專利名稱：一個小麥非特異性脂轉移蛋白基因及其所編碼的蛋白質和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，公開了ー個小麥非特異性脂轉移蛋白基因及其所編碼的蛋白質和應用。
背景技術：
小麥赤霉病(FHB)是ー種真菌性病害，它能對小麥、大麥以及玉米等禾谷類作物產生病害而直接造成作物減產和品質下降；另一方面，收獲的糧食由于被病原菌產生的deoxynivalenol (DON)和其他ー些單端孢霉烯類毒素所污染,人和動物食用后,均會危害健庚。目前隨著全球氣候的變暖，該病在全世界各個小麥種植區迅速蔓延，在我國小麥主產區也日趨嚴重，控制小麥赤霉病的發生發展對于小麥安全生產意義重大。 小麥白粉病是小麥的第二大病害，盡管已經發現了多個抗白粉病基因位點，但由于小麥白粉病菌的專性寄生特性，小種專化抗性的抗病基因很容易喪失抗性，需要不斷發掘新的抗病基因資源，特別是具有廣譜抗性的基因資源。選育抗赤霉病小麥品種是控制赤霉病最經濟和有效的途徑。明確其抗病機制，克隆抗病相關基因，對于防治小麥病害、開展抗病育種改良具有重要理論指導意義。小麥抗病分子機制是目前小麥赤霉病研究的熱點課題。赤霉病病原菌與寄主小麥之間的互作關系十分復雜。赤霉病菌具有腐生兼寄生的特性，既能在死體植物上生活，也能從活體寄生植物上汲取營養；小麥對赤霉病抗性是非小種專化的，同時也是多基因控制的數量遺傳性狀。分析病原菌-寄主互作過程中的基因表達情況，有助于發掘抗病基因和發現抗病通路，并進ー步闡明抗病的分子機制。通過構建受赤霉病菌誘導表達的cDNA文庫、SSH文庫，利用雙向電泳結合質譜技術、芯片技術等，篩選出了可能與赤霉病抗性相關的基因或蛋白，包括各種病程相關蛋白、細胞色素P450、葡萄糖基轉移酶、ABC轉運蛋白等，也發現了茉莉酸途徑、乙烯途徑等信號通路與赤霉病抗性關。小麥地方品種望水白是到目前為止普遍公認的赤霉病抗性強而且穩定的小麥品種，在其染色體臂3BS上定位了ー個抗FHB的主效QTL。利用快中子輻射，獲得了一個望水白感赤霉病突變體NAUHl 17。本研究利用基因芯片技術，比較分析望水白及NAUHl 17受赤霉菌誘導的基因表達譜，結合基因芯片雜交結果和電子定位信息，在望水白中克隆了ー個非特異性脂轉移蛋白基因(TaLTP-B)，該基因定位于3BS抗FHB主效QTL區域，且位于突變體NAUHl17的缺失區段；利用基因槍技術將其轉化感赤霉病病小麥品種揚麥158中，以期提高赤霉病抗性和白粉病抗性。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供ー種非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B及其應用。本發明的另ー目的是提供該基因的表達載體。
本發明的又一目的是提供該基因和表達載體的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B,來自普通小麥(Triticum asetivum L.)品種望水白，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I。該非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B編碼的蛋白質TaLTP-B，其氨基酸序列為SEQID NO. 2。含有所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B的表達載體。含有所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B的表達載體優選以pBI220為出發載體，將所述的TaLTP-B基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B在培育抗赤霉病和白粉病小麥品種中 的應用。所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B的表達載體在培育抗赤霉病和白粉病小麥品種中的應用。有益效果本發明從小麥中克隆得到了ー個非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B及其所編碼的蛋白質TaLTP-B。TaLTP-B可用于基因工程育種，將其插入表達載體pBI220，得到該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感赤霉病和白粉病小麥品種對赤霉病和白粉病的抗性。
圖I利用普通小麥中國春第三部分同源群缺體-四體和部分3B短臂缺失系材料對TaLTP-B基因進行染色體區段定位，將TaLTP-B定位到3BS的0. 78-0. 87區段I, Marker ;2，望水白(Wangshuibai) ；3, H117 ;4，中國春(Chinese Spring) ;5,中國春缺體-四體N3A/T3B ; 6，中國春缺體-四體N3B/T3D ; 7，中國春缺體-四體N3D/T3A ； 8，中國春缺失系3BS-1 ;9，中國春缺失系3BS-9 ;10，中國春缺失系3BS-8 ;11，中國春缺失系3BS-3 ;12，水(ddH20) 圖2TaLTP-B在望水白、NAUHl 17和感赤霉病小麥品種Alondra’ s受赤霉菌和DON誘導后的穗組織中的實時熒光定量RT-PCR分析X軸0h、12h、24h、48h、72h、96h分別表示小麥穗組織受赤霉菌誘導的不同時間段；Y_ =TaLTP-B基因在不同樣品中受赤霉菌誘導前后的表達倍數。圖3TaLTP_B過量表達載體構建圖4TaLTP_B基因轉化揚麥158的Ttl代陽性轉基因植株PCR分子鑒定結果泳道I為Marker，泳道2為未轉化揚麥158對照，泳道3為包含目的基因的質粒，泳道4為水空白對照，泳道5為陽性轉化植株H泳道6為Marker，泳道7_16依次為陽性轉化植株 T0-7、T0-13、T0-32、T0_51、T0_55、T0_58、T0_61、T0_65、T0_67、T0_68。圖5TaLTP_B基因轉化揚麥158的Ttl代陽性植株Q-RT-PCR分析結果X 軸T0-3、T0-7、T0-13、T0_32、T0_51、T0_55、T0_58、T0_61、T0_65、T0_67、T0_68 為陽性轉化植株，T0-26為陰性轉化植株，揚麥158為轉基因受體小麥；Y_ =TaLTP-B基因在轉基因植株中相對于揚麥158的表達倍數。
具體實施例方式實施例I望水白受赤霉菌誘導的穗組織中ー個非特異性脂轉移蛋白基因克隆望水白(公知公用材料，裴自友，賈高峰等.普通小麥籽粒DON含量的配合力分析，作物學報，2007, 33(5) :731-737)是高抗赤霉病的材料。本實驗室在前期研究中，利用快中子輻射望水白，篩選獲得感赤霉病突變體NAUHl 17 (公知公用材料，Jin Xiao，XinpingJia，et al. Afast-neutron induced fragment deletion oiin wheat varietyWangshuibai increased its susceptibility to Fusarium head blight. Chromosomeresearch, 2011，19:225-234)，該突變體發生了較復雜的染色體結構重排，導致定位于3BS上的抗赤霉病主效位點Fhbl缺失，因而感赤霉病性顯著提高。為了獲得望水白中與赤霉病抗病相關的基因，本研究利用小麥基因芯片篩選望水白和NAUH117赤霉菌接種前后的差異表達基因，從中選擇重要基因進行功能驗證。在抽穗期對小穗采用單花滴注法接種赤霉菌，將赤霉菌分生孢子懸浮液濃度調·整為5，000個/ml，于中部小花注射IOiU孢子懸浮液，采用人工彌霧保濕方法溫室彌霧保濕3天，赤霉菌株是從田間自然發病植株上分離和培養得到(赤霉菌采集和培養方法見劉傳琴，關淑卿，黃巍.小麥赤霉菌分離培養及接種，現代化農業，1998:9)，用不含赤霉菌的水接種作為陰性對照，共4個處理。接種后24h取穗樣，用TRIZOL (Invitrogen，CA，USA)按試劑說明書分別提取總RNA，進行基因芯片雜交(Affymetrix小麥基因表達譜芯片，part number 900515)，該實驗在“上海國家生物芯片工程中心”完成。以實驗組信號與對照組信號比值大于2為標準篩選上調表達基因。其中I個基因推測為非特異性脂轉移蛋白(nonspecifc lipid-transfer protein,探針號為 EST-432,增加倍數為 242倍)，在望水白中受赤霉菌誘導上調表達，在NAUH117中不表達，挑選進行候選基因克隆研究。根據探針 EST-432 序列設計引物，Pl (TCTGCCTGAGCTCACTACCA (SEQ ID 勵.3))和卩2(ATATGTGGGTGTGCGTGTGT (SEQ ID NO. 4))，以望水白受赤霉菌誘導后24h的穗部組織cDNA為模板，通過PCR技術克隆望水白中該基因的cDNA全長。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，發現望水白比NAUH117多擴增出一個條帶，推測該條帶為染色體3BS的特異擴增條帶，將該特異條帶回收并克隆到PMD18-T載體中，轉化DH5 a感受態細胞，挑選含有目的片段的單克隆進行測序。對測序結果進行分析，獲得了大小為491bp的序列，序列如SEQ ID NO. I所示。通過NCBI網站中的ORF finder搜索該獲得序列的開放閱讀框，發現其包含一個全長ORF的基因，其中5’-UTR (非翻譯區)43bp、3’-UTR100bp、0RF (開放閱讀框)348bp，編碼115個氨基酸，序列如 SEQ ID NO. 2所不，利用 SignaIPChttp://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)分析了編碼蛋白，該蛋白N端具有26個氨基酸的信號肽，將該基因命名為TaLTP-B。實施例2TaLTP_B基因的染色體定位根據TaLTP-B 基因序列設計特異引物 P3(AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC(SEQ ID NO. 5))和P4(TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQ ID NO. 6)),以ー套普通小麥品種中國春的缺體-四體以及缺失系基因組DNA為模板進行PCR擴增反應，對TaLTP-B基因進行染色體物理定位。PCR程序10-50ng/ul基因組模板，IOiiM的5，引物和3，引物各0. 4u I ；2. 5u I IOXbuffer ；
2U I 2. 5mM 的 dNTP ;2 U I 25mM 的 Mg2+;0. 2 U I (5U/U I) Taq polymerase(TaKaRa),加水至
反應條件為94°C預變性 3min ；94°C 45s, 57°C 45s, 72°C lmin，33 個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物經8%的聚丙烯凝膠電泳檢測。該引物只在第3部分同源群缺體-四體中出現擴增帶型的差異，TaLTP-B在N3B/T3D和NAUH117中擴增都缺少一條190bp的條帶，結果表明TaLTP-B位于3B染色體上，并且在NAUHl 17缺失。進ー步在中國春3BS的缺失系(公知公用，Jin Xiao, Xinping Jia, et al. A Fast-neutron Induced Fragment Deletionof 3BS in wneat variety Wangshuibai Increased Its Susceptibility to FusariumHead Blight. Chromosome Research, 2011, 19:225-234.)中擴增對 TaLTP-B 進行染色體區段定位，將該基因定位于3BS8FL0. 78-0. 87的染色體區段，即位于望水白3BS抗FHB主效QTL區域(圖I)。實施例3TaLTP_B基因受赤霉菌誘導的表達特征應用能特異擴增TaLTP-B 的特異引物 P3(AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC(SEQ ID NO. 5))和P4 (TGCTCGATCAGCGAATCTTA (SEQ ID NO. 6))，對該基因受赤霉菌誘導進行實時熒光定量PCR (Q-RT-PCR)分析。PCR反應在實時熒光定量PCR儀(MylQ，Bio-Rad, USA)上擴增并 檢測熒光。20uL PCR 反應體系中含 2XSYBR Green PCR Master Mix 10uL，0. 4nmol/uL 弓丨物 Pl 和 P2，反轉錄產物 2uL。擴增參數為95°C lOmin，然后 95°C 15s、58°C 30s，72°C lmin,共40個循環。反應結束后，進行熔解曲線的測定。檢測基因表達水平定量用MyiQ系統軟件進行分析。結果表明，在望水白中TaLTP-B受赤霉菌誘導上調表達，72h后表達水平達到峰值，之后開始下調；在NAUH117中TaLTP-B缺失，因此在赤霉菌誘導前及誘導后的各個時段都不能檢測其表達。在感赤霉病小麥品種Alondra’ s (公知公用，李明浩，陳煒，邢莉萍，等.普通小麥品種Alondra’s遺傳轉化體系的建立.植物學報，2010，45 (4) : 466-471)中，其表達水平在各個時間段也都低于在望水白中的表達量(圖2)。Q-RT-PCR的結果表明，TaLTP-B可能與赤霉病抗性相關。實施例4TaLTP_B正義表達載體構建及其轉化普通小麥揚麥158以TaLTP-B基因cDNA為模板(制備方法見實施例1)，使用引物對P5(CGGGATCCATGGCCCGTTCTG (SEQ ID NO. 7))和 P6 (GGGGTACCTCAGCGAATCTTA (SEQ IDNO. 8))進行PCR擴增，回收擴增片段。用BamHI和KpnI雙酶切將擴增目標片斷插入到載體 pBI22。(Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions:beta-glucuronidaseas a sensitive and versatile gene fusion marker m higher pi&nts.EMBOJ. 1987，6:3901-3907.)的35s啟動子后面的多克隆位點BamHI和KpnI之間。由此將目標基因TaLTP-B克隆到強啟動子35s的下游，獲得表達載體pBI220:TaLTP-B (圖3)。將構建好的過量表達載體通過基因槍法轉化揚麥158，挑選2800個幼胚愈傷進行基因槍轟擊，轟擊前在高滲培養基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2, 4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，pH5. 8)上預處理4小時，轟擊后在高滲培養基上繼續培養16小吋。之后將愈傷組織轉移至恢復培養基(1/2MS (只有大量元素減半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培養2周，再將其轉移至含有除草劑的篩選培養基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+2，4_D lmg/L+ 蔗糖 30g/L+4mg/L Bialaphos, pH5. 8)，篩選培養2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉移到分化培養基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 lmmol/L+ 水解酪蛋白 200mg/L+KT lmg/L+1AA 0. 5mg/L+ 鹿糖 30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)進行分化，待分化芽長至2-4cm時將其轉移至生根培養基(1/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)中。至再生苗長約8cm、根系較健壯吋，即可開管煉苗1-2天，最后洗去根系攜帯的培養基殘渣便可移栽入盆缽，獲得再生植株共70株。提取所有再生植株基因組DNA，對轉化植株利用載體上啟動子引物P7(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC (SEQ ID NO. 9))和基因內部引物 P8 (TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQID NO. 10))進行PCR擴增，以鑒定陽性植株。PCR程序10_50ng/基因組模板，10 y M的 5’ 引物和 3’ 引物各 0. I ;2. I IOXbuffer ；2. 5u I 2. 5mM 的 dNTP ; I. 5 y I 25mM的 Mg2+;0.25ii I (5U/ u I) Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25 ii I。PCR 反應條件為94°C預變性 3min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C lmin，35 個循環；72°C延伸 lOmin。PCR產物經 8% 的聚丙烯凝膠電泳檢測。其中11株可以擴增約650bp的目的條帶，初歩鑒定為陽性植株，株系編號依次為:T0-3、T0-7、T0-13、T0-32、T0_51、T0_55、T0_58、T0_61、T0_65、T0_67、T0_68 (圖4)。選取未接種赤霉菌的陽性轉基因植株，利用隨機挑選的陰性轉基因植株L-26以及轉基因受體揚麥158作為陰性對照植株，提取穗部總RNA，利用TaLTP-B基因的特異引物 P3 (AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC (SEQ ID 吣.5))和卩4 (TGCTCGATCAGCGAATCTTA (SEQ ID NO. 6))，進行Q-RT-PCR分析。結果表明與對照揚麥158相比，TQ-26植株中的TaLTP-B基因的表達量沒有顯著變化！1^-46植株中的TaLTP-B基因的表達量只上調了約I. 6倍T0-5U T0-55 植株中的 TaLTP-B 基因的表達量上調約 2. 2-2. 4 倍；TQ-3、TQ-7、TQ-13、TQ-58、T0-6UT0-65,T0-67,T0-68植株中的TaLTP-B基因的表達量上調約3. 3-12. 6倍。其中，植株T0-67中該基因的表達量上調了約5. 3倍，植株L-61中該基因的表達量上調了約9. 2倍，植株L-7中該基因的表達量上調了約12. 6倍(圖5)。實施例5轉基因植株的赤霉病抗性鑒定對所有鑒定的陽性植株、陰性植株L-26進行赤霉病抗性鑒定(赤霉病抗性鑒定采用單花滴注方法將10 Ul孢子懸浮液5，000個/ml滴加到剛開花穗子中部的ー朵小花，采用人工彌霧保濕方法溫室彌霧保濕3天，接種后21天后調查病小穗率。病小穗率=(發病小穗數/總小穗數X 100%),以未轉化感病小麥品種揚麥158、抗病品種望水白為對照。轉基因 T0 代陽性轉基因植株 T0-7,T0-13,T0-32,T0-51,T0-55,T0-58,T0-61,T0-65,T0-67,T0-68與轉基因受體揚麥158相比，可以提聞對赤霉病的抗性。轉基因植株的病小穗率及t測驗結果表明1^-74-134-324-514-554-58,T0-6U T0-65, T0-67, T0-68植株與轉基因受體材料揚麥158相比，接種小穗的平均病小穗率差異顯著！1^-26植株與揚麥158相比，接種穗的平均病小穗率差異不顯著T0-13,Tq-32、Tq-51、Tq-55、Tq-58、Tq-61、Tq-67、T0-68植株與抗病對照望水白相比，接種小穗的平均病穗率差異不顯著；TQ-65、T0-26與望水白相比，接種小穗的平均病穗率差異顯著(表I)。表I轉基因植株的赤霉病抗性鑒定材料病小穗率{%)
均值±標準 t測驗值(揚麥158}t測驗值(望水白}統計穗數
揚麥 15827.86±4.3716
望水白4.08±0.4216
To-79.52+3.812.44*I 598
Tn-1311.62+3.662.91*2.028
T0-2 630.76±4.240.343.68*7
T0-B 27.58±2.374.07*1.456
T0-Sl12.80±3.922.56*2.219
T0-5 57.65±2.243.95*1.339
Το-5810.91±4.172 801.6311
T0-Sl6.1211.844.58*1.086
T0-6510.89土2.373.41*2.82*8
T0-675.13+0.545.15*1.536
Το-684.22+0.475.37*0.217表I 中，Τ0-7、Τ0-13、Τ0-32、Τ0-51、Τ0-55、Τ0-58、Τ0-61、Τ0-65、Τ0-67、Τ0-68 為鑒定的陽性轉化植株，Τ0-26為鑒定陰性植株，揚麥158為轉基因受體小麥品種，望水白為抗病對照。實施例6轉基因植株的白粉病抗性鑒定用江蘇南京地區田間采集的白粉病菌混合菌種同時接種Ttl代轉基因植株、轉基因受體品種揚麥158，進行苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定。抗性鑒定標準采用“0-9級”白粉病抗性反應型的分級標準，0-2級為高抗、3-4級為中抗、5級以上為感病。苗期離體抗性鑒定的兩次重復結果表明揚麥158和陰性轉基因植株1^-26表現為中感或高感；陽性轉基因植株中，Tq-3、T0-13和Tq-32均表現為高抗，T0-6UT0-67和TQ-68均表現為中抗，植株TciUtl-Si—次重復表現為高抗，另一次重復表現為中抗。成株期白粉病鑒定結果表明揚麥158表現為中感或高感，陽性轉基因植株中，H、T0-13, Τ0-32和Tci-Sl均表現為高抗，T0-7,T0-6UT0-67和1^-68均表現為中抗。除個別植株外，苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定結果基本一致(表2)。表2轉基因植株的白粉病抗性鑒定
權利要求
1.一個小麥非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.權利要求I所述非特異性脂轉移蛋白基因的蛋白質TaLTP-B，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.含有權利要求I所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B的表達載體是以PB 1220為出發載體，將權利要求I所述的TaLTP-B基因插入PBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。
5.權利要求I所述的非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B在培育抗赤霉病和/或白粉病小麥品種中的應用。
6.權利要求3或4所述的含非特異性脂轉移蛋白基因TaLTP-B的表達載體在培育抗赤霉病和/或白粉病小麥品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一個小麥非特異性脂轉移蛋白基因及其所編碼的蛋白質和應用，屬于基因工程領域。TaLTP-B的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。該基因來自普通小麥(Triticum asetivum L.)品種望水白，在抗赤霉病小麥品種望水白中受赤霉菌誘導表達增強，且表達水平遠高于感赤霉病小麥品種Alondra’s中的表達水平。將TaLTP-B基因轉化感赤霉病小麥品種揚麥158，對轉基因T0代植株進行赤霉病抗性鑒定，結果表明TaLTP-B基因的過量表達可以提高揚麥158對赤霉病的抗性。TaLTP-B基因可在培育抗赤霉病和白粉病小麥品種中應用。
文檔編號A01H5/00GK102796748SQ20121029670
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者賈新平, 王秀娥, 肖進, 王海燕, 曹愛忠, 邢莉萍, 趙維萍, 李明浩, 陳煒, 金夏紅, 裴海巖 申請人:南京農業大學