專利名稱：一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域。
背景技術：
楊屬Populus L.在全世界約有100多種,廣泛分布于歐亞和北美洲。我國約有62種，是世界楊樹種質資源最多的國家。楊屬植物因其生長快、適應性強、用途廣泛，不僅在水土保持和維護生態平衡方面發揮重要作用，而且還具有廣泛的工業用途，是制漿造紙、膠合板、包裝材料等的重要原料。長期以來，楊樹的改良主要通過雜交育種的方式進行，但因其生長發育受光照、水分、溫度很多因素影響，與其它農作物和園藝植物比較，有許多特有的生物學特性，如較長的生長周期、復雜的生殖方式、高度雜合性等，使得傳統的楊樹育種方法已遠遠不能滿足現代育種的要求，所以，利用組織培養技術和基因工程方法來滿足實踐中對楊樹育種的要求具有重要的意義。進入二十世紀八十年代后，隨著分子生物學理論和技術的快速發展，以1983年首株轉基因煙草問世為標志，功能基因的克隆和轉基因技術已廣泛應用到植物抗性的研究領域。盡管以木本植物為實驗材料的林木基因工程因研究難度較大，進展相對滯后，但是由于楊樹生長速度快，易繁殖，核基因組(約420Mb)及染色體數目相對較小，易于通過農桿菌轉化，使得楊樹成為研究樹木分子生物學、林業生物技術及樹木基因組的模式植物。目前，在植物上應用的遺傳轉化方法主要有DNA直接轉移法和根癌農桿菌(Agrobactenium tumefaciens)介導法。其中后者最為常用，是目前應用最廣泛且結果較為理想、技術較為成熟的一種基因轉化方法。它具有操作簡便，外源基因插入一般為單拷貝或低拷貝，整合位點穩定，轉移DNA片段明確，整合后外源基因結構變異小，可轉移大片段DNA，可直接用不同的植物組織進行基因轉移等優點。已被應用于雙子葉植物的遺傳轉化研究，現有的轉基因植物如煙草擬南芥西紅柿玉米等，80%以上是通過這種方法獲得的。雖然目前對楊屬的遺傳轉化已逐步趨于深入，但是這些研究多應用于胡楊、歐洲黑楊、毛果楊、小葉楊等樹種，對白楊派及其雜種無性系的研究相對較少；而且目前所用的農桿菌介導法對白楊派并不適用。鑒于白楊派樹種具有適應生境廣、抗逆性強、鄉土樹種多、種間雜交能力強、能在大陸半干旱帶和大陸濕潤帶等廣泛生境范圍內栽培并可發揮較大的生產作用等獨特優勢，本研究以白楊雜種無性系717_1B4(P. tremulaXP. alba)為實驗對象，建立了一種農桿菌介導的基因轉化方法。
發明內容
本發明目的是提供一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法。本發明的技術方案概述如下一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，包括下述步驟(I)預培養
將717楊樹( P. tremulaXP. alba)腋芽或頂芽置于基本培養基上繼代繁殖，培養4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄置于Ml'培養基中，于24-26°C黑暗條件下預培養2-3天；(2)菌種活化與培養用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養基上，27-29°C倒置暗培養20-28h ;挑取培養后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養基上劃線，27-29°C倒置暗培養36-48h ；挑取單菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液體培養基的無菌試管中，150_200rpm27-29°C暗培養12-16h ;吸取0. 1-1. OmL菌液至含有抗生素的50_75mLYEB液體培養基的錐形瓶中，150-200rpm 27-29°C暗培養至 OD600 = 0. 6-0. 8 ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10_15min，棄去上清液，將沉淀用 50-75mL M 液重懸，24_26°C，80-100rpm 活化 0. 5_lh 得到侵染液；按 30-50 個25mL的比例將經步驟(I)預培養的莖段或帶有葉片的葉柄放入所述侵染液中，24-26°C條件下80-100rpm 侵染 30_60min ；(4)共培養從侵染液中取出莖段或帶有葉片的葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養基上，24-26 0C，暗條件下共培養2-3天；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養的莖段或帶有葉片的葉柄，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4-5min，洗滌2_3次，接著用濃度為350-500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌
4-5min,洗滌2_3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉移至CM延遲選擇培養基中，24-26°C暗培養10-11天，取出更換至新的CM延遲選擇培養基上繼續24-26°C暗培養10-11天，得到帶有愈傷組織的莖段或葉柄；(6)誘導不定芽將所述帶有愈傷組織的莖段或葉柄轉移至SIMa篩選培養基中，光照條件下進行培養，每15-20天更換一次培養基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養基中培養，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb篩選培養基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態的不定芽，轉移至含有SEM篩選培養基的組培瓶中進行伸長培養，培養2-4周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM培養基中，誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。步驟(I)中所述Ml'培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，生長素NAAI. 86mg,細胞分裂素 2ip I. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L。
步驟(2)中所述農桿菌為C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)時，所述抗生素為利福平(Rifampicin)、慶大霉素(Gentamicin)和壯觀霉素(spectinomycin),在YEB固體培養基或YEB液體培養基中利福平的濃度為25-50mg/L、慶大霉素的濃度為20_30mg/L、壯觀霉素的濃度為30-50mg/L。步驟⑶中所述M液的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，生長素NAA I. 86mg,細胞分裂素 2ip I. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，加水至 IL0步驟(4)中所述Ml固體培養基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，生長素NAAI. 86mg，細胞分裂素 2ip I. 02mg,pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，瓊脂 7-7. 2g，加水至IL0步驟(5)中所述CM延遲選擇培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，生長素NAA1. 86mg, pH = 5. 6-5. 8，細胞分裂素 2ip I. 02mg,頭孢霉素 350_500mg，瓊脂 7-7. 2g，加水至1L。步驟(6)中所述SMa篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素TDZO. 05mg, pH = 5. 6-5. 8，頭孢霉素 350_500mg,潮霉素 B IOmg,瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L，所述光照條件下進行培養的培養條件為培養溫度22-26°C，光照1500-20001UX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。步驟(6)中所述SMb篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素TDZO. 0022mg,頭孢霉素 350_500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L。步驟(7)中所述SEM篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素BAPO. 05mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 1L。步驟⑶中所述RM培養基的組成為MS鹽2. 2g，蔗糖20_30g，頭孢霉素350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0本發明提供了一種高效的用于雜交楊樹轉化的方法，NAA和2ip聯合作用誘導經農桿菌介導的莖段或葉柄產生愈傷組織，在細胞分裂素TDZ作用下，促使愈傷再分化形成不定芽，呈玻璃化狀態的幼芽在BAP誘導下伸長，形態逐漸趨于正常，具有抗性的再生楊樹在含有抗生素潮霉素的1/2MS培養基中生根。本方法獲得的抗性轉基因楊樹，周期短，轉化效率高，為轉基因楊樹在實踐中的育種提供了堅實的基礎和理論支持。本發明可在短時間內選育出新雜交楊抗逆、抗蟲等新品種，為林木的遺傳改良提供了一個新途徑。
圖I侵染時間對717楊樹轉化效率的影響圖2乙酰丁香酮的濃度對717楊樹轉化效率的影響圖3延遲選擇時間對717楊樹轉化效率的影響圖4全基因組PCR檢測結果
具體實施方式
本發明的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，并不能對本發明作任何限制。下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例I一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，包括下述步驟(I)預培養 將717楊樹(P. tremulaXP. alba)腋芽置于基本培養基上繼代繁殖，培養4周獲得組培苗；切取組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2次造成傷口置于Ml'培養基中，于24°C黑暗條件下預培養2天；(2)菌種活化與培養用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平、慶大霉素和壯觀霉素的YEB固體培養基上，27°C倒置暗培養20h ;挑取培養后的農桿菌在另一含有與前面同樣的抗生素的YEB固體培養基上劃線，27°C倒置暗培養48h ；挑取單菌落至含有與前面同樣的抗生素2mLYEB液體培養基的無菌試管中，150rpm 27°C暗培養16h ;吸取0. ImL菌液至含有與前面同樣的抗生素的60mLYEB液體培養基的錐形瓶中，150rpm 27°C暗培養至OD600 = 0 . 7 ；在YEB固體培養基或YEB液體培養基中利福平的濃度為50mg/L、慶大霉素的濃度為30mg/L、壯觀霉素的濃度為30mg/L ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500rpm離心15min，棄去上清液，將沉淀用60mL M液重懸，240C，90rpm活化30min得到侵染液；按50個25mL的比例將經步驟⑴預培養的莖段放入所述侵染液中，24°C條件下90rpm侵染30min ；(4)共培養從侵染液中取出莖段，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養基上，24V，暗條件下共培養2天；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養的莖段,先用去離子水在180rpm下洗漆5min,洗漆2次,接著用濃度為500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌5min，洗滌2次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉移至CM延遲選擇培養基中，24°C暗培養11天，取出更換至新的CM延遲選擇培養基上繼續24°C暗培養10天，得到帶有愈傷組織的莖段；(6)誘導不定芽將所述帶有愈傷組織的莖段轉移至SMa篩選培養基中，光照條件下進行培養，每20天更換一次培養基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養基中培養，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb篩選培養基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態的不定芽，轉移至含有SEM篩選培養基的組培瓶中進行伸長培養，培養3周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM培養基中，誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹(見圖4)。
基本培養基1/2 MS，蔗糖25g，pH 5. 6，瓊脂7. 2g，余量為水。Ml'培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，生長素NAA I. 86mg,細胞分裂素2ipI. 02mg, pH = 5.6,瓊脂 7. 2g，加水至 1L。M液的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖25g,生長素NAA I. 86mg,細胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 6,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固體培養基的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖25g,生長素NAA 1.86mg,細胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. 2g，加水至 1L。CIM延遲選擇培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，生長素NAA I. 86mg, pH =5. 6，細胞分裂素2ip I. 02mg,頭孢霉素400mg,瓊脂7. 2g，加水至IL0SIMa篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，細胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 6，頭孢霉素400mg，潮霉素B IOmg,瓊脂7. 2g,加水至1L，所述光照條件下進行培養的培養條件為培養溫度24°C，光照15001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。SIMb篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，細胞分裂素TDZ 0. 0022mg,頭孢霉素400mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.6,瓊脂7. 2g，加水至IL0SEM篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖25g，細胞分裂素BAP 0. 05mg,頭孢霉素400mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.6,瓊脂7. 2g，加水至IL0RM培養基的組成為MS鹽2.2g，蔗糖25g，頭孢霉素400mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 6，瓊脂7. 2g，加水至1L。實施例2一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，包括下述步驟(I)預培養將717楊樹(P. tremulaXP. alba)頂芽置于基本培養基上繼代繁殖，培養5周獲得組培苗；切取所述組培苗的帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄，置于Ml'培養基中，于26°C黑暗條件下預培養3天；(2)菌種活化與培養用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平，慶大霉素和壯觀霉素的YEB固體培養基上，28°C倒置暗培養24h ;挑取培養后的農桿菌在另一含有與前面同樣的抗生素的YEB固體培養基上劃線，28°C倒置暗培養40h ；挑取單菌落至含有與前面同樣的抗生素的3mLYEB液體培養基的無菌試管中，180rpm 28°C暗培養14h ;吸取0. 5mL菌液至含有與前面同樣的抗生素的50mLYEB液體培養基的錐形瓶中，180rpm 28°C暗培養至OD6tltl = 0. 6 ；在YEB固體培養基或YEB液體培養基中利福平的濃度為25mg/L、慶大霉素的濃度為25mg/L、壯觀霉素的濃度為50mg/L ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3750rpm離心13min，棄去上清液，將沉淀用50mL M液重懸，260C，80rpm活化45min得到侵染液；按40個25mL的比例將經步驟⑴預培養的葉柄放入所述侵染液中，26°C條件下80rpm侵染45min ；(4)共培養從侵染液中取出葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養基上，26 °C，暗條件下共培養60h ；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養的葉柄,先用去離子水在200rpm下洗漆4min,洗漆3次,接著用濃度為350mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌4min，洗滌3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉移至CM延遲選擇培養基中，26°C暗培養10天，取出更換至新的CM延遲選擇培養基上繼續26°C暗培養11天，得到帶有愈傷組織的葉柄；(6)誘導不定芽將所述帶有愈傷組織的葉柄轉移至SIMa篩選培養基中，光照條件下進行培養，每17天更換一次培養基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養基中培養，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb篩選培養基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態的不定芽，轉移至含有SEM篩選培養基的組培瓶中進行伸長培養，培養2周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM培養基中，誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。基本培養基1/2MS，蔗糖20g，pH 5. 8，瓊脂7. lg，余量為水。Ml'培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，生長素NAA I. 86mg,細胞分裂素2ip
I.02mg, pH = 5. 8,瓊脂 7. Ig,加水至 1L。M液的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖20g,生長素NAA I. 86mg,細胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 8,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固體培養基的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖20g,生長素NAA 1.86mg,細胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 8,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. lg，加水至 1L。CIM延遲選擇培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，生長素NAA I. 86mg, pH =5. 8，細胞分裂素2ip I. 02mg,頭孢霉素350mg,瓊脂7. Ig,加水至IL0SIMa篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，細胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 8，頭孢霉素350mg，潮霉素B IOmg,瓊脂7. Ig,加水至1L，所述光照條件下進行培養的培養條件為培養溫度26°C，光照18001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。SIMb篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，細胞分裂素TDZ 0. 0022mg,頭孢霉素350mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.8,瓊脂7. Ig,加水至IL0SEM篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20g，細胞分裂素BAP 0. 05mg,頭孢霉素350mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.8,瓊脂7. Ig,加水至IL0RM培養基的組成為MS鹽2.2g，蔗糖20g，頭孢霉素350mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 8，瓊脂7. lg，加水至1L。 實施例3一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，包括下述步驟(I)預培養
將717楊樹(P. tremulaXP. alba)腋芽置于基本培養基上繼代繁殖，培養6周獲得組培苗；切取所述組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃3次造成傷口置于Ml'培養基中，于25°C黑暗條件下預培養3天；(2)菌種活化與培養用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平，慶大霉素和壯觀霉素的YEB固體培養基上，29°C倒置暗培養28h ;挑取培養后的農桿菌在另一含有與前面同樣的抗生素的YEB固體培養基上劃線，29°C倒置暗培養36h ；挑取單菌落至含有與前面同樣的抗生素的4mLYEB液體培養基的無菌試管中，200rpm29°C暗培養12h ;吸取ImL菌液至含有與前面同樣的抗生素的75mLYEB液體培養基的錐形瓶中，200rpm 29°C暗培養至OD6tltl = 0. 8 ；在YEB固體培養基或YEB液體培養基中利福平的濃度為30mg/L、慶大霉素的濃度為20mg/L、壯觀霉素濃度為40mg/L ；(3)侵染將步驟(2)獲得的菌液在室溫、4000rpm離心lOmin，棄去上清液，將沉淀用75mLM液重懸，250C，IOOrpm活化60min得到侵染液；按30個25mL的比例將經步驟⑴預培養的莖段放入所述侵染液中，25°C條件下IOOrpm侵染60min ；(4)共培養從侵染液中取出莖段，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養基上，25 0C，暗條件下共培養3天；(5)延遲選擇取出步驟(4)共培養的莖段，先用去離子水在220rpm下洗滌5min，洗滌2次，接著用濃度為500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌5min，洗滌2次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉移至CM延遲選擇培養基中，25°C暗培養10天，取出更換至新的CM延遲選擇培養基上繼續25°C暗培養11天，得到帶有愈傷組織的莖段；(6)誘導不定芽將所述帶有愈傷組織的莖段轉移至SIMa篩選培養基中，光照條件下進行培養，每15天更換一次培養基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養基中培養，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb篩選培養基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ；(7)伸長培養切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態的不定芽，轉移至含有SEM篩選培養基的組培瓶中進行伸長培養，培養4周，獲得表型趨于正常的芽；(8)誘導生根及檢測取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM培養基中，誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。基本培養基1/2MS，蔗糖30g，pH 5. 7，瓊脂7. Og，余量為水。Ml'培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg，細胞分裂素2ip
I.02mg, pH = 5. 7，瓊脂 7. Og,加水至 IL0
M液的組成為MS鹽4. 4g,鹿糖30g,生長素NAA I. 86mg,細胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 7,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固體培養基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg，細胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 7,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. 0g，加水至 1L。CIM延遲選擇培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg, pH =5. 7，細胞分裂素2ip I. 02mg,頭 孢霉素500mg,瓊脂7. Og,加水至IL0SMa篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 7，頭孢霉素500mg，潮霉素B IOmg,瓊脂7. Og,加水至1L，所述光照條件下進行培養的培養條件為培養溫度22°C，光照20001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。SMb篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ 0.0022mg，頭孢霉素500mg,潮霉素B IOmg, pH = 5. 7，瓊脂7. Og,加水至IL0SEM篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細胞分裂素BAP 0. 05mg,頭孢霉素500mg,潮霉素B IOmg, pH = 5. 7，瓊脂7. Og,加水至IL0RM培養基的組成為MS鹽2. 2g，蔗糖30g，頭孢霉素500mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 7，瓊脂7. 0g，加水至1L。上面各實施例所涉及的MS鹽(Duchefa Biochemie B. V.公司)各實施例中的YEB固體培養基牛肉浸膏5. Og/L、胰蛋白胨5. Og/L、酵母提取物
I.Og/L、蔗糖 5. 0g/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L、瓊脂 15g/L ；pH = 7. 0，余量為水。各實施例中的YEB液體培養基牛肉浸膏5. 0g/L、胰蛋白胨5. 0g/L、酵母提取物
I.0g/L、蔗糖 5. 0g/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L、pH = 7. 0，余量為水。實施例4 :不同外植體類型對717 (P. tremulaXP. alba)楊樹產生陽性抗性芽的影響本實驗采用717楊樹不帶腋芽的莖段，帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄，l_2cm2的葉片三種不同的組織作為農桿菌侵染的外植體材料。實驗步驟和條件均采用實施例I的步驟和條件，結果表明(表I)，在其它轉化條件相同的情況下，不同的外植體材料產生的抗潮霉素陽性再生芽的頻率不同，其中莖段的轉化效率最高，葉柄次之，但差異并不顯著，而由葉片產生的再生芽的頻率最低，幾乎沒有再生芽產生。因此本發明采用不帶腋芽的莖段，帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄作為合適的轉化受體材料，而不選用現有技術常用的葉片為轉化受體材料。這表明本發明中所建立的轉化體系適合莖段及葉柄的轉化，對以葉片作為外植體的轉化并不適用。表I不同受體材料對717楊樹產生抗性不定芽的影響
權利要求
1.一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征包括下述步驟 (1)預培養 將717楊樹腋芽或頂芽置于基本培養基上繼代繁殖，培養4-6周獲得組培苗；切取所述組培苗0. 8-1. 5cm不帶腋芽的莖段，用刀片沿著莖段縱軸方向劃2-3次造成傷口或切取所述組培苗的帶有0. 1-0. 5cm2葉片的葉柄置于Ml'培養基中，于24-26°C黑暗條件下預培養2-3 天； (2)菌種活化與培養 用移液槍槍頭挑取_80°C保存的農桿菌至含有抗生素的YEB固體培養基上，27-29°C倒置暗培養20-28h ;挑取培養后的農桿菌在另一含有抗生素的YEB固體培養基上劃線，27-29°C倒置暗培養36-48h ； 挑取單菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液體培養基的無菌試管中，150_200rpm27-29°C暗培養12-16h ;吸取0. 1-1. OmL菌液至含有抗生素的50_75mLYEB液體培養基的錐形瓶中，150-200rpm 27-29°C暗培養至 OD600 = 0. 6-0. 8 ； (3)侵染 將步驟(2)獲得的菌液在室溫、3500-4000rpm離心10_15min，棄去上清液，將沉淀用 50-75mL M 液重懸，24_26°C，80-100rpm 活化 0. 5_lh 得到侵染液；按 30-50 個25mL 的比例將經步驟(I)預培養的莖段或帶有葉片的葉柄放入所述侵染液中，24-26°C條件下80-100rpm 侵染 30_60min ； (4)共培養 從侵染液中取出莖段或帶有葉片的葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放在Ml固體培養基上，24-26 °C，暗條件下共培養2-3天； (5)延遲選擇 取出步驟(4)共培養的莖段或帶有葉片的葉柄，先用去離子水在180-220rpm下洗滌4-5min，洗滌2_3次，接著用濃度為350-500mg/L的頭孢霉素-去離子水溶液洗滌4_5min，洗滌2-3次，用無菌濾紙上吸干表面水分并轉移至CM延遲選擇培養基中，24-26°C暗培養10-11天，取出更換至新的CM延遲選擇培養基上繼續24-26°C暗培養10-11天，得到帶有愈傷組織的莖段或葉柄； (6)誘導不定芽 將所述帶有愈傷組織的莖段或葉柄轉移至SIMa篩選培養基中，光照條件下進行培養，每15-20天更換一次培養基；待長出綠色愈傷組織0. 2-0. 5cm2，取出綠色愈傷組織至新鮮SIMa篩選培養基中培養，待綠色愈傷組織表面開始長出不定芽；將帶有不定芽的綠色愈傷組織轉移到含有SIMb篩選培養基的組培瓶中，直到不定芽生長至l-2cm ； (7)伸長培養 切割留有少量愈傷組織的呈玻璃化狀態的不定芽，轉移至含有SEM篩選培養基的組培瓶中進行伸長培養，培養2-4周，獲得表型趨于正常的芽； (8)誘導生根及檢測 取步驟(7)獲得的芽，切去底部膨大部位，轉入RM培養基中，誘導生根，從已生根的再生楊樹上剪取葉片提取基因組DNA，并進行全基因組PCR檢測，驗證農桿菌基因轉化了的雜交楊樹。
2.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于步驟(I)中所述Ml'培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20-30g，生長素NAA 1.86mg，細胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
3.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于步驟(2)中所述農桿菌為C58/pMP90/pH 7GWIWG2(I)，所述抗生素為利福平、慶大霉素和壯觀霉素，在YEB固體培養基或YEB液體培養基中利福平的濃度為25-50mg/L、慶大霉素的濃度為20-30mg/L、壯觀霉素的濃度為30-50mg/L。
4.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于步驟(3)中所述M液的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，生長素NAA I. 86mg，細胞分裂素2ipI. 02mg, pH = 5. 6-5. 8,乙酰丁香酮 19. 86mg,加水至 1L。
5.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于步驟(4)中所述Ml固體培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20-30g，生長素NAA 1.86mg，細胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
6.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于步驟(5)中所述CM延遲選擇培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20-30g，生長素NAA I. 86mg, pH =5.6-5. 8，細胞分裂素2ip I. 02mg,頭孢霉素350_500mg,瓊脂7-7. 2g，加水至IL0
7.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于步驟(6)中所述SMa篩選培養基的組成為MS鹽4. 4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素TDZ O. 05mg, pH=5. 6-5. 8，頭孢霉素350-500mg，潮霉素B 10mg，瓊脂7-7. 2g，加水至1L，所述光照條件下進行培養的培養條件為培養溫度22-26°C，光照1500-20001uX，光照周期光照/黑暗為16h/8h。
8.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于在步驟(6)中所述SMb篩選培養基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20-30g，細胞分裂素TDZO. 0022mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
9.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于在步驟(7)中所述SEM篩選培養基的組成為MS鹽4.4g，蔗糖20_30g，細胞分裂素BAP O. 05mg,頭孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
10.根據權利要求I所述的一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，其特征在于在步驟(8)中所述RM培養基的組成為MS鹽2.2g，蔗糖20-30g，頭孢霉素350_500mg，潮霉素BIOmg, pH = 5. 6-5. 8，瓊脂 7-7. 2g，加水至 IL0
全文摘要
本發明公開了一種雜交楊樹的農桿菌基因轉化方法，包括下述步驟(1)預培養；(2)菌種活化與培養；(3)侵染；(4)共培養；(5)延遲選擇；(6)誘導不定芽；(7)伸長培養；(8)誘導生根及檢測。本發明提供的方法，NAA和2ip聯合作用誘導經農桿菌介導的莖段或葉柄產生愈傷組織，在細胞分裂素TDZ作用下，促使愈傷再分化形成不定芽，呈玻璃化狀態的幼芽在BAP誘導下伸長，形態逐漸趨于正常，具有抗性的再生楊樹在含有抗生素潮霉素的1/2MS培養基中生根。本方法獲得的抗性轉基因楊樹，周期短，轉化效率高，為轉基因楊樹在實踐中的育種提供了堅實的基礎和理論支持。
文檔編號A01H5/00GK102634541SQ20121010490
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者王旭, 王潔華 申請人:天津大學