人載脂蛋白ai米蘭突變體基因及其表達方法

專利名稱：人載脂蛋白ai米蘭突變體基因及其表達方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域中一種人載質蛋白AI米蘭突變體基因及其表達方法。
背景技術：
載脂蛋白AI米蘭突變體(apolipoprotein A-I-Milano，AIM)是載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)的天然突變體。具有比apoA-I更強的抗動脈粥樣硬化癥的功能。
apoA-I是高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)最主要的蛋白成分，與HDL顆粒的形成和代謝有關。它作為膽固醇的受體與動脈管壁細胞上膽固醇結合，將膽固醇從動脈管壁排出到HDL表面；它還是卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶(Lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)的主要激活劑，激活LCAT將膽固醇變成膽固醇酯并進入HDL的內部；它還作為肝細胞上HDL受體的配體與肝細胞結合，將膽固醇轉移至肝進行代謝。因此，apoA-I在膽固醇的逆向轉運(Reversecholesterol transport，RCT)和HDL代謝中中起關鍵作用。膽固醇的逆向轉運是將散布、沉積在周圍組織中未脂化的膽固醇經LCAT的催化轉化成膽固醇酯進入HDL，然后轉運到肝臟，在肝臟進行代謝，排入膽囊。
研究證明，血漿中HDL的含量與冠狀動脈疾病(Coronary artery disease，CAD)的發生呈負相關性，即HDL含量越高，CAD的發病率越低。流行病學調查表明，人群中HDL-膽固醇水平低于0.907mmol/L(＜35mg/dL)者，冠心病發病的危險性為HDL-膽固醇(HDL-cholesterol，HDL-C)高于1.68mmol/L者的8倍。HDL-C水平每上升0.026mmol/L(1mg/dL)，患冠心病的危險性則下降2％-3％。研究認為，HDL的這種功能主要是由于apoA-I的作用，通過RCT，將動脈管壁中的膽固醇轉運到肝的緣故；并表明，血漿中apoA-I的水平與CAD和冠狀動脈損傷呈負相關(Sedlis SP，et al(1986)Circulation 73978-984)。
AIM是第一個被發現的apoAI的天然變體(FranceschiniG，et al(1980).A-IMilanoapoprotein.Decreased high density lipoprotein cholesterol levels withSignificant lipoprotein modifications and without clinical atherosclerosisin an Italian family.JClin Invest 66892-900)，AIM與apoA-I的主要區別在于apoAI的Arg173突變成Cys173，70％的AIM通過Cys173之間的二硫鍵形成二聚體，30％的AIM仍以單體形式存在。AIM二聚體的每條單鏈由243個氨基酸組成。在生理狀態下，AIM是在肝臟和小腸合成的，合成時經蛋白質翻譯后加工，每條單鏈的N端都保留了6個氨基酸的前肽序列；AIM分泌入血后在血漿中這6個氨基酸被特異性的蛋白酶酶解而形成成熟的AIM，進而發揮生理功能。
AIM主要存在于意大利一個村莊的部分居民中。攜帶有AIM的居民血漿中高密度脂蛋白膽固醇的含量比正常人低，甘油三脂的含量卻比正常人高，盡管存在這些危險因素，但是這些居民卻很少患冠狀動脈疾病，而且長壽。研究表明，這是由于AIM具有獨特的結構和功能特性，而AIM單體和apoA-I卻具有非常相似的性質。與apoAI相比較，AIM的構象更穩定，在血漿中的半衰期延長(Calabresi L，et al(1991).JBiol Chem 26932168-74)；而且，鏈間二硫鍵使AIM形成了一個新的結構域，結合脂的能力大大增強，能更有效地排出細胞中的膽固醇，且較少的底物就可激活LCAT；同時，AIM單體游離的巰基還可以防止脂類物質的氧化，因此，AIM比apoAI的抗動脈粥樣硬化的能力更強。
Franceschini等用含AIM的sHDL多次注射用膽固醇喂養的載脂蛋白E缺陷鼠，可明顯減輕動脈粥樣硬化癥的進程，減少斑塊中脂和巨噬細胞的含量，降低炎癥反應(Shah PK，et al(1998).Circulation 97780-785)。用類似的方法，Soma等在周圍頸動脈傷害動物模型上也觀察到了相似的結果。這些結果都證明AIM可治療和預防動脈粥樣硬化癥。此外，Ameli等用含AIM的sHDL多次注射用膽固醇喂養的兔，還有效地抑制了血管成形術后的再狹窄70％。基于大量的實驗依據，Esperion公司以治療動脈粥樣硬化癥作為適應癥，在臨床前的動物試驗中，采用高劑量的重組AIM注射載脂蛋白E缺陷鼠，能迅速排出周圍組織細胞中的膽固醇，減少斑塊中的脂質和巨噬細胞的含量，使斑塊達到穩定的表型(Soma MR，et al(1995).Recombinantapolipoprotein A-I Milano dimmer inhibits carotid intimal thickening inducedby perivascular manipulation in rabbits.Cir Res 76405-411)。據源自美國FDA生物制品研究與開發公告，Esperion公司研制的重組AIM以動脈粥樣硬化癥為適應癥，已完成I期臨床試驗，目前已進入II期臨床研究階段。因此，重組AIM有可能成為理想的治療和預防動脈粥樣硬化癥的新藥。
動脈粥樣硬化斑塊形成是動脈粥樣硬化心血管病和動脈粥樣硬化腦血管病的主要病因。該病癥現在尚無良藥可治，美國和歐州有1/3的人口患有動脈粥樣硬化心腦血管疾病，我國也有近一億人患有動脈粥樣硬化心腦血管疾病，該病是全世界發病率最高、預防和治療花費最多的病種之一。因而，抗動脈粥樣硬化藥(ant iatherosclerotic drugs)的研究日益受到重視，世界各大制藥公司都在全力開發治療該病的藥物，但現在尚是空白。AIM和apoA-I對治療動脈粥樣硬化疾病藥物的研制具有特別重要的意義，為防病治病帶來十分誘人的前景。
AIM的臨床用量很大，臨床劑量在克級水平，因此，AIM用于臨床治療不可能從血液中提取，必須依賴基因工程技術進行重組產品的大規模生產。
近年來，隨著apoA-I分子生理功能的發現，已有人嘗試用基因工程技術來表達apoA-I，已有apoA-I在CHO細胞和桿狀病毒昆蟲表達系統獲得表達的報道。據報道，apoA-I在CHO細胞中的表達水平很低；在桿狀病毒昆蟲表達系統中最高可達到80mg/L。但由于目前國際上用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統生產重組產品其技術體系尚不成熟；再則，apoA-I是一種非糖基化蛋白，因而用原核表達系統表達apoA-I是一種較為理想的選擇。
大腸桿菌表達系統是最早被用來生產重組蛋白質的，其大規模高密度的發酵工藝比較成熟。缺點是缺乏內質網、高爾基體等細胞器，不能對蛋白質進行有效的折疊和翻譯后的修飾與加工。AIM是一個非糖基化蛋白，不必進行糖基化修飾，而且僅有一對二硫鍵。若能在大腸桿菌中獲得高表達，也是一種較為理想的選擇。
發明創造內容本發明的一個目的是提供一種在大腸桿菌中具有較高表達量的人載脂蛋白AI米蘭突變體基因。
本發明所提供的人載脂蛋白AI米蘭突變體基因，名稱為proAIME，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列3的核苷酸序列；2)與序列表中序列3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID No3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS，65℃。
本發明的人載脂蛋白AI米蘭突變體基因含有由6個氨基酸殘基組成的前肽的編碼基因序列，即序列表中序列3的自5′端第1-18位堿基。序列表中序列3的自5′端第19-747位堿基為成熟肽AIM的編碼基因。
含有上述人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的重組表達載體、細胞系和工程菌均屬于本發明的保護范圍，如重組表達載體pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME或pQE30-proAIME等，工程菌pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)或pQE30-proAIME/JM109等。
本發明的另一個目的是提供一種表達上述人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的方法。
本發明所提供的表達上述人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的方法，是將含有上述人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的重組表達載體導入大腸桿菌中，培養所得到的重組大腸桿菌，表達得到人載脂蛋白AI米蘭突變體。
所述大腸桿菌可為菌株BL21(DE3)、JM109、DH5α或HB101等。
用于構建所述含有上述人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的重組表達載的出發載體可為在能菌株BL21(DE3)中表達目的基因的pET系列載體(如pET22b)或pTIG-Trx；能在菌株JM109中表達目的基因的pQE30。
所述重組表達載體優選為pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME和pQE30-proAIME。
所述重組大腸桿菌可在碳源為葡萄糖型碳源、pH可為6-7的培養基中37℃培養至對數生長期，然后以0.5-1mmol/L的IPTG誘導表達3-8小時。
所述葡萄糖型碳源可為葡萄糖、甘露糖或甘油。
在本發明的方法中，將proAIME插入質粒、轉化大腸桿菌宿主菌、大腸桿菌工程菌的篩選、工程菌的發酵以及產物的分離等技術基本上按本領域已知的常規方法進行(例如Sambrook等人，分子克隆實驗指南(第三版)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，2001)。
為了提高proAIM(帶有前肽的AIM基因)在大腸桿菌中的表達量、防止其降解，本發明將proAIM的N-末端的氨基酸密碼子優化后得到基因proAIME，并構建了三種原核表達載體pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME和pQE30-proAIME，分別轉化相應的宿主菌株BL21(DE3)和JM109，實驗結果表明proAIM在pQE30-proAIM/JM109中表達量最高(請提供表達量的具體數值)，但存在部分包涵體；proAIM在pET22b-proAIM/BL21(DE3)中的表達量其次，其中在搖瓶里的表達量約為100mg/L，約占菌體總蛋的38％，在5升發酵罐上的表達量約為1-2g/L。proAIM在大腸桿菌里主要以單體的形式表達。表達產物經Butyl Sepharose 4F.F疏水層析和QSepharose HP陰離子交換層析后，再用Vivaspin20(30,000MW)進行超濾，proAIM單體的純度達95％以上。
本發明表達的proAIM單體與脂結合活性表明，proAIM單體結合脂的速度比proapoA-I慢，但結合脂的量比proapoA-I高。N-末端氨基酸序列測定結果和理論序列一致。分子量測定結果與理論值相符。Western印跡表明，本發明表達的proAIM單體和二聚體都可以與apoA-I多克隆抗體發生反應。
據研究表明，在大腸桿菌表達系統中直接表達成熟的apoA-I時，由于apoA-I分子在宿主細胞內易降解，不穩定，因此表達量較低。而表達帶有6個氨基酸前肽的apoA-I，不僅使表達水平顯著提高，而且還能有效地防止apoA-I分子在宿主細胞內被降解，增加其分子結構的穩定性；另外，由于其前肽需要在血液中用特異性的蛋白酶酶解而形成成熟的apoA-I，因而還能斷定，如果作為生物制品直接靜脈注射proapoA-I和apoA-I二種蛋白分子，在血液中藥物代謝的半衰期前者應該更長。在本發明中還發現，apoA-I和AIM的N端結構基因的密碼子對目的基因的表達影響很大；且考慮上述apoA-I的前肽影響蛋白質結構的穩定性和增加表達量，故在本發明中，組合了保留6個氨基酸前肽和優化結構基因N端的密碼子二項創新措施，直接表達帶有前肽的N端密碼子的proAIM結構基因。在本發明中，將proAIM結構基因的N端8個氨基酸和前肽的氨基酸密碼子用大腸桿菌偏愛密碼子作了同義突變，并用DNA Star軟件對proAIM mRNA 5’端的基因序列進行優化，消除其DNA二級結構，進而將proAIME基因克隆到大腸桿菌表達載體上，結果表明，proAIM在大腸桿菌表達系統獲得了高水平的表達，且目的蛋白分子穩定性好，在5L發酵罐中誘導表達16h，沒有發現proAIM降解條帶。另據蛋白質化學和生物大分子結構特性，由于proAIM同樣需要在血液中用特異性的蛋白酶酶解而形成成熟的AIM，因而同樣能夠推斷，proAIM在血液中代謝的半衰期應該較AIM更長。
本發明在大腸桿菌中獲得可溶性表達的proAIM，表達產物直接分泌到細胞周質，發酵液內分泌表達的水平高達1-2g/L，且分離工藝簡便。如果通過發酵生產工藝的優化，大腸桿菌工程菌還有進一步提高表達量的潛力。
本發明的基因及表達方法為proAIM和AIM的功能研究和應用研究奠定了物質基礎。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。


圖1a為PCR鑒定重組質粒pET22b-proAIME的電泳圖譜圖1b為PCR鑒定重組質粒pTIG-Trx-proAIME的電泳圖譜圖1c為PCR鑒定重組質粒pQE30-proAIME的電泳圖譜圖2a為pET22b-proAIME/BL21(DE3)表達產物的SDS-PAGE分析圖譜圖2b為pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)表達產物的SDS-PAGE分析圖譜圖2c為pQE30-proAIME/JM109表達產物的SDS-PAGE分析圖譜圖2d為pET22b-proAIME/BL21(DE3)，pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109表達的proAIM的百分含量比較柱狀3為pET22b-proAIME/BL21(DE3)表達的proAIM經Butyl柱和Q柱純化后的SDS-PAGE分析圖譜圖4為pET22b-proAIME/BL21(DE3)表達的proAIM與DMPC的結合曲線圖5為proAIM的Western印跡圖譜具體實施方式
質粒及培養條件質粒pET22b(購買自Novagen公司)；質粒pTIG-Trx(質粒pTIG-Trx由質粒pET22b衍生而來，在T7啟動子下游增加了硫氧還蛋白Trx基因)；質粒pQE30(劉純杰等幽門螺桿菌尿素梅B基因的克隆與高效表達。細胞與分子免疫學雜志2001；17(5)464)。大腸桿菌用LB培養基培養。
工具酶和試劑Pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司，限制性內切酶NdeI和EcoRI購自TaKaRa公司。T4DNA連接酶購自華美公司。DMPC和從血漿中提取的人proApoA-I購自Sigma公司。Butyl Sepharose 4F.F.16×100mm為自裝柱，其填料和Q Sepharose HighPerformance 16/100購自Pharmacia公司。
引物設計與合成為了克隆AIM基因，先設計一對內部引物，通過RT-PCR從胎肝的總RNA文庫中克隆出帶有前肽的proapoA-I基因片段，再設計一對突變引物，將proapoA-I基因片段的Arg179突變成Cys179，即帶有前肽的proAIM基因片段。最后，根據不同的目的設計不同的引物。所有設計引物如下引物15’-CGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3’引物25’-CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3’引物35’-GACGAGCTGCGCCAG GCTTGGCCGCGCGCC-3’引物45’-GGCGCGCGGCCAAGC CTGGCGCAGCTCGTC-3’引物55’-GG TAATGAGACATTTCTGGCAGCAAGA-3’引物65’-GGG CTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT-3’引物75’-AA ATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGACACTTCTGGCAACAGGA-3’其中引物1和2是一對內部引物。引物3和4是Arg179→Cys179突變引物，將CGC突變成TGC。引物5和6為給proAIME片段加上EcoRI和HindIII酶切位點，以便將其連接到pTIG-Trx載體上。引物7和6是將proAIME片段連接到pQE30載體上的上下游引物，酶切位點為EcoRI和HindIII。
根椐大腸桿菌的偏愛性密碼子，再結合pET22b、pTIG-Trx和pQE30載體上核糖體結合位點附近的序列，用DNA Star軟件將AIM基因片段的N-末端的前8個氨基酸和其前肽氨基酸的密碼子進行序列優化。用作序列優化的同義突變的引物為M1和M2，M15’-CAAGACGAGCCACCGCAGAGTCCATGGGATCGAGTGAAGGACCTG-3’
M25’-AGACATTTCTGGCAGCAAGACGAGCCACCGCAGAGT-3’。
再設計一對上下游引物將目的基因連接到pET22b載體上。
上游引物P15’-TTT AGACATTTCTGGCAGCAAGA-3’，下游引物P25’-CC CTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3’。其中上游引物引入NdeI酶切位點；下游引物引入了EocRI酶切位點和兩個終止密碼子。
實施例1、proAIM基因的克隆通過RT-PCR從胎肝的總RNA文庫中釣取proapoA-I基因(帶有前肽的apoA-I基因)的cDNA，再用特異性的內部引物通過PCR擴增出proapoA-I基因，最后通過重疊PCR將proapoA-I基因第535位的Arg密碼子CGC突變成Cys的密碼子TGC，即proAIM基因(帶有前肽的AIM基因)。具體步驟如下1、RT-PCR釣取proapoA-I基因的cDNA將1μl引物2、11μl總RNA、1μl dNTP混勻，65℃加熱5min，冰浴5min，再加入4μl緩沖液、2μl DTT、1μl Rnasin并混勻，42℃加熱2min，然后加入1μlSuperscritII逆轉錄酶，42℃加熱50min，45℃加熱10min，72℃加熱15min，最后加入1μl RNase H，37℃加熱20min。這就是proapoA-I基因的cDNA，放4℃保存。
2、PCR克隆proapoA-I基因Pfx DNA聚合酶反應體系proapoA-I cDNA 1μl引物1 2μl引物2 2μldNTP 1μl10× Pfx擴增緩沖液 5μl10× PCRx增強液(Enhancer Solution) 5μl50mmol/L MgSO41μlPfx DNA聚合酶 0.4μlddH2O 32.6μl總體積 50μlPCR循環條件94℃變性15sec，55℃退火30sec，68℃延伸50sec，30個循環。
3、PCR產物電泳回收對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶快速回收試劑盒回收750bp的條帶，步驟如下從凝膠上切下目的DNA片段，放在1.5ml Eppendorf管中，用Tip吸頭輕柔地將其搗碎；加入3倍體積的溶膠液，室溫放置5min，其間輕搖幾次，使膠完全融化；加入10μl玻璃奶，顛倒混勻，冰浴放置10min，間隔2-3min混勻一次；加入250μl漂洗液，將玻璃奶混勻，12000rpm離心30sec，吸棄上清；再重復洗滌一次，離心后將漂洗液吸干凈，放入37℃的溫箱干燥15-20min；最后加入適量的蒸餾水，混勻，60℃水浴5min，12000rpm離心1min，回收上清，即回收的DNA片段。
4、通過重疊PCR將proapoA-I基因突變成proAIM基因通過三次PCR將proapoA-I基因突變成AIM基因。第一次PCR擴增突變位點第535位的5’端片段，模板為步驟3中回收的DNA片段，引物為引物1和4，其余反應體系同步驟3，循環條件除延伸時間為40sec外，也同步驟3；第二次PCR擴增突變位點第535位的3’端片段，模板為步驟3中回收的DNA片段，引物為引物3和2，其余反應體系同步驟3，循環條件除延伸時間為15sec外，也同步驟3。第三次PCR將前兩次PCR擴增的片段連接在一起，模板是前兩次PCR擴增的片段，引物為引物1和2，除Pfx DNA聚合酶反應體系中的模板為0.5μl第一次PCR擴增的片段和0.5μ1第二次PCR擴增的片段外，反應體系和循環條件同步驟3。對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，按照步驟3中的方法用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶快速回收試劑盒回收750bp的條帶，將回收的片段克隆到pPIC9載體上，然后送軍事醫學科學院生物工程研究所DNA合成和序列分析實驗室測序，測序結果與NCBI基因庫中的人proAIM基因序列完全一致，表明本發明克隆的proAIM基因正確。proAIM基因及其所編碼的蛋白序列如序列表中的序列1和序列2所示，序列1中自5′端第535-537位堿基TGC由CGC突變而來，使proAIM氨基酸序列即序列2的自氨基端第179位為Cys179(由Arg179突變成)。
本實施例用特異性的內部引物通過RT-PCR和PCR從胎肝的總RNA文庫中釣取proapoA-I基因，再用一對突變引物通過重疊PCR將proapoA-I基因第535位的Arg密碼子CGC突變成Cys密碼子TGC，即成為帶有前肽的AIM基因，也就是proAIM基因。proAIM基因全長747bp，共編碼249個氨基酸，其中前6個氨基酸為AIM的前肽，后243個氨基酸為AIM的成熟肽。
實施例2、proAIM基因N-末端氨基酸密碼子優化根椐大腸桿菌的偏愛性密碼子，再結合pET22b、pTIG-Trx和pQE30載體上核糖體結合位點附近的序列，用DNA Star軟件將AIM基因片段的N-末端的前8個氨基酸和其前肽氨基酸的密碼子進行序列優化。優化是通過用序列優化的同義突變的引物、進行兩次PCR來完成的第一次PCR的模板是測序正確的proAIM基因，引物是引物M1和2，第二次PCR的模板是第一次PCR的產物，引物是引物M2和2，用Pfx DNA聚合酶反應體系和循環條件(同實施例1的步驟3)。經過兩次PCR后，proAIM基因N-末端氨基酸密碼子優化前后的序列如下突變前CGGCAT TTC TGG CAG CAAGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTGG GAT突變后AGACAT TTC TGG CAG CAAGACGAGCCACCGCAGAGTCCTTGG GAT氨基酸 RH F R Q QD E P PQS PW D其中前六個氨基酸RHFRQQ是AIM的前肽，DEPPQSPW才是成孰的AIM蛋白的前8個氨基酸，劃有橫線的部分為已作同義突變的氨基酸密碼子，proAIM基因N-末端氨基酸密碼子優化后得到的proAIME如序列表中的序列3。
實施例3、proAIME的表達1、表達載體的構建1)表達載體pET22b-proAIME的構建以proAIME為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增，將擴增的PCR產物純化后進行NdeI和EocRI酶切反應，然后連接到經同樣酶切的pET22b載體上，構建成pET22b-proAIME重組質粒，此重組質粒不含pET22b載體上的PelB信號序列。將重組質粒轉化DH5α，鋪板，挑選單克隆、搖菌，用菌液PCR篩選陽性克隆，篩選出含重組質粒pET22b-proAIME陽性克隆(圖1a)，圖1a中，M為DNA分子量標準DL2000；1、4、5為陽性克隆，2，3為陰性結果。將陽性克隆的重組質粒進行測序，測序結果用BLAST比較，表明克隆到pET22b載體的proAIME基因片段序列正確，起始密碼子和翻譯框架與預先設計相一致，說明表達載體pET22b-proAIME構建成功。
2)構建pTIG-Trx-proAIME表達載體除所用的引物是引物5和6，酶切位點是EcoRI和HindIII，質粒是pTIG-Trx外，其余方法同步驟1)。其中，陽性克隆的篩選結果如圖1b所示，圖中，1為DNA分子量標準DL2000，4、5為陽性克隆，2、3、6為非陽性克隆。送4號菌質粒測序，測序結果表明，proAIME基因片段序列正確，起始密碼子和翻譯框架與預先設計相一致。表明pTIG-Trx-proAIME表達載體構建成功。
3)構建pQE30-proAIME表達載體除所用的引物是引物6和7，酶切位點是EcoRI和HindIII，質粒是pQE30外，其余方法同步驟1)。其中，陽性克隆的篩選結果如圖1c所示，圖中，1為DNA分子量標準DL2000，3為陽性克隆，2、4、5、6為非陽性克隆。送3號菌質粒測序，測序結果表明，proAIME基因片段序列正確，起始密碼子和翻譯框架與預先設計相一致。表明pQE30-proAIME表達載體構建成功。
2、大腸桿菌工程菌的誘導表達將測序正確的表達載體pET22b-proAIME和pTIG-Trx-proAIME轉化宿主菌株BL21(DE3)，pQE30-proAIME轉化宿主菌株JM109。挑單菌落制備種子液，按1％的比例接種于裝有20ml pH為6的LB培養基(含氰霉素60μg/ml)的100ml搖瓶中，37℃培養至0D600約為0.8，加入IPTG至終濃度為1mM繼續誘導5h。收集發酵菌體，完全超聲破碎后離心，分成上清和沉淀兩部分，沉淀洗滌兩次，分別進行15％SDS-PAGE，pET22b-proAIME/BL21(DE3)的表達結果如圖2a所示，pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)的表達結果如圖2b所示，pQE30-proAIME/JM109的表達結果如圖2c所示，表明在29KD處均有一特異性的目的蛋白表達條帶，與分子量理論值相符，空載質粒誘導菌無此條帶，表明有目的蛋白表達，除pQE30-proAIME/JM109轉化菌表達的AIM存在部分包函體、主要以可溶形式表達外，其余的都獲得了可溶性表達。圖2a-2c中，1為蛋白質分子量標準，2為表達proAIM的全菌裂解液，3為裂解液的上清部分，4裂解液的沉淀部分。沉淀鏡檢全部為細胞碎片。
然后將電泳凝膠送軍事醫學科學院生物工程研究所DNA合成和序列分析實驗室進行凝膠掃描，測定proAIM占菌體總蛋白的百分含量，比較proAIM表達量的高低。結果如圖2d所示，表明在相同條件下，表達proAIM從高到低的順序依次是pQE30-proAIME/JM109，proAIM約占菌體總蛋白的55％；pET22b-proAIME/BL21(DE3)，AIM約占菌體總蛋白的42％；pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)，proAIM約占菌體總蛋白的5％。其中pET22b-proAIME/BL21(DE3)工程菌在搖瓶中表達proAIM約100mg/L。圖2d中，1為pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)，2為pQE30-proAIME/JM109，3為pET22b-proAIME/BL21(DE3)。
3、proAIM的純化和純度分析分別取20g步驟2中得到的pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)、pQE30-proAIME/JM109濕菌體，用緩沖液A(20mM Tris-HCl、100mM NaCl、1mM EDTA，pH8.1)洗滌一次，離心，棄上清，菌體再用150ml的緩沖液A重懸，超聲破碎30min，離心后取上清，過濾后進行Butyl Sepharose 4F.F疏水層析。分別用10×緩沖液A、緩沖液B(80％緩沖液A+20％乙二醇)、緩沖液C(60％緩沖液A+40％乙二醇)和緩沖液D(20mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.1)；緩沖液E(40％緩沖液D+60％乙二醇)洗脫至基線。收集個蛋白峰進行SDS-PAGE分析。
然后將60％乙二醇的洗脫液(含proAIM的樣品)用3×體積的緩沖液F(20mMTris-HCl、1mM EDTA、pH7.9)稀釋后，進行QSepharose High Performance16/100離子交換層析。用緩沖液G(20mM Tris-HCl、400mM NaCl、1mM EDTA，pH7.9)進行線性梯度洗脫。洗脫緩沖液G的梯度為20個柱體積內從0％-100％。收集各蛋白峰進行SDS-PAGE分析。將Q柱純化后的proAIM經Vivaspin20(30,000MW)超濾管超濾后，進行15％SDS-PAGE(SDS-PAGE還原電泳)，然后通過凝膠掃描來檢測樣品的純度。pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109表達的proAIM的純化結果如圖3所示，表明Q柱純化后的proAIM單體中混有少量的proAIM二聚體，proAIM單體的純度達99％。圖3中，1為分子量標準，2為未經層析純化的菌體破碎上清液，3為Butyl Sepharose 4F.F.純化后的proAIM，4為QSepharose H.P.純化后的proAIM(還原型)，5QSepharose H.P.純化后的proAIM(非還原型)。
實施例4、重組proAIM的生化特性及活性1、N-末端氨基酸殘基分析pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109誘導表達的菌液樣本進行SDS-PAGE還原電泳后，通過電轉移的方法將蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜經染色和脫色后，送軍事醫學科學院儀器分析中心色譜室測序。本發明表達的proAIM的N-末端測序結果表明，N-末端的六個氨基酸為Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln，與理論序列一致。
2、本發明表達的proAIM的分子量測定采用反相HPLC色譜對實施例3中經部分純化的pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109誘導表達的proAIM樣品進行進一步純化，純化樣品凍干后送軍事醫學科學院儀器分析中心質譜室進行質譜分析，測定proAIM的分子量。純化柱為C8反相HPLC柱，A液為H2O+TFA，B液為乙腈+TFA，流速為0.5ml/min，洗脫梯度為在60min內B液從0％到100％。結果表明本發明表達的proAIM單體和二聚體的分子量分別為29031KD和58045KD，與理論值29037和58074非常接近，在誤差允許的范圍之內，說明本發明表達的proAIM單體和二聚體都未發生降解。
3、本發明表達的proAIM單體的活性測定proAIM單體的活性可通過測定proAIM與脂質DMPC的結合能力來測定。當proAIM與脂質DMPC結合后，將脂質分子DMPC有機地排列起來，A325nm的吸光值會下降。具體方法如下將10mg DMPC溶解在1ml氯仿里，用氮氣吹干后，在真空中干燥2h。加入3.2ml的STB，充分振蕩后，在4℃超聲破碎30min。取三個Eppendorf管，每管加入800μl超聲破碎后的DMPC脂質體，然后分別加入200μl STB、200μl含1mg proapoA-I(從血漿中提取的標準品)的STB和200μl含1mg本發明表達的proAIM的STB，使DMPC/本發明表達的proAIM的質量比為2.5比1。前兩管分別是空白對照和標準對照。迅速振蕩混勻，室溫下測定325nm的光吸收值A325。每2min測定一次，測60min。觀察A325值的變化。結果如圖4所示，表明不加載脂蛋白的空白對照A325nm的吸光值僅有極少量的下降，對照人血漿proapoA-I的A325nm的吸光值下降速度快，迅速達到平衡，本發明表達的proAIM單體的A325nm的吸光值下降速度比proapoA-I慢，但A325nm的吸光值下降的幅度比proapoA-I大。說明本發明表達的proAIM單體結合脂的速度比proapoA-I慢，但結合脂的量比proapoA-I多。這表明本發明表達的proAIM單體具有脂結合活性。
實施例5、利用pET22b-proAIME/BL21(DE3)生產proAIM1、發酵pET22b-proAIME/BL21(DE3)生產proAIMpET22b-proAIME/BL21(DE3)大腸桿菌工程菌高密度發酵所用的培養基的成分為(g/L)KH2PO44，K2HPO44，Na2HPO4·12H2O 7，(NH4)2SO41.2，NH4Cl 0.2，MgSO4·7H2O2.4，酵母抽提物10，葡萄糖10，1ml微量元素溶液。
其中，微量元素溶液的組成如下(mg/L)FeSO4·7H2O 40，CaCl2·2H2O 40，AlCl3·6H2O 10，MnSO4·H2O 10，CoCl2·6H2O 4，Na2MoO4·2H2O 2，ZnSO4·7H2O 2，CuCl2·2H2O 1，H3BO30.5。
pET22b-proAIME/BL21(DE3)大腸桿菌工程菌培養模式采用補料分批培養方式，在5升發酵罐進行發酵實驗。其中，生長期與誘導期培養溫度為37℃，pH值控制在pH6.5-7.0，在培養過程中控制發酵液中溶解氧(DO)大于10％。生長培養4-6h后，加入1mM IPTG，誘導表達3-5h。結果表明在5升發酵罐上的表達量約為2g/L。
實施例6、Western印跡實驗將經實施例3步驟3純化后的proAIM單體和二聚體混合物進行15％SDS-PAGE非還原電泳后，按照如下方法進行Western印跡分析通過電轉移的方法將AIM轉移到PVDF膜上。
將PVDF膜放在一平皿中，加入封閉液，室溫下輕輕振蕩2-3h。
封閉結束后，將PVDF膜浸泡在一抗(人抗Apolipoprotein AI多克隆抗體(Serotec公司))溶液中，4℃下輕輕振蕩2h。
將PVDF膜用PBS洗3次，每次10min。
將膜從PBS中轉入150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl(pH7.5)的溶液中，室溫下輕輕振蕩10min。
將膜浸泡在二抗(HRP標記兔抗綿羊抗體(KPL公司))溶液中，在室溫下輕輕振蕩1h。
取出PVDF膜，用150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl(pH7.5)溶液沖洗3-5次，每次10min。
將膜放入顯色液中，室溫下輕輕搖動。觀察顯色反應，當條帶達到所需深度時，立刻用水洗膜，然后將膜轉入PBS中。
結果如圖5所示，表明本發明的proAIM單體和二聚體都可與人apoA-I多克隆抗體發生免疫反應。圖中，1為蛋白質分子量標準，2為proAIM單體非還原電泳，3為proAIM單體和二聚體混合物非還原電泳，4為proAIM單體的Western印跡，5為proAIM單體和二聚體混合物的Western印跡。
序列表<160>3<210>1<211>747<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1cggcatttct ggcagcaaga tgaacccccc cagagcccct gggatcgagt gaaggacctg 60gccactgtgt acgtggatgt gctcaaagac agcggcagag actatgtgtc ccagtttgaa 120ggctccgcct tgggaaaaca gctaaaccta aagctccttg acaactggga cagcgtgacc 180tccaccttca gcaagctgcg cgaacagctc ggccctgtga cccaggagtt ctgggataac 240ctggaaaagg agacagaggg cctgaggcag gagatgagca aggatctgga ggaggtgaag 300gccaaggtgc agccctacct ggacgacttc cagaagaagt ggcaggagga gatggagctc 360taccgccaga aggtggagcc gctgcgcgca gagctccaag agggcgcgcg ccagaagctg 420cacgagctgc aagagaagct gagcccactg ggcgaggaga tgcgcgaccg cgcgcgcgcc 480catgtggacg cgctgcgcac gcatctggcc ccctacagcg acgagctgcg ccagtgcttg 540gccgcgcgcc ttgaggctct caaggagaac ggcggcgcca gactggccga gtaccacgcc 600aaggccaccg agcatctgag cacgctcagc gagaaggcca agcccgcgct cgaggacctc 660cgccaaggcc tgctgcccgt gctggagagc ttcaaggtca gcttcctgag cgctctcgag 720gagtacacta agaagctcaa cacccag 747<210>2<211>249<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg1 5 10 15
Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly20 25 30Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu35 40 45Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser50 55 60Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn65 70 75 80Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu85 90 95Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys100 105 110Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu115 120 125Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln130 135 140Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala145 150 155 160His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu165 170 175Arg Gln Cys Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly180 185 190Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr195 200 205Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu210 215 220Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu225 230 235 240Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln245
<210>3<211>747<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3agacatttct ggcagcaaga cgagccaccg cagagtcctt gggatcgagt gaaggacctg 60gccactgtgt acgtggatgt gctcaaagac agcggcagag actatgtgtc ccagtttgaa 120ggctccgcct tgggaaaaca gctaaaccta aagctccttg acaactggga cagcgtgacc 180tccaccttca gcaagctgcg cgaacagctc ggccctgtga cccaggagtt ctgggataac 240ctggaaaagg agacagaggg cctgaggcag gagatgagca aggatctgga ggaggtgaag 300gccaaggtgc agccctacct ggacgacttc cagaagaagt ggcaggagga gatggagctc 360taccgccaga aggtggagcc gctgcgcgca gagctccaag agggcgcgcg ccagaagctg 420cacgagctgc aagagaagct gagcccactg ggcgaggaga tgcgcgaccg cgcgcgcgcc 480catgtggacg cgctgcgcac gcatctggcc ccctacagcg acgagctgcg ccagtgcttg 540gccgcgcgcc ttgaggctct caaggagaac ggcggcgcca gactggccga gtaccacgcc 600aaggccaccg agcatctgag cacgctcagc gagaaggcca agcccgcgct cgaggacctc 660cgccaaggcc tgctgcccgt gctggagagc ttcaaggtca gcttcctgag cgctctcgag 720gagtacacta agaagctcaa cacccag 74權利要求
1.人載脂蛋白AI米蘭突變體基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列3的核苷酸序列；2)與序列表中序列3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的重組表達載體、細胞系和工程菌。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體、細胞系和工程菌，其特征在于所述重組表達載體為pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME或pQE30-proAIME。
4.根據權利要求2或3所述的重組表達載體、細胞系和工程菌，其特征在于所述工程菌為pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)或pQE30-proAIME/JM109。
5.一種表達權利要求1所述的人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的方法，是將含有所述人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的重組表達載體導入大腸桿菌中，培養所得到的重組大腸桿菌，表達得到人載脂蛋白AI米蘭突變體。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌為菌株BL21(DE3)、JM109、DH5α或HB101。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于用于構建所述重組表達載的出發載體為pET系列載體、pQE30或pTIG-Trx。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME或pQE30-proAIME。
9.根據權利要求5、6、7或8所述的方法，其特征在于所述重組大腸桿菌在碳源為葡萄糖型碳源、pH為6-7的培養基中37℃培養至對數生長期，然后以0.5-1mM的IPTG誘導表達3-8小時，得到人載脂蛋白AI米蘭突變體。
10.權利要求1所述載脂蛋白AI米蘭突變體基因在生產人載脂蛋白AI米蘭突變體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人載質蛋白AI米蘭突變體基因及其表達方法。本發明所提供的人載質蛋白AI米蘭突變體基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列3的核苷酸序列；2)與序列表中序列3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID No3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。將含有該人載脂蛋白AI米蘭突變體基因的重組表達載體導入大腸桿菌中，培養所得到的重組太腸桿菌，表達得到人載脂蛋白AI米蘭突變體。本發明為proAIM和AIM的功能研究和應用研究奠定了物質基礎。
文檔編號C12N15/70GK1743455SQ20041007366
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月2日 優先權日2004年9月2日
發明者劉志敏, 黎明, 趙洪亮, 薛沖, 張偉, 熊向華 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所