專利名稱：結球甘藍組織培養方法
技術領域：
本發明屬于組織培養，特別是指一種結球甘藍組織培養方法。
背景技術：
結球甘藍種子昂貴，又具有較長的苗齡期，為提高土地利用率，實踐中多采用先育苗然后移栽定植的方法。由于結球甘藍的幼苗為直根系，須根較少，不利于根部對營養物質和水分的吸收，移栽定植后生長緩慢，不耐水澇及根部病害，產量也不高。近年來，隨著農業機械化的快速發展，精量播種、穴盤育苗、移栽機定植已引入結球甘藍栽培，如何消除其上述的栽培缺陷、提高結球甘藍產量，成為人們亟待解決的技術難題。目前，結球甘藍的組織培養技術在甘藍雄性不育系無性快繁、優異稀有種質資源離體繁殖與保存、游離小孢子培養、細胞及原生質體培養中發揮重要的作用，尤其在結球甘 藍組培苗快速繁殖過程中應用居多。但利用目前結球甘藍組織培養常用技術及在現有的結球甘藍組織培養基上長期培養組培苗，容易造成組培苗逐漸衰退、喪失形態發生能力，表現為植株弱小、生長不良、增殖率下降。甚至部分組培苗出現玻璃化現象，嫩莖葉柄葉片出現半透明狀和水潰狀，使試管苗生長緩慢，且因其嫩莖不易誘導生根，使繁殖系數大為降低，玻璃化組培苗莖葉表面無蠟質，體內的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。長期以往不利于結球甘藍組培苗的繼代培養、長期保存及生根移栽利用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種結球甘藍組織培養方法，以達到提高組培苗增殖率和生根率的目的。本發明的整體技術構思是
結球甘藍組織培養方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養將去雜后選出的優質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養基中進行暗培養后制成無菌苗，按照48ml-52ml培養基接種8_10顆種子的接種量接種，培養溫度22°C -26°C，培養濕度70%-80%，培養周期9_12天；
B、誘導培養將暗培養后的無菌苗子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成3.6-4. 2 mm,接種在誘導分化培養基上進行誘導培養，觀察外植體在誘導培養過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養基的組成為
MS+6-BA 2. 0-3. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L，瓊脂 6. 5_7g/L，pH 值=5. 8 ；
誘導培養的培養條件為溫度24°C _26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70%-80%，培養周期25-35天；
C、增殖培養將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml增殖培養基上進行增殖培養制成不定苗，25天繼代I次，連續繼代3次；增殖培養培養基的組成為
MS+6-BA I. 0-2. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L,瓊脂 6. 5_7g/L，pH 值=5. 8 ； 增殖培養的培養條件為溫度24°C _26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70%-80% ；
D、生根培養將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養基上進行生根培養，14天后觀察生根情況；生根培養培養基的組成為
1/2MS+NAA O. 1-0. 2mg/L 或 1/2MS+IBA O. 2-0. 3mg/L,蔗糖 15_20g/L，瓊脂 5. 5_6g/L, pH 值=5. 8 ;
生根培養的培養條件為溫度24°C _26°C，光照強度2200-2500 Lx，光照時間10-12小時/天，培養濕度70%-80% ；
E、再生苗的移植
當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養條件為溫度200C -25 V，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養介質中，濕度為80%-90%，溫度20°C -23°C, 14天后定植于土壤進行正常管理。培養介質選用選用無土材質，一般選用蛭石，也可選用按一定比例復配的沙子、珍珠巖等材質，因其屬于現有技術，申請人再次不再贅述。本發明的具體技術方案還有
步驟A中所述的去雜是將甘藍種子在流水下沖洗，去掉雜質及灰塵。選種的方式可以采用多種技術方案，并不影響本發明的實施，其中優選的技術方案是，步驟A中所述的選出優質結球甘藍種子的步驟為將去雜后的結球甘藍種子浸泡于水中，沉于水底的為優質結球甘藍種子。步驟A中所述的消毒是將選出的優質結球甘藍種子先用質量百分比為70%的酒精浸泡30秒，再用質量百分比為O. 1%的氯化汞消毒8分鐘，然后無菌水沖洗3-4次。為進一步增強培養的效果，優選的技術方案是，步驟A-D中所述的暗培養、誘導培養、增殖培養、生根培養過程中培養室每周在外界空氣質量良好情況下進行3-4小時短時通風。上述短時通風技術手段的采用并不影響本發明的實現。本發明所具備的實質性特點和取得的顯著技術進步在于
經實驗表明，采用本發明的方法在結球甘藍誘導培養基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數3. 8-4. 6 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數少，增殖率高；組培苗生根率可達100%。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據本說明書所作出的等效技術手段替換，均不脫離本發明的保護范圍。實施例I
結球甘藍組織培養方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養將去雜后選出的優質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養基中進行暗培養后制成無菌苗，按照48ml培養基接種8顆種子的接種量接種，培養溫度22°C，培養濕度70%，培養周期9-12天；
B、誘導培養將暗培養后的無菌苗子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成3.6mm,接種在誘導分化培養基上進行誘導培養，觀察外植體在誘導培養過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養基的組成為
MS+6-BA 2. Omg/L，NAA O. lmg/L，蔗糖 25g/L,瓊脂 6. 5g/L, pH 值=5. 8 ;
誘導培養的培養條件為溫度24°C，光照強度lOOOLx，光照時間12小時/天，培養濕度70%，培養周期25-35天；
C、增殖培養將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml增殖培養基上進行增殖培養制成不定苗，25天繼代I次，連續繼代3次；
增殖培養培養基的組成為
MS+6-BA I. Omg/L, NAA O. lmg/L，蔗糖 25g/L,瓊脂 6. 5g/L, pH 值=5. 8 ;
增殖培養的培養條件為溫度24°C，光照強度lOOOLx，光照時間12小時/天，培養濕度
70% ；
D、生根培養將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養基上進行生根培養，14天后觀察生根情況；生根培養培養基的組成為
1/2MS+NAA O. lmg/L 或 1/2MS+IBA O. 2mg/L，蔗糖 15g/L,瓊脂 5. 5g/L, pH 值=5. 8 ;
生根培養的培養條件為溫度24°C，光照強度2200LX，光照時間10小時/天，培養濕度
70% ；
E、再生苗的移植
生根20天左右，當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養條件為溫度20°C，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養介質中，培養介質選用蛭石，濕度為80%，溫度20°C，14天后定植于土壤進行正常管理。實施結果在結球甘藍誘導培養基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數3.8 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數少，增殖率高；組培苗生根率可達
100% O實施例2
結球甘藍組織培養方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養將去雜后選出的優質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養基中進行暗培養后制成無菌苗，按照52ml培養基接種10顆種子的接種量接種，培養溫度26°C，培養濕度80%，培養周期9-12天；
B、誘導培養將無菌苗的子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成4.2 mm,接種在誘導分化培養基上進行誘導培養，觀察外植體在誘導培養過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養基的組成為
MS+6-BA 3. 0mg/L, NAA 0. 2mg/L，蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ;
誘導培養的培養條件為溫度26°C，光照強度2000Lx，光照時間12小時/天，培養濕度80%，培養周期25-35天；
C、增殖培養將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為52ml增殖培養基上進行增殖培養制成不定苗，25天繼代I次，連續繼代3次；
增殖培養培養基的組成為
MS+6-BA 2. Omg/L, NAA O. 2mg/L，蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ;
增殖培養的培養條件為溫度24-26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70-80% ；
D、生根培養將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養基上進行生根培養，14天后觀察生根情況；生根培養培養基的組成為
1/2MS+NAA O. 2mg/L 或 1/2MS+IBA O. 3mg/L,蔗糖 20g/L,瓊脂 6g/L, pH 值=5. 8 ;
生根培養的培養條件為溫度26°C，光照強度2500 Lx，光照時間12 hr/d，培養濕度
80% ；
E、再生苗的移植
當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養條件為溫度25V,3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養介質中，培養介質選用蛭石，濕度為90%，溫度23°C，14天后定植于土壤進行正常管理。其余步驟同實施例I。實施結果在結球甘藍誘導培養基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數4.6 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數少，增殖率高；組培苗生根率可達
100% O實施例3
結球甘藍組織培養方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養將去雜后選出的優質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養基中進行暗培養后制成無菌苗，按照50ml培養基接種8-10顆種子的接種量接種，培養溫度25°C，培養濕度70%-80%，培養周期9-12天；
B、誘導培養將暗培養后的無菌苗的子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成4mm,接種在誘導分化培養基上進行誘導培養，觀察外植體在誘導培養過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養基的組成為
MS+6-BA 2. 5mg/L, NAA O. 15mg/L，蔗糖 28g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ；
誘導培養的培養條件為溫度25°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70%-80%，培養周期30天；
C、增殖培養將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為50ml增殖培養基上進行增殖培養制成不定苗，25天繼代I次，連續繼代3次；
增殖培養培養基的組成為
MS+6-BA I. 5mg/L, NAA O. 2mg/L,蔗糖 28g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ;
增殖培養的培養條件為溫度24-26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70%-80% ；
D、生根培養將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為50ml生根培養基上進行生根培養，14天后觀察生根情況；生根培養培養基的組成為
1/2MS+NAA O. 15 mg/L 或 1/2MS+IBA O. 25 mg/L，蔗糖 18g/L,瓊脂 6g/L，pH 值=5. 8 ;生根培養的培養條件為溫度25°C，光照強度2200-2500 Lx,光照時間10-12小時/天，培養濕度70%-80% ；
E、再生苗的移植
當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養條件為溫度25°C，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養介質中，濕度為80%-90%，溫度20°C -23°C, 14天后定植于土壤進行正常管理。
其余內容同實施例I。實施結果在結球甘藍誘導培養基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數4. 2 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數少，增殖率高；組培苗生根率可達
100% O
權利要求
1.結球甘藍組織培養方法，其特征在于，包括如下工藝步驟 A、無菌苗的培養將去雜后選出的優質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養基中進行暗培養后制成無菌苗，按照48ml-52ml培養基接種8_10顆種子的接種量接種，培養溫度22°C -26°C，培養濕度70%-80%，培養周期9_12天； B、誘導培養將暗培養后的無菌苗子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成3.6-4. 2 mm,接種在誘導分化培養基上進行誘導培養，觀察外植體在誘導培養過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養基的組成為MS+6-BA 2. 0-3. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L，瓊脂 6. 5_7g/L，pH 值=5. 8 ； 誘導培養的培養條件為溫度24°C _26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70%-80%，培養周期25-35天； C、增殖培養將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml增殖培養基上進行增殖培養制成不定苗，25天繼代I次，連續繼代3次； 增殖培養培養基的組成為MS+6-BA I. 0-2. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L,瓊脂 6. 5_7g/L, pH 值=5. 8 ； 增殖培養的培養條件為溫度24V -26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養濕度70%-80% ； D、生根培養將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養基上進行生根培養，14天后觀察生根情況；生根培養培養基的組成為1/2MS+NAA O. 1-0. 2mg/L 或 1/2MS+IBA O. 2-0. 3mg/L，蔗糖 15_20g/L，瓊脂 5. 5_6g/L，pH 值=5. 8 ; 生根培養的培養條件為溫度24V -26°C，光照強度2200-2500LX，光照時間10-12小時/天，培養濕度70%-80% ； E、再生苗的移植 當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，煉苗條件為溫度200C -25 V，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養介質中，濕度為80%-90%，溫度20°C -23°C, 14天后定植于土壤進行正常管理。
2.根據權利要求I所述的結球甘藍組織培養方法，其特征在于，步驟A中所述的去雜是將甘藍種子在流水下沖洗，去掉雜質及灰塵。
3.根據權利要求2所述的結球甘藍組織培養方法，其特征在于，步驟A中所述的選出優質結球甘藍種子的步驟為將去雜后的結球甘藍種子浸泡于水中，沉于水底的為優質結球甘藍種子。
4.根據權利要求2所述的結球甘藍組織培養方法，其特征在于，步驟A中所述的消毒是將選出的優質結球甘藍種子先用質量百分比為70%的酒精浸泡30秒，再用質量百分比為O.1%的氯化汞消毒8分鐘,然后無菌水沖洗3-4次。
5.根據權利要求I所述的結球甘藍組織培養方法，其特征在于，步驟A-D中所述的暗培養、誘導培養、增殖培養、生根培養過程中培養室每周在外界空氣質量良好情況下進行3-4小時短時通風。
全文摘要
本發明屬于組織培養，特別是指一種結球甘藍組織培養方法。包括無菌苗的培養、誘導培養、增殖培養、生根培養、再生苗的移植等工藝步驟，本發明解決了現有技術存在的不利于結球甘藍組培苗的繼代培養、長期保存及生根移栽利用等問題，具有采用本方法在結球甘藍誘導培養基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數3.8-4.6；組培苗生長勢強，玻璃化苗數少，增殖率高；組培苗生根率可達100%等優點。
文檔編號A01H4/00GK102805035SQ20121030836
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者申志彬, 申志恒, 王僧虎, 石曉云 申請人:邢臺市蔬菜種子公司