專利名稱：人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷貝數變異檢測方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因拷貝數的檢測方法，尤其涉及一種與冠心病相關 的人脂蛋白a的基因拷貝數的檢測方法，還涉及一種檢測脂蛋白a的基因 拷貝數的試劑盒。
背景技術：
隨著后基因組時代的來臨，在功能基因組學研究中，定量基因分析占 有非常重要的地位。實時熒光定量PCR技術的問世，為后基因組時代疾 病相關基因的研究提供了一個極好的技術平臺。實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)通過設計針對目的基因的特異性引物和 探針，優化反應體系和反應循環參數，可同時檢測大量樣本，節省實驗時 間和反應成本，為基因定量檢測和準確定量疾病相關基因的表達提供有效 的技術手段，實現對人類和動物疾病的早期診斷與基因分期、分型，以及 對人類腫瘤轉移的早期發現及預后判斷，在臨床上有廣闊的應用前景。
實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用 熒光信號累積，實時監測整個PCR進程及連續分析擴增相關的熒光信號， 最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR反應過程中產生 的DNA拷貝數呈指數方式增加，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不 再以指數方式生成模板，進入平臺期。在PCR反應早期，產生的熒光水平 不能與背景明顯地區別，而后，熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期。因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，
并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢樣本進行比較，在實時
熒光定量PCR反應的指數期，首先需設定一個熒光信號的循環閾值 (cycling threshold, CT)，即每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值 時所經歷的循環數。以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底 信號，如果檢測到的熒光信號達到設定的閾值時被認為是真正的信號，它 所經歷的循環數即為CT值。研究表明每個模板的CT值與該模板的起始 拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小。利用己知起 始拷貝數的標準品可做出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的CT值，即 可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
在實時熒光定量PCR技術中，目前應用最普遍的熒光化學方法是水解 探針法(hydrolysis probes)。水解探針法是一種利用標記熒光染料的基 因特異寡核苷酸探針雜交擴增產物的檢測方法。通常使用Taq聚合酶的5' 核酸外切酶活性來水解與目的序列雜交的探針在PCR擴增體系中，溶液 中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導 下，被擴增物沿模板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換，T叫酶的5， 外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)，裂解雙 鏈DNA5'端核苷酸，釋放出單個寡核苷酸。基于Taq酶的這種活性，設 計合成了一個能與PCR產物雜交的探針。目前，應用最廣泛的是Taqman探 針。Taqman探針是一段特異性的寡核苷酸，其5，端標記熒光發射基團， 也稱報告基團(r印orterR)， 3，端標記淬滅基團(quencher Q)，其序列 與模板DNA中擴增序列的一段完全互補。常用的報告基團包括FAM、 VIC、TET、 J0E、 HEX(R) 、 CY3、 CY5，淬滅熒光基團為MGB、 TAMRA和DABCYL(Q)。 當探針保持完整時，5'端熒光發射基團吸收能量后將能量轉移給臨近的 3'端淬滅基團，發生熒光共振能量轉移，3'端淬滅基團抑制5'發射基 團的熒光發射，故檢測不到該探針5'端熒光基團發出的熒光。在PCR的 退火期，探針與引物所擴增序列內的DNA模板發生特異性雜交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，當到達探針處，Taq酶發揮5' 3' 核酸外切酶活性而發生置換切斷探針，使報告熒光基團和淬滅基團分離， 淬滅基團的抑制作用消失，熒光發射基團脫離3'端淬滅基團的屏蔽，接 受光刺激發出熒光信號。這時熒光探測系統便會檢測到光密度增加。模板 每復制一次，就有一個探針被切斷，同時伴有一個熒光信號的釋放。由于 理論上被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一的關系，且光密度 和被釋放的熒光基團的數目也是正比關系，因此熒光信號的累積與PCR 產物完全同步。在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量， 可推斷出模板最初的含量，對模板進行準確定量。由于模板較短時擴增效 率較高，故擴增長度一般以50 bp 150 bp為佳。
在實時熒光定量PCR中，模板定量有2種方法相對定量法和絕對定 量法。相對定量法是指在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變 化；絕對定量法是指用已知的標準曲線來推算未知樣本的量。絕對定量法 一般采用外標準品定量的制備來實現，質粒DNA和體外轉錄的RNA常作為 絕對定量的標準品。將標準品(質粒DNA)稀釋成不同濃度的樣品，并作 為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的CT 值(熒光信號閾值)為縱坐標，繪制標準曲線。對未知樣品進行定量時，200810043596.8根據未知樣品的CT值，即可在標準曲線中計算出樣品的拷貝數。
脂蛋白a[Lp (a)]是挪威遺傳學Kara Berg在1963年首先發現的，1987 年，McLean等發現Lp(a)與纖維蛋白原之間具有結構高度同源性及交叉免 疫反應性，自此Lp(a)與動脈粥樣硬化的關系即成為研究的熱點，被認為 是一種新的致動脈粥樣硬化性脂蛋白，是冠心病等動脈粥樣硬化性疾病的 獨立危險因素之一，并促進粥樣硬化血栓形成及進展。
Lp(a)是一種特殊脂蛋白顆粒，主要由LDL成分和載脂蛋白a組成。 其顆粒大小與遺傳因素有關，Lp(a)與溶解纖維蛋白的纖溶酶原具有同源 性，干擾纖溶酶原在纖溶過程中的作用，參與動脈粥樣硬化形成和發展的 整個過程，是動脈粥樣硬化和血栓形成的獨立危險因素。動脈粥樣硬化風 險社區研究提示高Lp(a)血癥(Lp(a)X).3g/L)者患缺血性腦卒中的風 險比低Lp (a)者(Lp (a) <0. lg/L)高79%。 Barbara等對429名I型糖尿病 病人進行長達6年的前瞻性研究，結果表明高Lp (a)血癥(Lp (a)》0. 3g/L) 是冠心病的獨立危險因素。高Lp(a)血癥的糖尿病患者與血Lp(a)正常 (Lp(aX0.3g/L)的糖尿病患者相比，其患冠心病的風險是后者的2倍 (服二2. 23， 95%CI: 1.28-3. 87， P=0. 004)。現有研究認為血Lp(a)水平是 由一個基因(lipoprotein (a) ， LPA)的主要效應和多基因的微效作用所 決定。Wong等運用全基因組的比較基因組雜交技術(whole-genome tiling BAC array, CGH)證實了人類基因組部分染色體的DNA片段存在重復和缺 失，涉及了 1000多個基因，其中大部分基因與疾病相關，包括LPA基因。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測冠心病的基因拷貝數的方法。
為了解決以上技術問題，本發明提供的應用實時熒光定量PCR技術檢
測冠心病的基因拷貝數的方法，其特征在于，包括如下步驟
(1) 、抽提與純化人外周血基因組DNA;
(2) 、制備陽性質粒標準品；
(3) 、建立Taqman熒光定量PCR檢測方法。
本發明還提供了一種利用上述方法檢測人脂蛋白a基因拷貝數的試 劑盒以及該方法和試劑盒在冠心病預警診斷和高危人群早期篩査中的應 用。
本發明的冠心病的基因拷貝數的檢測方法能達到如下效果
1、 本發明根據目的基因LPA和內參基因白蛋白基因(ALB)的非特 異性管家序列，設計相應的引物和Taqman探針，利用T叫man特異性探針 對定量分子進行識別，達到靶序列由引物和探針雙重控制的目的。
2、 在人體基因組DNA和質粒中分別進行重復性檢驗提示組內及組間 變異系數均在合理范圍(<5%)，體現了 Taqman實時熒光定量PCR對于臨 床檢驗反應特異性好、準確性高、線性關系好的優勢。
3、 對于樣本濃度和變異系數的相關性分析得出人基因組DNA濃度為 2ng/uL時，兩基因變異系數最小，差值也最小，提示2ng/u L是臨床樣 本檢驗較為合適的濃度。
4、 PCR的擴增和檢測在同一管中同時進行，實時監測，減少了污染 的可能性，反應的試劑均具備尿嘧啶糖苷酶(UNG/DUTP)防污染技術， 有效防止了來自擴增產物的污染，降低假陽性率，保證結果的準確性。5、本發明的針對目的基因LPA和內參基因ALB的Taqman實時熒光 定量PCR系統有較高的臨床檢驗價值，為探索LPA基因拷貝數變異與冠心 病的關系奠定了實驗基礎。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明。
圖1是LPA基因和ALB基因PCR擴增條帶電泳結果圖2是LPA基因和ALB基因陽性單克隆菌落PCR擴增條帶電泳結果
圖3是實時熒光定量PCR檢測體系對LPA基因按10倍等拷貝數梯度 稀釋質粒的擴增曲線圖4是根據LPA基因擴增曲線建立的標準曲線圖5是實時熒光定量PCR檢測體系對ALB基因按10倍等拷貝數梯度 稀釋質粒的擴增曲線圖6是根據ALB基因擴增曲線建立的標準曲線圖。
具體實施例方式
實施例l人脂蛋白(a)基因拷貝數熒光定量檢測體系建立
1. 人基因組DNA抽提與純化
抽取人外周靜脈血lOmL，置于含有ACD(枸櫞酸8g/L，枸櫞酸鈉 22g/L，葡萄糖24.5g/L)的抗凝管中，振蕩混勻后提取DNA。采用 FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206)試劑盒抽提人外周血基 因組DNA。
2. 陽性質粒標準品的制備2.1. PCR擴增目的基因
參照GeneBank收錄的目的基因LPA和內參基因ALB的基因組全序列， 選擇保守區域，采用美國ABI Primer Express3. 0實時熒光定量PCR引物 設計軟件，分別擴增89bp(LPA)和139bp(ALB)的片段。其中LPA探針選自 SEQ ID NO: 1的序列，其正向引物包括SEQ ID NO: 3序列，反向引物包 括SEQ ID NO: 4序列；ALB探針選自SEQ ID NO: 2的序列，其正向引物 包括SEQ ID NO: 5序列，反向引物包括SEQ ID NO: 6序列。所擴增片 段為非特異性管家序列，不存在任何已報道的基因內結構變異。在PCR 反應體系中使用不同的Mg2+、探針、引物的濃度以確定最佳的反應體系 PCR反應總體積25 u L，體系組分為1. 5 y L 10 X buffer、 3 u L betaine、 1. L 25匪ol/L MgCl2、 0. L 10mmol/L dNTPs、 20mmol/L上下游引物 各0. 2 u L、0. 12 u L Taq DNA聚合酶、7. 08 u L高壓滅菌雙蒸水、1 u L 20ng/ ii L DNA模板。PCR反應條件95。C預變性3分鐘，95。C變性30秒，60 'C退火30秒，72匸延伸40秒，共40個循環。PCR結束后用1. 5%瓊脂糖 凝膠檢測擴增結果，具體結果如圖l所示。PCR產物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)純化。
2. 2.采用氯化鈣制備新鮮大腸桿菌DH5a感受態細胞
1) 于新鮮平板上37。C培養大腸桿菌DH5a 16-20小時。
2) 從隔夜培養的平板上挑取一個單菌落(直徑2-3mm)，轉到一個含有 100mlLB或SOB培養基的1L燒瓶中。3) 于旋轉搖床上37i:， 300rpm劇烈振搖培養3小時，每隔30分鐘 測量OD600值來監測培養物的生長情況，保持0D600=0. 35 0. 4
(活細胞數不超過108細胞/mL)。
4) 用冰預冷一次性無菌50mL聚丙烯管(Falcon 2070)。
5) 無菌條件下將細菌轉移到預冷的聚丙烯管中，冰上放置10分鐘，
使培養物冷卻至ox:。
6) 于4。C 4000rpm離心IO分鐘，回收細胞。
7) 倒出培養液，將管倒置1分鐘使殘留的培養液流盡。
8) 取10mL用冰預冷的0. lmol/L氯化鈣重懸沉淀的細胞，冰浴30 分鐘。
9) 于4。C以4000rpm離心IO分鐘，再次回收細胞。
10) 再次倒出培養液，將管倒置1分鐘使殘留的培養液流盡。
11) 加入100 u L用冰預冷的0. lmol/L氯化鈣重懸細胞，冰浴2小時 后，4'C保存備用。
2. 3.重組DNA的轉化
在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5uL: Pmd 18-T Simple Vector氺l luL， insert D膨3 0.1-0.3 pmol，高壓滅菌雙蒸7夂方口至5 u L，加入5uL (等量)的Ligation Mix， 16。C反應30分鐘。10uL連接 產物加入到100 ii L感受態細胞中，冰中放置30分鐘。然后將離心管轉入 42。C水浴，熱沖擊45秒后，迅速將其放在冰上1分鐘靜置。在離心管中 加入S0C培養基890uL，槍頭混勻，37°C、 150rpm溫和搖振60分鐘。將 200u L轉化菌液均勻地涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上。37。C倒置培養過夜，形成單菌落。計數白色、藍色菌落。挑選白色菌落進行鑒定。PCR
反應總體積15uL，體系組分為1.5uL10Xbuffer、 0. 12uL5腿ol/L dNTPs、 3 u L betaine、 1. 5 ii L 25mraol/L MgCl2， 5 mmol/L上下游引物各 0. 15uL、 11.85uL高壓滅菌雙蒸水。用經滅菌的10uL槍頭挑取白色菌 落，迅速地使挑取物溶入上述混合液中。在沸水上溫育10分鐘。將樣品 冷卻至室溫，離心數秒，然后加入TaKaRarTaq酶0.25iiL。按以下條件 進行PCR反應95。C預變性5分鐘，95。C變性30秒，6(TC退火30秒， 72。C延伸30秒，共40個循環。取PCR產物1 y L，點樣于含EB(O. 5mg/L) 的2g/kg瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V，電泳15min，紫外線透視儀下對凝 膠進行觀察和攝影。具體結果如圖2所示，其中，1、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 10為ALB基因菌落PCR擴增條帶(289bp) ， 11、 12、 15、 16為LPA基 因菌落PCR擴增條帶(239bp) ， 2、 9、 13、 14為不純條帶。 2.4.陽性克隆質粒抽提
1) 取1.5-5mL菌液，于室溫下10， 000rpm離心1分鐘以沉淀菌種。
2) 棄去培養基，往沉淀中加入250uL的ZL-I/RNaseA混和液，漩 渦振蕩使細胞完全重新懸浮。
3) 往重懸混和液中加入250 u L ZL-II和10u蛋白酶混和物，輕輕翻 轉試管4-6次混和溶液，獲得澄清的裂解液。
4) 往上述混和液中加入350uL ZL-III，溫和地上下顛倒離心管數 次，直至形成白色絮狀沉淀。于室溫下10，000rpm離心10分鐘。5) 取一干凈的Mu-Pu質粒微量分離柱裝在2mL收集試管上，小心吸 出上清，并將其轉置于柱子內，確保轉至柱內的上清中沒有細胞 雜質沉淀。
6) 室溫下10，000rpm離心l分鐘，使裂解液完全流過柱子。
7) 棄去離心甩出液，加入500iiL的ZL緩沖液到柱子上。
8) 室溫下10，000rpm離心l分鐘，除去殘余的蛋白質。
9) 棄去收集液，加入750 u L用乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子， 室溫10， OOOrpm離心1分鐘，棄去洗滌液。
10) 重復上述步驟，再用750 u L的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子一次。
11) 室溫下10， OOOrpm離心空柱1分鐘，以甩干柱子基質。
12) 將柱子置于一干凈的1.5mL小離心管中，直接加入50-lOOliL滅 菌去離子水至柱子基質上，10， 000rpm離心1分鐘以洗脫出DNA。
13) 應用核酸蛋白分析儀測定D260nm，并計算提取質粒的含量，質粒 -20。C保存備用。
14) 將抽提出的DNA進行測序鑒定。
3.Taqman熒光定量PCR檢測方法的建立
使用ABI7300實時熒光定量PCR儀，在PCR反應體系中使用不同的 Mg2+、探針、引物的濃度以確定最佳反應體系PCR反應總體積25uL，體 系組分為5tiL 5 X buffer 、 5yL betaine、 0. 5 ii L 250腿ol/L MgCl2、 0. 5 u L 10畫1/L dNTPs、 2. 5 y mol/L LPA基因禾口 ALB基因上下游引物各 0. 5 y L、 20 u mol/L LPA基因禾口 ALB基因Taqman熒光探針各0. 2 y L、 0. 25 u L T叫DNA聚合酶、1. 35u L高壓滅菌雙蒸水、DNA模板10u L。其中LPA探針選自SEQ IDN0: 1的序歹U，其正向引物包括SEQ ID NO: 3序列， 反向引物包括SEQ ID NO: 4序列；ALB探針選自SEQ ID NO: 2的序歹ij， 其正向引物包括SEQ ID NO: 5序列，反向引物包括SEQ ID NO: 6序列。 反應條件9(TC預變性1秒，95。C變性2分30秒；95。C退火15秒；60 r延伸l分鐘，共40個循環。
4. 標準曲線的建立
(1) 根據公式拷貝數=(濃度乂 1023 乂6.02)/(分子質量乂109)，應用高 壓滅菌雙蒸水將不同濃度的LPA質粒和ALB質粒稀釋至等拷貝數；
(2) 將等拷貝數的LPA質粒和ALB質粒振蕩混勻作為模板，以105、 104、 103、 102、 IO倍梯度稀釋，按步驟3所述體系在ABI7300熒光定量PCR儀 上擴增檢測，每份模板重復三次，根據所得的擴增曲線建立相應的標準曲 線。
5. 樣本檢測
PCR反應總體積25 u L，體系組分為5 u L 5 Xbuffer、 5 u L betaine、 0. 5 u L 250畫1/L MgCl2、 0. 5 u L 10畫1/L dNTPs、 2. 5 y mol/L LPA基因和ALB基因上下游引物各0. 5 u L、 20 u mol/L LPA基因和ALB基 因Taqman熒光探針各0. 2 u L、 0. 25 u L Taq DNA聚合酶、1. 35 u L高壓 滅菌雙蒸水、DNA模板10uL。反應條件90。C預變性1秒，95。C變性2 分30秒；95。C退火15秒；6(TC延伸1分鐘，共40個循環。樣本基因組 DNA濃度為2ng/uL，陰性對照的模板為高壓滅菌雙蒸水，標準品為實施 例1中所述的濃度梯度的質粒。每份模板重復三次，根據標準品的擴增曲 線建立相應的標準曲線，計算樣本LPA基因拷貝數。實施例2 Taqman實時熒光定量PCR體系穩定性檢測 1.對濃度20ng/u L的人基因組DNA按10倍濃度梯度稀釋后，按照 實施例l步驟5對各濃度梯度進行檢測，結果顯示(見表l):各濃度組 CT值變異系數均在合理范圍(<5%)，組間離散度小，表明人基因組DNA 在2-20ng/txL的濃度范圍內均可按以上方法進行擴增。其中，在濃度為 2ng/iiL組，LPA和ALB的變異系數最小(0. 35 ^0.4)，差值最小，提 示2ng/ u L是人基因組DNA檢測較為合適的濃度。
濃度循環閾值(CT)變異系數
(ng/uL)123平均值(標準差)ccv%)
20LPA21. 57621.41621.89021. 627(0. 241)1.11
ALB23.06322. 57023. 08822. 907(0, 292)1. 272 .LPA25.29725.12625.17325.199(0. 088)0. 35
ALB26.37626.21726.17426.256(0. 106)0. 40
0.2LPA28.76628.45028. 73228.649(0. 173)0. 60
ALB29.85729.49529. 22229.525(0.319)1.08
0. 02LPA32. 04731. 97731.54731.857(0. 565)1. 77
ALB32. 77432. 27431.64732.232(0. 271)0. 84
表l
2.對拷貝數107 u L的質粒標準品按10倍等拷貝數梯度稀釋后， 按照實施例1步驟5對各濃度梯度進行檢測，結果顯示(見表2):各濃 度組CT值變異系數均在合理范圍(<5%)，組間離散度小，表明在102-107 li L的范圍內建立的標準曲線穩定性好,可用于LPA基因拷貝數變異的檢拷貝數循環閾值(CT)變異系數
(pg/yL)123平均值(標準差)(CV90
105LPA19. 76719.70219. 76219.744(0. 362)1.83
ALB22. 24622, 07122. 00122. 106(0.126)0. 57
104LPA23. 0222.86522.90422. 930(0.081)0. 35
ALB25. 25925. 07225. 03125.121(0. 122)0. 49
103LPA26. 74026.45926. 48526. 561(0. 155)0. 58
ALB29. 24028.72028.77528.912(0. 286)0. 99
102LPA29. 85529.94130.14529. 980(0. 149)0. 50
ALB32. 46832. 04232. 29732. 269(0. 214)0. 66
表2
3.隨機挑選3例人基因組DNA樣本，測定，;OD260值后用高壓滅菌水稀釋至濃度為2ng// U L，按照實施伊J 1步驟5進行檢測，結果顯示(表3):各樣本CT值變異系數均在合理范圍(<5%)，組間離散度小，穩定性高。樣品循環閾值(CT)變異系數
(2ng/wL)123平均值(標準差)(cn)
1LPA23.68923.60823.68423.66(0. 045)0. 19
ALB25.68225. 79126.01625. 83(0. 170)0. 66
2LPA22. 83122. 67922. 76422. 758(0. 076)0. 34
ALB24.91424.89624. 94724. 919(0. 026)0. 10
3LPA24. 05324.11723. 96124. 044(0. 078)0. 33
ALB26. 09126. 09625. 89426. 027(0. 115)0.44
表3
本發明對于樣本拷貝數的定量方式采用絕對定量法。將樣本PCR產物 克隆至載體上，抽提質粒后經過測量濃度和拷貝數建立標準曲線。因質粒 的拷貝數可通過濃度換算，故可利用已知拷貝數的標準曲線來推算未知樣 本的量。因質粒是環狀DNA，不易降解，故具有準確、穩定的優點。本發 明建立的標準曲線參數顯示雙引物雙探針擴增條件下，單基因標準曲線相關系數r=0. 999，表明所建立的標準曲線可準確計算樣本DNA的絕對含 量及相對拷貝數。
本發明選擇人ALB基因為內參基因，利用雙引物雙探針法建立適合目 的基因(LPA)的Taqman實時熒光定量PCR檢測方法，通過比對不同的反 應組分，優化反應條件，減少雙引物競爭底物降低基因擴增效率的影響。 通過計算標準曲線參數以及重復樣本的變異系數，評估檢測方法的可行 性。該方法體系的建立對于今后應用Taqman實時熒光定量PCR檢測疾病 相關易感基因具有重要參考價值。本發明的人脂蛋白(a)基因拷貝數的 檢測與冠心病具有密切相關性，且本發明的檢測方法及試劑盒對冠心病的 預警診斷和高危人群早期篩查方面能發揮重要作用，有利于鑒別冠心病高 風險個體，盡早實施預防、監控、干預和/或治療，盡可能避免發病或延 遲發病。
實施例3人脂蛋白(a)基因拷貝數變異與冠心病的相關性研究
1. 從上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院心臟科2006年11月至 2007年5月住院病人中選取穩定性心絞痛患者203例和對照組207名， 采用實施例l中的檢測方法檢測人脂蛋白(a)基因拷貝數變異情況。
2. 利用SPSS13. 0 (SPSS Inc. ， Chicago, USA)進行統計分析。研 究共檢測到Nu^1、 2、 3三種人脂蛋白(a)基因拷貝數變異，其中N^A二1 為單倍體，N^=2、 3為多倍體，人脂蛋白(a)基因拷貝數變異在穩定性 心絞痛組和對照組的分布頻率具有顯著差異(義^=13. 614，代1X10—3)， 穩定性心絞痛組單倍體分布頻率顯著低于對照組(26.1% ^43.5%)，單 倍體相對比值比0^0.459(95。/。CI:0. 303-0. 697)。校正發病年齡、性別、體重指數、收縮壓、舒張壓、血糖、血脂、吸煙、血Lp(a)水平等相關因 素，經多因素Logistic回歸分析發現人脂蛋白(a)基因單倍體相對比 值比0R=0. 27(95%CI:0. 15-0. 489，尸<1 X 10—3)。結果表明，人脂蛋白(a) 基因拷貝數變異與穩定性心絞痛發病相關，穩定性心絞痛患者單倍體分布 頻率顯著降低，人脂蛋白(a)基因單倍體可能是穩定性心絞痛的保護因 素。進一步比較人脂蛋白(a)基因單倍體和多倍體攜帶者高Lp(a)血癥
(血Lp(a)^0.3g/L)與穩定性心絞痛的相關性后發現單倍體攜帶者穩 定性心絞痛組高Lp(a)血癥比例與對照組相似(36.7% ^40. 7%，尸〉 0.05);多倍體攜帶者穩定性心絞痛組高Lp(a)血癥比例顯著高于對照組
(39.4% ^21. 7%， /M). 028)。校正發病年齡、性別、收縮壓、舒張壓、 體重指數、血脂、血糖、吸煙等相關因素，經多因素Logistic回歸分析 發現多倍體攜帶者，高Lp(a)血癥的相對比值比0R=2.246
(95%CI: 1.09-4. 631)。結果表明，人脂蛋白(a)基因單倍體、多倍體拷 貝數分布頻率不同影響了穩定性心絞痛患者高Lp(a)血癥的發生率。序列表
〈110〉上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
〈120〉人冠心病易感基因一脂蛋白a基因拷貝數變異檢測方法和試劑盒
〈160〉 6
〈210〉 1 <211〉 26 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial
〈400〉 1
TAGGTTGATG CTTCACTCTG TCTCCC 26
<210〉 2 〈211〉 27 〈212〉 DNA〈213> artificial <400> 2
CCTGTCATGC CCACACAMT CTCTCCC 27
<210> 3 〈211〉 23 〈212〉薩 <213> artificial
〈400〉 3
CTTGGATTGA GGGAATGATG AGA 23
〈210〉 4 <211〉 23 〈212〉 DNA <213〉 artificial<400> 4
CCTTACCCAC GTTTCAGCTT CTA 23
<210> 5 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial
〈400〉 5
GCTGTCATCT CTTGTGGGCT GT 22
〈210〉 6 〈211〉 21 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial
<400> 6ACTCATGGGA GCTGCTGGTT C 2權利要求
1、一種人脂蛋白a的基因拷貝數的檢測方法，其特征在于，采用實時熒光定量PCR方法，包括如下步驟(1)抽提與純化人外周血基因組DNA；(2)制備陽性質粒標準品；(3)建立Taqman熒光定量PCR檢測方法。
2、 根據權利要求1所述的人脂蛋白a的基因拷貝數的檢測方法，其 特征在于，步驟(3)所述建立Taqman熒光定量PCR檢測方法，以脂蛋白 a基因為目的基因，白蛋白基因為內參基因。
3、 根據權利要求2所述的人脂蛋白a的基因拷貝數的檢測方法，其 特征在于，步驟(3)所述建立Taqman熒光定量PCR檢測方法包括設計 探針和引物，建立擴增體系和建立標準曲線。
4、 根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述設計探針和 引物為針對所述的脂蛋白a基因和白蛋白基因分別設計合成2組Taqman 探針及引物。
5、 根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述脂蛋白a基 因的探針選自SEQ ID NO: 1序列，或其互補序列，或與SEQ ID NO: 1 及其互補序列至少70%同源性的序列；LPA探針正向引物包括SEQ ID NO: 3序列，或其互補序列，或與SEQ ID NO: 3及其互補序列至少70%同源性 的序列；反向引物包括SEQ ID NO: 4序列，或其互補序列，或與SEQ ID NO: 4及其互補序列至少70%同源性的序列。
6、 根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，LPA探針選自SEQID NO: l序列，LPA探針正向引物包括SEQ ID NO: 3序列，反向引物包 括SEQ ID NO: 4序列。
7、 根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述脂蛋白a基 因的探針的熒光標記選擇FAM為熒光報告基團，白蛋白基因的探針的熒光 標記選擇VIC為熒光報告基團，兩者的淬滅基團均為TAMRA。
8、 根據權利要求3所述的人脂蛋白a的基因拷貝數的檢測方法，其 特征在于，所述的建立標準曲線包括如下步驟將標準品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進行PCR反應； 以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的CT值為縱坐標，繪制 標準曲線；對未知樣品進行定量時，根據未知樣品的CT值，即可在標準曲線中 計算出樣品的拷貝數。
9、 一種利用權利要求1所述的方法檢測人脂蛋白a的基因拷貝數的 試劑盒。
10、 權利要求1所述的檢測方法和權利要求9所述的試劑盒在冠心 病預警診斷和高危人群早期篩查中的應用。
全文摘要
本發明涉及基因拷貝數實時熒光定量PCR檢測，公開了一種冠心病相關的人脂蛋白a基因拷貝數檢測方法及其試劑盒，該方法包括如下步驟(1)抽提與純化人外周血基因組DNA；(2)制備陽性質粒標準品；(3)建立Taqman熒光定量PCR檢測方法。以脂蛋白a基因為目的基因，白蛋白基因為內參基因，并利用雙引物雙探針法建立適合目的基因的定量PCR檢測方法。還建立標準曲線，并通過計算標準曲線參數以及重復樣本的變異系數，評估檢測方法的可行性。該方法及試劑盒在冠心病預警診斷和高危人群早期篩查方面能發揮重要作用，有利于鑒別冠心病高風險個體，盡早實施預防、監控、干預和/或治療，盡可能避免發病或延遲發病。
文檔編號C12Q1/68GK101619346SQ20081004359
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月4日 優先權日2008年7月4日
發明者吳志俊, 盛海輝, 肖華勝, 瑋 金 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院