可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法
【專利摘要】本發明涉及可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法。一種可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，包含以下步驟：(A)將牛樟菌接種至漂浮培養基的步驟；(B)進行初期避光培養的步驟，促使牛樟菌增生聚集成漂浮于液面的牛樟菌菌塊；(C)在避光且密閉的休眠溫度環境下進行休眠的步驟；(D)在避光的供氧環境下誘使牛樟菌菌塊的重新生長的步驟；及(E)重復循環該步驟(C)與該步驟(D)預定次數。通過上述漂浮培養方法設計，可使牛樟菌快速長出層疊狀類子實體形態的牛樟菌菌塊，且牛樟菌菌塊的三萜類含量高于一般固態培養方式，并適用于人工大量培養。
【專利說明】可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種真菌培養方法，特別涉及一種牛樟菌培養方法。
【背景技術】
[0002]由于牛樟芝所含有的三萜類成分已被證實對于人體免疫力的提升與許多癌癥的治療都具有療效，因此，有許多生技廠商開始投注大量研究資源開發牛樟芝相關醫藥品或保健品。
[0003]但是因為野生牛樟芝子實體取得不易，且價格昂貴，再加上野生牛樟芝子實體的三萜類不易萃取釋出，其萃取成本高。為取得大量牛樟芝三萜類成分，業者逐漸朝向實驗室培養方面進行研究，希望通過實驗室人工培養的方式，來大量培養生產牛樟菌，以萃取其三萜類成分。
[0004]目前的主要培養方式大多是米用固態培養方式，目的在于大量培養出牛樟菌菌絲體，然后再由這些菌絲體萃取出所需的三萜類成分，但是在進行固態培養時發現，牛樟菌菌絲在分散生長布滿固態培養基表面后，其生長速度就會開始減慢。且經研究發現，由牛樟菌菌絲體萃取出的三萜類成分含量，遠不及牛樟芝子實體萃取出的三萜類含量，因此，如何提高人工培養的牛樟菌三萜類含量，是目前牛樟菌相關產業正積極研究的方向。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種可提高人工培養的牛樟菌的三萜類含量的牛樟菌培 養法。
[0006]本發明可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，依序包含以下步驟:(A)將含有牛樟菌活性菌絲的培養載體接種至漂浮培養基的步驟，所述漂浮培養基包括含有牛樟木萃取液的營養液，及沉浸于該營養液中的固態營養基質團塊，該培養載體局部浸泡在營養液中，且部分牛樟菌活性菌絲外露于營養液液面上方，而部分牛樟菌活性菌絲局部浸泡在營養液中；(B)在供氧且適合牛樟菌生長的培養環境溫度條件下進行初期避光培養的步驟，促使外露于營養液液面上方的牛樟菌活性菌絲增生，而于該培養載體上聚集成局部外露于營養液液面上方的牛樟菌菌塊，且使該牛樟菌菌塊的部分活性菌絲增生附著于該固態營養基質團塊擷取養分；(C)在避光環境下進行休眠的步驟，密封培養環境而停止供氧，并將培養環境溫度調降至休眠溫度，誘使牛樟菌進入休眠期，并維持休眠期預定期間；(D)在避光環境下誘使牛樟菌重新生長的步驟，對該培養環境重新供氧，且將培養環境溫度調升至適合牛樟菌生長的溫度，誘使該牛樟菌菌塊位于液面上的孢子萌發生長成活性菌絲，并維持此生長期預定時間 '及(E)重復循環該步驟(C)與該步驟(D)預定次數。
[0007]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(A)的營養液液面會高出該固態營養基質團塊頂緣，該培養載體局部沉浸在營養液中，而疊靠于該固態營養基質團塊頂緣。
[0008]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(A)的漂浮培養基的營養液液面高出該固態營養基質團塊頂緣的距離范圍介于0.5-2cm之間。
[0009]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(A)中局部浸泡于營養液中的培養載體間隔位于該固態營養基質團塊旁側。
[0010]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(A)的漂浮培養基裝在培養容器中，該步驟(B)與該步驟(D)還會分別在牛樟菌的培養期期間，調控該培養容器所在的培養環境的濕度，使培養容器中的營養液保持局部浸泡該牛樟菌菌塊。
[0011]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(B)與該步驟(D)的培養環境溫度較佳范圍介于15-25°C之間。
[0012]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(C)的休眠溫度范圍介于4-10°C之間。
[0013]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(C)的休眠期時間為24小時以上。
[0014]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，該步驟(C)休眠期的較佳時間長度為72小時。
[0015]本發明所述可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，所述漂浮培養基由提供碳源與氮源的五谷雜糧，及枸杞、土肉桂、提供胡蘿卜素與維生素的蔬菜汁、牛樟木萃取液與二次蒸餾水混合并經高溫滅菌處理制成。
[0016]本發明的有益效果在于:通過讓牛樟菌菌塊局部外露于營養液液面上，而局部菌絲附著于固態營養基質團塊，以及交替休眠與生長的漂浮培養方法設計，可誘使牛樟菌在短期間內長出層疊狀類子實體產物的菌塊，且所培養出的牛樟菌菌塊的三萜類含量會明顯高于一般固態培養方式，并適用于人工大量培養。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是本發明可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法的較佳實施例的步驟流程圖；
[0018]圖2是該較佳實施例的步驟示意圖；
[0019]圖3是該較佳實施例培養所得牛樟菌(BCRC35396)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實體萃出物的HPLC圖譜比較；
[0020]圖4是一般固態培養的牛樟菌(B CRC 35396)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實體萃出物的HPLC圖譜比較:
[0021]圖5是該較佳實施例培養所得牛樟菌(BCRC37848)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實體萃出物的HPLC圖譜比較；
[0022]圖6是一般固態培養的牛樟菌(BCRC 37848)菌塊的萃出物與三年生野生牛樟芝子實體萃出物的HPLC圖譜比較。
[0023]圖7是本發明采用的漂浮培養基裝于培養容器中的影像；
[0024]圖8是將含有牛樟菌的培養載體切片接種至該漂浮培養基后的影像；
[0025]圖9是本發明培養產生的牛樟菌菌塊的影像。
【具體實施方式】[0026]下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細說明:
[0027]本發明可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法的較佳實施例，是利用牛樟菌的生長具有厭水性的特性，特別將牛樟菌接種漂浮于培養液上，用于限制牛樟菌的生長方向，并通過模仿野生牛樟芝生長方式進行牛樟菌的培養，以得到類似牛樟芝子實體的層疊狀類子實體產物，且該層疊狀類子實體產物可萃取出大量的三萜類成分。
[0028]如圖1、2所示，本發明漂浮式牛樟菌培養法包含以下步驟:
[0029](一 )將牛樟菌活性菌絲接種至漂浮培養基400的步驟。
[0030]在本文中，術語“牛樟菌(Antrodia camphorata) ”意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易于獲得的牛樟菌菌株(例如，可購自于國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的新穎牛樟菌菌株。
[0031]在本實施例中，所采用的牛樟菌菌株是購自臺灣食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，寄存編號分別為BCRC35396及BCRC37848，菌株是預先進行平板培養，而培養在培養載體300上，然后再將已培養出牛樟菌活性菌絲的培養載體300進行切片，再將含有牛樟菌活性菌絲的培養載體切片301接種至漂浮培養基400。但是實施時，該培養載體300也可不需進行切片，而直接將整個含有牛樟菌活性菌絲的培養載體300接種至漂浮培養基400。
[0032]在本實施例中，所采用的培養載體300為瓊脂(agar)成分的固態培養基，其制備方式如下:將葡萄糖20g、食品級酵母萃取物4g、V8蔬菜汁30ml與瓊脂(agar) 20g混合后，加入二次蒸懼水調整至1000ml,經高溫滅菌爸(autoclave)在1.latm、12rC下進行滅菌25分鐘，待其降溫后，平均倒入多個培養皿中冷卻凝固后，就獲得尚未接種牛樟菌的培養載體300。然后,將培養載體300移置37°C環境存放備用。實施時，由于牛樟菌平板培養可米用的培養載體300種類眾多，且只是一種中間載體，也非本發明的創作重點，因此培養載體300組分設計不以上述揭露的組分為限，實施時，也可直接以含有活性菌絲的牛樟芝子實體塊作為培養載體，同樣可進行本發明漂浮培養。
[0033]該牛樟菌活性菌絲的預先平板培養方法如下:用接種針鉤取上述菌株的菌種保存管的少許菌絲，并分別穿刺接種于前述培養皿的培養載體300的中心部位。然后，將接種后的培養載體300移入17°C培養箱中避光培養，直到培養所得的活性菌絲菌落500分布該培養載體300表面八分滿。
[0034]由于活性菌絲菌落500邊緣501的一小圈帶白色部分為高度生長區，且從該活性菌絲菌落500邊緣501往外延伸預定距離內，通常都已含有肉眼看不清的前驅菌絲生長其中，也會有外泌酶分泌其中。因此，在從該培養載體300切取接種用的含有牛樟菌活性菌絲的培養載體切片301時，需取用包含這些含有前驅菌絲的部位，如此可使取得的含有牛樟菌活性菌絲的培養載體切片301移植接種于漂浮培養基400后，牛樟菌的生長不會出現明顯停滯現象。
[0035]在本實施例中，當要切取培養載體切片301時，是從該培養載體300表面的活性菌絲菌落500邊緣501徑向往外延伸0.2cm處進行環切后，再自該活性菌絲菌落500中心部位往外輻射分切成多片培養載體切片301，也就是說，每一等分培養載體切片301都含有牛樟菌的前驅菌絲。
[0036]配合參閱圖7，所述漂浮培養基400是裝在培養容器6中，包含有固態營養基質團塊401，及包圍在該固態營養基質團塊401周圍的營養液402，且該營養液402液面高出該固態營養基質團塊401頂緣預定距離，也就是說，該營養基質團塊401沉浸于該營養液402中，此設計關系著牛樟菌接種后是否可順利進行本發明的漂浮培養生長，容后一并說明。
[0037]該漂浮培養基400含有牛樟菌生長所需的養分，在本實施例中，該漂浮培養基400包含用于提供碳源、氮源與礦物質的五谷雜糧與蔬菜汁，及用于提供適合牛樟菌生長與構成三萜類物質的中間代謝物與萜類脂質的土肉桂粉、干枸杞和牛樟木萃取液。
[0038]其中，五谷雜糧包含谷類與豆類。谷類選自小米、高梁、燕麥、大麥、蕎麥、糙米、薏仁或所述的組合。所述豆類選自黃豆、大豆、綠豆、紅豆、黑豆、花豆或所述的組合。蔬菜汁采用市售V8蔬菜汁，用于提供促進牛樟菌生長的維生素與用于構成三萜類的胡蘿卜素，其中，胡蘿卜素為四萜類，被代謝后會有較多制造三萜類起始合成結構原料。由于可提供維生素與胡蘿卜素的蔬菜汁來源相當多，因此實施時，蔬菜汁的選用不以市售V8蔬菜汁為限。
[0039]該牛樟木萃取液是將二次蒸餾水與牛樟木混合后，經高溫滅菌釜在1.latm, 121°C下進行滅菌I小時，接著快速泄壓而使得高溫滅菌釜中的水氣大量蒸發，而殘余的液體就是牛樟木萃取液。在本實施例中，使用的牛樟木包括木塊與未殺青枝葉，并將500g牛樟木加入IOL 二次蒸懼水后,依據上述方式來進行萃取,而得到體積范圍為9-9.5L的牛樟木萃取液。
[0040]漂浮培養基400的制備方式是將上述成分與預定量的二次蒸餾水加入該培養容器6后，經高溫滅菌釜在1.latm、121°C下進行高溫殺菌處理I小時所制成。在高溫殺菌處理過程中，五谷雜糧、干枸杞、土肉桂粉等物質會凝集成團，而構成前述固態營養基質團塊401，其余液體則構成浸泡該固態營養基質團塊401周圍的營養液402。
[0041]在制備上述漂浮培養基400時，所添加的二次蒸餾水含量會隨采用的培養容器6大小與預定接種的 培養載體300或培養載體切片301大小而有所不同，目的在于使構成的固態營養基質團塊401完全浸泡在營養液402中，以及使接種后的培養載體300或培養載體切片301局部外露于營養液402液面上方。
[0042]在本實施例中，使用的培養容器6為500ml的螺旋蓋美乃滋瓶，漂浮培養基400成分含量為:五谷雜糧的谷類與豆類分別為70g與2g、干枸杞5g、土肉桂粉lg、蔬菜汁10ml、牛樟木萃取液10ml，及二次蒸餾水100ml，也就是總重IOlg的固形物混合120ml的液體，其中，五谷雜糧類的谷類包含燕麥15g、蕎麥15g、糙米25g與薏仁15g，而豆類為黃豆。但是實施時，上述成分含量只為較佳示范例，實施時應當不以此為限。且實施時，上述漂浮培養基400的營養液402與固態營養基質團塊401也可分別制作后，再一起置入適當尺寸的培養容器6中，不以一起制作為必要。
[0043]配合參閱圖8，將含有牛樟菌活性菌絲的培養載體切片301接種至漂浮培養基400時，將該培養載體切片301含有前驅菌絲的一端朝上地置入培養容器6中，使該培養載體切片301局部浸泡于營養液402,往下靠抵于該固態營養基質團塊401頂緣，并使培養載體切片301含有前驅菌絲的部位外露于營養液402液面上。然后，將培養容器6的瓶蓋61旋緊后再倒懸開1/4圈，以維持透氣，就完成牛樟菌的漂浮培養的接種。
[0044]在進行牛樟菌的漂浮培養的接種時，當培養容器6中營養液402液面高出固態營養基質團塊401頂緣太多時，會致使置入培養容器6內的培養載體切片301的大部分部位沉浸在營養液402中，也就是使大部分活性菌絲都浸泡在營養液402中，例如超過80%以上的活性菌絲浸泡在營養液402中時，會造成牛樟菌接種后就出現生長緩慢或立刻進入休眠狀態的現象，而無法繼續執行本發明的漂浮培養。當培養容器6中的營養液402太少，營養液402液面高出該固態營養基質團塊401頂緣的高度太低或低于固態營養基質團塊401頂緣，會致使培養載體切片301置入培養容器6后，絕大部分活性菌絲會外露于液面上，例如超過80%以上的活性菌絲外露于液面上時，則在后續培養過程中，牛樟菌的生長就會與一般固態培養基培養相似，在生長布滿該固態營養基質團塊401表面后,就會休眠而出現生長停滯現象。
[0045]因此，該培養容器6中的營養液402液面高出該固態營養基質團塊401頂緣的距離，要根據采用的培養載體切片301的體積大小進行調整，例如根據培養載體切片301的厚度進行調整。就本實施例而言，由于該培養載體300為一般實驗室經常使用，且裝于培養皿中的瓊脂培養基，其厚度范圍介于0.5-1.5cm之間，所以營養液402液面高出固態營養基質團塊401頂緣的較佳距離范圍介于0.5-2.5cm之間。
[0046]但是實施時，若是以牛樟芝子實體塊作為培養載體植入培養容器6內的漂浮培養基400時，營養液402液面高出固態營養基質團塊401頂緣的較佳距離范圍則不以
0.5-2.5cm為限，需根據該牛樟芝子實體塊大小與形狀，調整營養液402液面高度，以使預定比例的牛樟菌活性菌絲外露于液面上。其中，該培養載體300或培養載體切片301上的活性菌絲外露于營養液402液面上的比例范圍為20-80%，較佳范圍為40-60%，最佳為50%。
[0047]接著，(二 )在適合生長的環境條件下進行初期培養的步驟，此階段主要是要利用牛樟菌的厭水特性，迫使牛樟菌往上生長。
[0048]將牛樟菌接種于漂 浮培養基400后,在供氧且適合牛樟菌生長的培養環境溫度條件下進行初期培養，先誘使牛樟菌在該培養載體切片301上大量增生活性菌絲，前述活性菌絲包括營養菌絲與氣生菌絲等，并使前述菌絲聚集構成菌塊。本實施例是在17°C環境中進行避光培養，初期培養的期程為15天，但是實施時，所述培養環境溫度的最佳范圍可介于15~25°C之間，牛樟菌生長狀況會因為采用的培養載體300、營養基質團塊401與營養液402成分差異而不同，所以初期培養期程可根據實際培養情況而調整，較佳的初期培養期程介于10~30天之間。
[0049]另外，在初期培養過程中，會同時調控整個培養環境的濕度，在高濕度環境下進行漂浮培養，以控制培養容器6中的液體蒸散速度與生成速度，使該營養液402維持在高出該固態營養基質團塊401預定距離的狀態。在本實施例中，該培養容器6是體積為500ml的美乃滋瓶，而培養環境溫度設定在17°C，所以培養環境濕度調整在70 %，但是實施時，因所使用的培養容器6尺寸與形狀的不同，也就是培養容器6中的營養液402液面的表面積差異，以及培養環境溫度的差異，該培養環境濕度可做適度調整。
[0050]在此初期培養過程的前期，牛樟菌的營養菌絲會在該培養載體切片301上大量增生，且部分營養菌絲會往下延伸入營養液402中，而附著于該固態營養基質團塊401，并分解該營養液402與該固態營養基質團塊401以攝取所需養分，但是營養菌絲并未與固態營養基質團塊401緊密結合，兩者仍會相對移動；此外，牛樟菌的氣生菌絲也會大量疊生于前述營養菌絲上，且會隨著營養菌絲的增生外擴而逐漸覆蓋整個培養載體切片301表面，并制造細胞間質填充于菌絲間，進而使所有菌絲逐漸連結聚集成團，而構成塊狀的牛樟菌菌塊302，并呈鮮艷橘紅色，且部分具備生殖能力的氣生菌絲會開始產生孢子。[0051]此外，這些大量增生的氣生菌絲會產生大量水蒸氣，通過控制培養環境濕度的方式，除了可降低水蒸氣的散除外，還可使培養容器6中的水蒸氣再冷凝變成水，而沿培養容器6的瓶壁流下。在此期間，培養載體切片301會因為牛樟菌的分解與長期浸泡在營養液402中而逐漸縮小，所以該牛樟菌菌塊302會逐漸變成局部沉浸于營養液401中，并靠抵于該固態營養基質團塊401頂緣的近似漂浮生長狀況。
[0052]在初期培養的末期，該牛樟菌菌塊302體積會大量增加，且牛樟菌菌塊302會因表面積增加量趕不上體積增加量，而無法攝取足夠氧氣以供呼吸代謝，造成中間代謝物快速累積，再加上，該固態營養基質團塊401頂部會被優先分解而局部降低高度，致使靠抵的牛樟菌菌塊302也對應下沉，因為牛樟菌的生長具有厭水性，所以此下沉現象會致使分布于牛樟菌菌塊302周緣的部分菌絲浸入營養液402中，所以牛樟菌菌塊302會在初期培養的末期開始出現代謝遲緩與生長遲滯的休眠征兆，氣生菌絲會自鮮艷橘紅色逐漸褪色變白，且牛樟菌菌塊302微量皺縮。
[0053]接著，(三)在避光環境下進行休眠的步驟。在完成牛樟菌的初期培養后，將培養環境溫度調降至休眠溫度范圍，并鎖緊培養容器6的瓶蓋61而停止供氧，使培養容器6中的牛樟菌完全進入休眠狀態，并維持此休眠期預定時間，使菌絲代謝停止并停止生長。
[0054]在本實施例中，該休眠溫度為5°C，休眠期為72小時，但是實施時，適合牛樟菌的較佳休眠溫度范圍介于riO°C之間，而休眠期長短可視需要調整，大于24小時，就可使菌絲的生長代謝完全停止，所以實施時，休眠期不以72小時為限。
[0055]然后，(四)在避光環境下誘使牛樟菌重新生長的步驟。在完成休眠期后，將培養容器6瓶蓋61旋開1/4圈而重新開始供氧，并將培養環境溫度重新調高至適合牛樟菌生長的溫度，而誘使牛樟菌重新進入生長期，使得牛樟菌菌塊302外露于液面的表面部位的孢子開始大量萌發生長成菌絲，并維持此生長期預定期間。
[0056]在此期間，會有大量鮮艷橘紅色的營養菌絲與氣生菌絲增生，并重新層疊生長布滿于牛樟菌菌塊302原本外露于液面的部位表面,部分新生的營養菌絲會往外延伸入營養液402中，以及往下延伸至該固態營養基質團塊401攝取養分，部分新生的營養菌絲則會往下延伸侵入其下層牛樟菌菌塊302中，以攝取先前累積的中間代謝物，借此使牛樟菌菌塊302出現層疊狀生長狀態，且牛樟菌菌塊302體積也會再次逐漸外擴增大與增高。
[0057]在此重新生長期期間，水氣會再次大量蒸發，所以也會同時調控培養環境濕度，同樣在高濕度環境下進行重新生長，以控制培養容器6中的液體蒸發量與生成量，使該培養容器6中的營養液402維持在高出該固態營養基質團塊401預定距離的狀態。本實施例設定的濕度為70%，但是實施時，同樣可根據培養容器6大小、培養環境溫度…等因素，適度調整培養環境濕度。
[0058]與前述初期培養狀況相同，在此重新生長期的末期，牛樟菌菌塊302會因為其表面積增加量小于其體積增加量，造成氧氣的攝取量不足以供其生長代謝之用，且也會因為該固態營養基質團塊401的高度降低，而再次局部下沉入該營養液402中，致使該牛樟菌菌塊302新生分布于其周緣的部分菌絲浸泡于營養液402中，而開始出現生長遲滯且開始變白的現象，牛樟菌會再次逐漸出現休眠征兆。
[0059]在本實施例中，根據培養容器6的尺寸大小，較佳的生長期范圍介于1(T20天之間，最佳生長期為15天，但是實施時，生長期長短可視牛樟菌生長情況以及采用的培養容器6大小而調整。基本上，本發明主要是要誘使牛樟菌仿效野生牛樟芝的層疊生長方式進行生長，且因牛樟菌菌塊302的后層生長量會受限于其前一層外露于液面的表面積量,若生長期過短，牛樟菌菌塊302表面積增加量太少，會不利于后層的生長，也就是說，牛樟菌菌塊302的后層面積會越來越小，而影響產率；若生長期太長，則不易進行批量化管控，以及統一進行休眠與生長的調控。
[0060]配合參閱圖9，(五)重復循環上述休眠步驟與重新生長步驟預定次數的步驟。通過調控培養環境溫度，誘使牛樟菌反復進行休眠與重新生長的方式，可使培養的牛樟菌菌塊302的生長形態如野生牛樟芝子實 體的層疊狀生長的情況，而產生層疊狀的類子實體產物。
[0061 ] 在本實施例中，依據目前使用的漂浮培養基400總量，以及使用的培養容器6容量大小，該休眠步驟與重新生長步驟重復進行共計十五個循環，為期九個月。但是實施時，休眠步驟與重新生長步驟的循環次數可依據漂浮培養基400的使用量與消耗情況，并配合牛樟菌菌塊302生長情況做適度調整，盡量培養至該固態營養基質團塊401被消耗殆盡，以減少資源的浪費，同時可提高收成效益。
[0062]由于牛樟菌具有厭水生長特性，本發明上述漂浮式牛樟菌培養法就是利用此厭水特性，將牛樟菌漂浮接種在漂浮培養基400的培養液402中進行培養，迫使牛樟菌只能往液面上方大量增生并聚集成菌塊狀，而無法再如一般固態培養的分散生長。然后，通過交替誘使牛樟菌休眠與重新生長，每次的休眠與重新生長都會使牛樟菌菌塊302在原本的塊狀結構上再產生一層新的菌層結構，且牛樟菌菌塊302上新生的菌層除了會通過營養菌絲自營養液402與固態基質團塊401攝取養分外，還會往下自其下方菌層結構中攝取先前累積的中間代謝物，并進一步分解代謝產生三萜類成分。因此，通過循環誘使牛樟菌菌塊302上的牛樟菌交替休眠與重新生長，就可產生富含三萜類成分且類似野生牛樟芝子實體的層疊狀類子實體產物。
[0063]另外，必須說明的是，為避免培養容器6中的營養液402蒸散量過大，以致于發生營養液402液面過低，而致使牛樟菌出現類似固態培養生長的情況，所以在上述培養過程中，若培養容器6中的營養液402液面過低時，會適時添加二次蒸餾水以調整液面高度，但是實施時，此并非為必要步驟。
[0064]完成前述培養步驟后，取出培養所得牛樟菌菌塊302以進行三萜類成分含量的分析。為進一步比較一般固態培養所得的牛樟菌的三萜類含量差異，本發明另外就上述牛樟菌菌株以固態培養基進行固態培養，并自中藥店購得三年生野生牛樟芝子實體以作為三萜類成分含量比較對象。
[0065]【固態培養方式如下說明】:
[0066]所使用的固態培養基組成與上述漂浮培養基400大致相同，唯一的差別在于添加的二次蒸餾水的水量，固態培養基在高溫殺菌處理前的總液量為80ml，經高溫滅菌處理后，五谷雜糧與枸杞會呈濕潤顆粒狀。然后，將含有牛樟菌活性菌絲的培養載體接種至置于培養容器中的固態培養基上，并在供氧且避光的15°C環境與20°C環境中各十五天交替循環，為期九個月，以進行固態培養。在此生長期間，牛樟菌菌絲會生長在固態培養基顆粒上。
[0067]【三萜類成分分析比較】
[0068]本申請三萜類成分是委托嘉南藥理科技大學食品科技系-有機與保健食品檢驗實驗室代為分析。
[0069]本申請漂浮培養方法所得牛樟菌(BCRC35396、BCRC 37848)菌塊:取出漂浮培養所得的125g牛樟菌菌塊302，并將其移入-70°C環境凍存隔夜，然后進行真空冷凍干燥處理，凍干后的菌塊重11.Sg，并研磨成粉末，研磨大小為120目，以HPLC進行三萜類成分分析。HPLC分析條件如下:
[0070]三萜類萃取:取適量粉末加入95%乙醇，在室溫下攪拌萃取六小時以上，然后濾除不溶物，再以0.45 ii m過濾器過濾備用。
[0071 ] HPLC分析:采用C 18管柱(0D S)，UV偵測器波長245nm，流動相A為0.1%磷酸溶液，流動相B為acetonitrile(乙腈),以表1所示梯度流洗進行HPLC三職類圖譜分析。
[0072]表1
【權利要求】
1.一種可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于:依序包含以下步驟:(A)將含有牛樟菌活性菌絲的培養載體接種至漂浮培養基的步驟，所述漂浮培養基包括含有牛樟木萃取液的營養液，及沉浸于所述營養液中的固態營養基質團塊，所述培養載體局部浸泡在營養液中，且部分牛樟菌活性菌絲外露于營養液液面上方，而部分牛樟菌活性菌絲局部浸泡在營養液中；(B)在供氧且適合牛樟菌生長的培養環境溫度條件下進行初期避光培養的步驟，促使外露于營養液液面上方的牛樟菌活性菌絲增生，而在該培養載體上聚集成局部外露于營養液液面上方的牛樟菌菌塊，且使所述牛樟菌菌塊的部分活性菌絲增生附著于所述固態營養基質團塊擷取養分；(C)在避光環境下進行休眠的步驟，密封培養環境而停止供氧，并將培養環境溫度調降至休眠溫度，誘使牛樟菌進入休眠期，并維持休眠期預定期間；(D)在避光環境下誘使牛樟菌重新生長的步驟，對所述培養環境重新供氧，且將培養環境溫度調升至適合牛樟菌生長的溫度，誘使所述牛樟菌菌塊位于液面上的孢子萌發生長成活性菌絲，并維持此生長期預定時間；及(E)重復循環所述步驟(C)與所述步驟(D)預定次數。
2.根據權利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(A)的營養液液面會高出所述固態營養基質團塊頂緣，所述培養載體局部沉浸在營養液中，而疊靠于所述固態營養基質團塊頂緣。
3.根據權利要求2所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(A)的漂浮培養基的營養液液面高出所述固態營養基質團塊頂緣的距離范圍介于0.5_2cm 之間。
4.根據權利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(A)中局部浸泡于營養液中的培養載體間隔位于所述固態營養基質團塊旁側。
5.根據權利要求1、2、3 或4所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(B)與所述步驟(D)還會分別在牛樟菌的培養期期間，調控所述培養環境的濕度，使營養液保持局部浸泡所述牛樟菌菌塊。
6.根據權利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(B)與所述步驟(D)的培養環境溫度較佳范圍介于15-25°C之間。
7.根據權利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(C)的休眠溫度范圍介于4-10°C之間。
8.根據權利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(C)的休眠期時間為24小時以上。
9.根據權利要求8所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述步驟(C)休眠期的較佳時間長度為72小時。
10.根據權利要求1所述的可提高三萜類含量的漂浮式牛樟菌培養法，其特征在于，所述漂浮培養基是由提供碳源與氮源的五谷雜糧，及枸杞、土肉桂、提供胡蘿卜素與維生素的蔬菜汁、牛樟木萃取液與二次蒸餾水混合并經高溫滅菌處理制成。
【文檔編號】A01G1/04GK103518528SQ201210235696
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2012年7月6日
【發明者】劉宗翰 申請人:豐苗生物科技股份有限公司