉花的耐旱性，轉基因棉花抗旱性的提高不僅是由于脅迫條件下甜菜堿對細胞膜穩定性和完整性的保護作用，而且也要歸功于甜菜堿的積累提高了轉基因植株的滲透調節能力。實施例7、轉ApTpGSMT2d、ApTpDMT2d基因創造小麥抗逆育種新材料I)植物表達結構和農桿菌培養植物表達結構同實施例3。農桿菌培養及活化同實施例I。農桿菌菌株為LBA4404。2)小麥無菌苗獲得和轉化小麥優良品種濟麥20、濟麥22等的種子，分別用70%乙醇浸泡1_3分鐘，再用
0.I %氯化汞浸泡8-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內萌發，瓶內放入少量無菌水于黑暗條件 (20-250C )下1-2天。待種子萌動(露白)后，將其放在改良MS培養基上于黑暗條件下萌發。待胚芽伸長止3-4厘米時，用解剖刀剝去胚芽鞘及1-2片幼葉，暴露出芽尖，再用解剖刀從中部縱向切傷莖尖生長點。切傷莖尖生長點的無菌苗(萌發種子)用于農桿菌轉化。 將菌液倒在4. 5厘米直徑的培養皿中，傾斜培養皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大氣壓下處理6-10分鐘。浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，萌發種子放在附加200mg/l谷氨酰胺的改良MS培養基上于黑暗中培養2-3天，培養溫度為22_24°C。 然后將無菌苗放在散射光下培養2天。將照光培養后的無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28°C，夜溫 15-21 °C，隔天澆灌1/2改良MS培養基無機鹽。3)轉化植株篩選、定植和分子檢測轉化植株長出3片葉后，噴灑除草劑草甘膦水溶液，濃度為0. 12% Roundup (41% 草甘膦異丙胺鹽)，以植株掉液滴為宜。未轉化對照植株在噴灑后6天后停止生長，15天左右開始死亡。轉化植株在噴灑后，一些個體變化同對照植株相似，另一些個體持續生長，變化不明顯。待存活植株長到7-8葉時，將其定植到田間，并促進分蘗。抗除草劑植株經春化處理后，在起身一拔節期取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測轉化植株。在獲得的抗除草劑植株中，約20%左右為PCR陽性個體。后者自交結實，分穗收獲。4)轉基因植株后代鑒定和分析通過春化階段(低溫處理條件因品種而異)的植株在長日照下起身、拔節、開花結實。轉基因植株產生的種子，在浸水萌動后放冰箱(0-2°C )中進行春化處理30-65天。部分春化處理后的種子用0. 12% Roundup水溶液處理，觀察統計抗性和敏感性個體比例，存活小苗播入花盆；另一部分春化處理后的種子播種在大田和砂盆，分別進行干旱脅迫處理和高鹽脅迫處理，篩選耐旱和/或耐鹽轉基因植株。提取抗除草劑植株及耐鹽和抗旱植株的葉片DNA，采用PCR技術檢測外源基因。PCR陽性植株拔節后取上部葉片提取DNA進行 Southern blotting驗證。轉基因植株自交結籽,下代繼續種植,繼續在植株3_4葉期時噴灑除草劑草甘膦，統計存活植株和死亡植株的比例，結合上代Southern blotting結果,確定轉基因能否穩定遺傳，并從中選擇轉基因純合系。結合實時定量RT-PCR和甘氨酸甜菜堿含量測定獲得的結果，選擇適宜株系進行抗逆性測定。獲得轉基因純系后直接用于小麥育種或進入安全性中間試驗和環境釋放試驗。5)轉基因小麥的抗旱性分析出苗及苗期是小麥對缺水的敏感時期之一，此階段干旱影響小麥出苗率和分蘗數，可對產量造成很大影響。將轉基因株系和對照植株的種子分別在含O、10%、15%、20%、 25% (W/V)PEG-6000的MS無機鹽溶液中萌發，統計萌發率、根長和芽長，發現在25% (W/V) PEG-6000滲透脅迫條件下，轉基因株系的種子萌發比對照早，芽和根的長度也分別大于未轉基因的，且差異達到顯著性水平。對盆栽的小麥幼苗進行持續干旱處理，觀測植株形態差異并測定地上和地下部分的生物量。轉基因植株在干旱處理中生長較好，根系發達，生物量顯著高于對照植株的。不同轉基因株系的耐旱性有一定差異，耐旱性最好的轉基因株系在脅迫處理25天時地上和地下部分的生物量分別比對照植株高60%和40%左右。干旱脅迫條件下，轉基因株系的葉片相對含水量較高、較伸展，萎蔫程度低，葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率分別比對照顯著高。干旱脅迫降低了小麥幼苗細胞的溶質勢，提高了細胞可溶性糖和脯氨酸含量。其中轉基因植株細胞的溶質勢降低幅度較大，可溶性糖和脯氨酸的積累量顯著高于野生型的。干旱脅迫條件下，轉基因細胞中較多的可溶性物質積累有利于細胞吸水和維持正常的膨壓。轉基因株系葉片細胞離子滲漏率和MDA含量均顯著低于對照植株的，說明轉基因株系的細胞膜損傷和膜脂過氧化程度較輕。轉基因植株的過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(POD)活性在干旱脅迫處理中也高于對照植株的，表明轉基因植株在干旱脅迫條件下有較強的抗過氧化能力。這些結果提示甘氨酸甜菜堿具有提高膜穩定性和穩定酶活性的作用。這些結果表明甘氨酸甜菜堿的過量積累在轉基因小麥細胞的滲透調節和減輕自由基傷害中發揮了重要作用，提高了轉基因植株抗旱能力。實施例8、共轉化ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2基因創造大豆抗逆育種新材料I)植物表達結構和農桿菌培養植物表達載體、農桿菌培養及活化同實施例5。農桿菌菌株為LBA4404。2)大豆無菌苗獲得和農桿菌培養及活化取優良品種的種子，用70%乙醇浸泡2-3分鐘，用0. I %氯化汞浸泡10-12分鐘， 然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌期間不斷晃動種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子放在無菌三角瓶內萌發，瓶內放入少量無菌水(50-60毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗條件(23-30°C )下2-3天。待種子萌動后，將其放在改良B5培養基上于黑暗條件下萌發。待胚軸長至3-5厘米時，剝去子葉并露出莖端生長錐。將帶有目的基因表達結構的的根癌農桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP 培養基中28°C下震蕩培養，震蕩速率為110r/min，使細菌處于對數生長期。然后3000r/min 下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良B5液體培養基(即改良B5培養基基本成分減半)洗滌，再離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2改良B5液體培養基懸浮，稀釋5-10倍用于轉化。3)大豆無菌苗轉化(I)將菌液倒在4. 5厘米直徑的培養皿中，傾斜培養皿，使露出莖尖生長錐的無菌苗頂端浸泡在菌液中3-6分鐘。(2)浸染后的芽尖用無菌濾紙吸干，把小苗根端插入改良B5培養基上于黑暗中培養3-4天，培養溫度為20-23°C。(3)將無菌苗移栽到鋪有上層蛭石下層壤土的花盆中，頂部覆蓋蛭石，長日照(16 小時/天)下生長，日溫23-28°C，夜溫20-25°C，隔天澆灌1/2改良B5培養基無機鹽。4)轉化植株篩選與定植轉化植株長出3片葉后，噴灑0. 12% Roundup水溶液處理，以植株不掉液滴為宜， 未轉化的對照植株在噴灑后6天停止生長，15天左右開始死亡。轉化植株在噴灑后，一些個體的變化與對照植株相似，另一些個體持續生長，變化不明顯。存活植株長到5葉期，將其定植到田間。抗除草劑植株生長到7-8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術檢測外源基因。PCR 陽性植株保留結實。5)轉基因植株后代的分子生物學鑒定轉基因植株產生的種子，播種在大田或溫室。植株3-4葉期時取葉片提取DNA進行PCR檢測轉基因ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2。取PCR陽性植株葉片進行Southern blotting驗證,轉基因植株自交結實。子二代小苗(5葉期)噴灑0. 12% Roundup 水溶液后統計存活植株與死亡植株比例，對存活植株再進行PCR檢測，確定外源基因在子代植株中的分離比例。對轉基因純合株系進行實時定量RT-PCR檢測和甘氨酸甜菜堿含量測定，選擇轉基因表達強度高的株系用于檢測抗逆性。6)轉基因植株后代的抗逆性測定按常規的生理學方法和育種學方法進行。實施例9、通過轉基因聚合的方法實現甘氨酸甜菜堿在細胞不同區域的分布創造高抗逆性材料I)轉基因聚合產生玉米高抗逆性自交系將來自同一基因型(自交系)的分別轉ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ ApTpDMTd2、ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的玉米植株雜交，分別產生帶有ApGSMT2d/ ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 基因的植株、帶有 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ ApTpDMT2dm 基因的植株、帶有 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 基因的植株。然后對轉基因聚合植株進行連續自交、選擇，獲得轉基因純合系。也可將不同轉基因植株與轉基因聚合植株進行再次雜交，通過自交和選擇獲得攜帶不同轉基因的自交系，如攜帶 ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 基因的玉米自交系，實現細胞內不同重要功能區在逆境脅迫條件下都積累有較高水平的甘氨酸甜菜堿的目標。轉基因玉米的雜交、自交和選擇方法同玉米常規育種，但需要在轉基因玉米隔離區進行。并且在轉基因聚合植株的自交世代中，需采用PCR方法檢測所有靶基因是否存在，只選留那些帶有全部靶基因的個體。各個靶基因的PCR引物一條對應于基因的編碼區，一條對應于啟動子區域，具有良好的特異性。轉基因聚合材料的抗逆性測定方法同實例2。2)轉基因聚合小麥抗逆新材料產生將來自同一品種的分別轉ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的小麥植株雜交，分別產生攜帶轉基因ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 的植株、轉基因 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 的植株、轉基因ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2和ApTpGSMT2dm、ApTpDMT2dm的植株。然后對轉基因聚合植株進行連續自交、選擇，獲得轉基因純合系。也可將不同轉基因植株與轉基因聚合植株進行再次雜交、自交和選擇，獲得攜帶不同靶基因的轉基因聚合株系。轉基因小麥的雜交、自交和選擇方法同小麥常規育種，但需要在轉基因小麥隔離區進行。并且要采用PCR方法檢測轉基因聚合植株自交后代中靶基因是否都存在，只選留那些帶有全部靶基因的個體自交純合。轉基因聚合材料的抗逆性測定方法同實施例7。3)轉基因聚合產生棉花抗逆新材料將來自同一品種或恢復系的分別轉ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的棉花植株雜交，分別產生攜帶轉基因ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 的植株、轉基因 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 的植株、轉基因ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2和ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm的植株。然后對轉基因聚合植株進行連續自交、選擇，獲得轉基因純合系。也可將不同轉基因植株與轉基因聚合植株進行再次雜交、自交和選擇，獲得攜帶不同靶基因的轉基因聚合株系。轉基因棉花的雜交、自交和選擇方法同棉花常規育種，但需要在轉基因棉花隔離區進行，并且要采用PCR方法檢測轉基因聚合植株自交后代中靶基因是否存在，只選留那些帶有全部靶基因的個體自交、選擇。轉基因聚合材料的抗逆性測定方法同實例6。4)轉基因聚合大豆抗逆新材料產生將來自同一品種的分別轉ApGSMT2d/ApDMT2d、ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的大豆植株雜交，分別產生攜帶轉基因ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2 的植株、轉基因 ApGSMT2d/ApDMT2d 和 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm 的植株、轉基因ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2和ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm的植株。然后對轉基因聚合植株進行連續自交、選擇，獲得轉基因純合系。也可將不同轉基因植株與轉基因聚合植株進行再次雜交、自交和選擇，獲得攜帶不同靶基因的轉基因聚合株系。轉基因大豆的雜交、自交和選擇方法同大豆常規育種，但需要在轉基因大豆隔離區進行，并且要采用PCR方法檢測轉基因聚合植株自交后代中靶基因是否存在，只選留那些帶有全部靶基因的個體自交、選擇。轉基因聚合材料的抗逆性測定方法見常規的抗逆育種方法。實施例10、利用轉ApGAMT2和ApDMT2及其派生基因的不同玉米自交系配制抗逆雜交種將具有優異雜種優勢的分別轉入ApGSMT2d/ApDMT2d、或ApTpGSMT2d/ApTpDMTd2、 或ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的不同玉米自交系雜交，產生分別攜帶父母本轉基因的雜交種子。后者可直接用于生產，即是生產上具有競爭優勢的轉基因抗逆雜交種。也可以轉ApGSMT2d/ApDMT2d和ApTpGSMT2/ApTpDMT2基因的自交系為雜交種的父本或母本，以轉 ApTpGSMT2dm/ApTpDMT2dm基因的另一自交系為雜交種的母本或父本，從而實現雜種細胞內不同重要功能區在逆境脅迫條件下都可積累有較高濃度甘氨酸甜菜堿的目標。轉基因玉米的雜種生產同玉米常規育種，但需要在轉基因玉米隔離區進行。轉基因雜交種的抗逆性測定方法參照實例2。
權利要求
1.一種藍細菌甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因在植物抗逆中的應用，其特征是所述基因為ApTpGSMT2d和ApTpDMT2d，是將ApGSMT2d和ApDMT2d分別與定位葉綠體蛋白的導肽編碼區融合，產生的轉基因表達產物定位于葉綠體/質體的融合基因，其中 ApTpGSMT2d產生的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示，ApTpDMT2d產生的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；所述應用的方法是采用轉基因技術將ApTpGSMT2d和 ApTpDMT2d基因分別或組合導入植物細胞中產生轉基因植株，利用轉基因聚合和多基因轉化方式獲得轉基因表達產物在細胞內不同區域分布和甘氨酸甜菜堿在脅迫誘導條件下局部積累的轉基因株系，從中選擇出抗逆性高于未轉基因對照的轉基因植物新材料。
2.如權利要求I所述的應用，其特征是所述ApGSMT2d和ApDMT2d基因是用禾谷類植物偏愛的密碼子代替ApGSMT2和ApDMT2在高等植物中出現頻率低的密碼子、人工合成獲得；其中所述ApGSMT2d的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，所述ApDMT2d的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 10 所不,所述 ApGSMT2 和 ApDMT2 是指從藍細菌 Aphanothece halophytica 中克隆出的甘氨酸甜菜堿合成途徑中的甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因ApGSMT2和二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶的基因ApDMT2，其中ApGSMT2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示， ApDMT2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
3.如權利要求2所述的應用，其特征是所述禾谷類植物是玉米。
全文摘要
本發明公開了一種甜菜堿合成途徑中的甲基轉移酶基因及其修飾和利用；其方法是從嗜鹽隱桿藻克隆出甘氨酸肌氨酸N-甲基轉移酶基因(ApGSMT2)和二甲基甘氨酸N-甲基轉移酶基因(ApDMT2)，用高等植物偏愛的密碼子取代ApGSMT2和ApDMT2中在高等植物中出現機率較低的密碼子產生基因ApGSMT2d和ApDMT2d基因，采用蛋白質定位導肽序列與甲基轉移酶基因融合的方法構建出編碼產物分別定位于葉綠體的系列基因。ApGSMT2以甘氨酸、肌氨酸為底物催化甘氨酸甲基化，ApDMT催化二甲基甘氨酸的甲基化，二者協同催化甘氨酸甜菜堿的合成。將ApGSMT2/ApDMT2或它們的修飾基因協同轉入玉米、小麥、棉花、大豆和煙草等作物，細胞積累了高濃度的甘氨酸甜菜堿，顯著提高植株的抗逆性。
文檔編號A01H5/00GK102604988SQ20121010487
公開日2012年7月25日 申請日期2009年9月9日 優先權日2009年9月9日
發明者何影, 何春梅, 張舉仁, 李坤朋 申請人:山東大學