專利名稱：用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法
技術領域：
本發明涉及一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法，屬于棉花轉基因育種技術領域。
背景技術：
目前棉花轉基因植株的鑒定方法有多種，其中對帶有II標記基因的轉基因后代材料進行的篩選，主要是在苗期利用卡那霉素溶液(Kanamycin)點涂植株幼葉，以幼葉是否變黃來判斷，為防止漏涂或涂抹不均勻而出現假陽性植株，需要在花鈴期以前對材料涂抹2 3次，因此從大量的轉基因材料中篩選出轉基因植株，工作量很大、準確性較差。李俊蘭(華北農學報，2003，18(2) : 118)曾報道用卡那霉素溶液通過浸種鑒定轉基因種子，但她篩選時的浸種時間較短(8h)，需要用很高濃度的卡那霉素(5000-7500mg/ L) 溶液，其成本很高，并且附加O. 2%吐溫的去離子水配制，也沒有說明種子量與卡那霉素溶液的比例關系，其判斷的指標為子葉加厚、葉色變深或子葉出現黃色斑塊，表現為判斷指標多、不單一，既有數量性狀又有質量性狀，掌握起來難度大、不易判斷出陽性植株，對推廣應用存在許多不利因素，并且通過浸種篩選以后，還要進行I 2次的用卡那霉素溶液點涂幼葉篩選，比較繁瑣并沒有完全擺脫用卡那霉素溶液點涂幼葉的方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術中的缺點，而提供一種成本低廉、操作簡單、過程標準化、準確可靠、容易掌握、出結果早的用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法。本發明解決其技術問題所采用的技術方案
一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法，其特征在于步驟如
下
(1)浸種處理
取轉化含有耶 - II標記基因的棉花種子，用濃度為1000-1500 mg/ 的卡那霉素溶液在24-26°C溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花種子；
(2)播種
將浸泡后的轉基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中或直接播種到蛭石中；
(3)篩選轉基因植株
當出苗3-5d后，根據棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉基因植株，將有白化斑的棉花苗即陰性植株拔除，棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽性植株；
(4)分子鑒定對上述第(3)步中篩選的陽性植株再通過PCR檢測進一步確認；
(5)移栽
將進一步確認后的陽性植株煉苗后移栽到田間。本發明的有益效果是成本較低、操作簡單、過程標準化、準確可靠、容易掌握、出結果早。
圖I為用卡那霉素溶液浸種處理的照片。圖2為篩選陽性植株(箭頭所示)和陰性植株的照片。圖3為陽性植株煉苗移栽后照片。
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圖4為篩選出的陽性植株的PCR檢測圖。圖5為對部分篩選出的陽性植株southern blot檢測圖。在圖5中，M為marker，CK+為質粒DNA，CK_為陰性對照，I 9為轉基因材料。
具體實施例方式實施例I :
一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法，步驟如下
(1)浸種處理
取轉化含有II標記基因的棉花種子，用濃度為1000 mg/ 的卡那霉素溶液在
24-26°C溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花種子；
(2)播種
將浸泡后的轉基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中或直接播種到蛭石中；
(3)篩選轉基因植株
當出苗3-5d后，根據棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉基因植株，將有白化斑的棉花苗即陰性植株拔除，棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽性植株；
(4)分子鑒定
對上述第(3)步中篩選的陽性植株再通過PCR檢測進一步確認；
(5)移栽
將進一步確認后的陽性植株煉苗后移栽到田間。實施例2:
實施例2與實施例I不同的是采用濃度為1500 mg/ 的卡那霉素溶液。實施例2的檢測準確率達100%。
權利要求
1.一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法，其特征在于步驟如下 (1)浸種處理 取轉化含有耶II標記基因的棉花種子，用濃度為1000-1500 mg/1的卡那霉素溶液在24-26°C溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花種子； (2)播種 將浸泡后的轉基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中或直接播種到蛭石中； (3)篩選轉基因植株 當出苗3-5d后，根據棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉基因植株，將有白化斑的棉花苗即陰性植株拔除，棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽性植株； (4)分子鑒定 對上述第(3)步中篩選的陽性植株再通過PCR檢測進一步確認； (5)移栽 將進一步確認后的陽性植株煉苗后移栽到田間。
全文摘要
本發明涉及一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉基因棉花的方法，技術要點如下取轉化含有nptⅡ標記基因的棉花種子，用濃度為1000-1500mg/l的卡那霉素溶液在24-26℃溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與轉基因棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸8-12粒轉基因棉花種子；將浸泡后的轉基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中；當出苗3d后，根據棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉基因植株，將有白化斑的轉基因棉花苗即陰性植株拔除，轉基因棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽性植株，然后進行分子鑒定和移栽。本發明的優點是成本較低、操作簡單、準確可靠、容易掌握、出結果早。
文檔編號A01H1/04GK102696477SQ201210233348
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者劉永偉, 呂孟雨, 孫果忠, 張俊敏, 張歡歡, 徐顯, 朱金勇, 楊帆, 柴建芳, 王海波, 石學萍, 董福雙, 趙和, 韓秋芬 申請人:河北省農林科學院遺傳生理研究所